ATP熒光檢測儀校準(zhǔn)規(guī)范

1ATP熒光檢測儀校準(zhǔn)規(guī)范本規(guī)范適用于手持式和臺式ATP熒光檢測儀的校準(zhǔn)。本規(guī)范引用了下列文件：ASTMD7463-14a燃料、燃料/水混合物、燃料相關(guān)的水中微生物三磷酸腺苷(ATP)含量標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[StandardTestMethodforAdenosineTriphosphate(ATP)ContentofMicroorganismsinFuel,Fuel/WaterMixtures,andFuelAssociatedWater]凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修訂單)適用于本規(guī)范。3術(shù)語和計量單位3.1相對光單位relativelightunit;RLU[ASTMD7463-14a三磷酸腺苷(AdenosineTriphosphate,ATP)水解為一磷酸腺苷(AdenosineMonophosphate,AMP)和焦磷酸鹽釋放化學(xué)能驅(qū)動熒光素在熒光素酶催化下氧化釋放的光量子數(shù)的測量單位。ATP熒光檢測儀(以下簡稱儀器)由檢測倉、控制面板、光電探測器(雪崩二極管或光電倍增管檢測器等)和數(shù)據(jù)采集信號處理系統(tǒng)等組成，并配備有配套的含有熒光素和熒光素酶混合物的拭子或試劑。采集樣本中的ATP后，與熒光素和熒光素酶混合物反應(yīng)，會產(chǎn)生550nm左右的生物發(fā)光。在適當(dāng)?shù)偷腁TP濃度范圍內(nèi)，發(fā)光強度與ATP濃度成一定比例關(guān)系。根據(jù)相對光單位RLU可以推算出樣本被食物殘渣和微生物污染的程度，對總體潔凈度進行監(jiān)測。儀器可分為手持式和臺式。5計量特性5.1背景噪聲值5.3線性范圍及相關(guān)系數(shù)5.4重復(fù)性25.5相對示值誤差6校準(zhǔn)條件6.1環(huán)境條件6.1.1環(huán)境溫度：(15～30)℃。6.1.3超凈工作臺，潔凈等級100級。6.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、檢測拭子或試劑、儀器6.2.1ATP純度有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度≥99%,相對狀展不確定度U≤1%(k=2)。6.2.2ATP檢測拭子或試劑：不同模器配備的專用拭子(手持式)或試劑(臺式),依據(jù)廠家要求在冰箱中(2-8)℃冷藏或一20℃凍藏。在保質(zhì)期肉，臨用前從冰箱中取出放置至少10hn,平衡至室溫。6.2.3高壓求菌水或注射用水：無ATP,為醫(yī)藥級無熱原水。6.2.4移液器；(1～10)μL、(10～100)μL,(100～1000)各1支，經(jīng)檢定合格。6.2.5電子未平：分度值0.01mg,經(jīng)檢定合格6.2.7可調(diào)弱光發(fā)生器：弱無亮度(cd/m2),相對擴展不確定度U≤5%=2),連續(xù)可調(diào)，并前數(shù)字顯示光亮度。7校準(zhǔn)項目和校準(zhǔn)方法7.1背鼻噪聲值在超凈工作合中，用(1～10)μL移液器移取水(6.2.3)10L,滴于拭子的擦拭頭(手持式)上或檢側(cè)池(臺式)中，與熒光素和熒光素酶混合試劑混合反應(yīng)，記錄儀器RLU示值，連線讀取○次，得到儀器背景值。按式(1計算，背景值的平均值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差s,作為儀器的背最噪聲值N7.1.2可調(diào)弱光發(fā)生器模擬法將可調(diào)弱光發(fā)生器的發(fā)光探頭放入儀器的檢測倉中，關(guān)掉光源，記錄儀器RLU示值，連續(xù)讀取10次，得到儀器背景值。按式(1)計算，背景值的平均值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差s,作為儀器的背景噪聲值N。B10次測定的背景值的算術(shù)平均值，RLU;s——10次測定的背景值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，RLU;3B;——第i次測定的背景值，RLU;7.2檢測限在超凈工作臺中，用(1～10)μL移液器移取某濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(按照附錄A配制)10μL,滴于拭子的擦拭頭(手持式)上或檢測池(臺式)中。濃度選取儀器聲稱的ATP檢出限濃度。某濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與熒光素和熒光素酶混合試劑混合反應(yīng)，分別記錄儀器RLU示值。若此濃度下，儀器RLU示值為0,則濃度增加10倍。共進行3個平行測定實驗，取平均值。對于背景噪聲值(ATP法)為0的儀器，由RLU示值大于0的最低濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對應(yīng)的ATP物質(zhì)的量(mol),按式(2)計算，將RLU示值為1時對應(yīng)的ATP物質(zhì)的量作為檢測限。nLop——儀器的檢測限對應(yīng)的ATP物質(zhì)的量，mol;1——檢測限對應(yīng)的RLU示值；nsa——RLU示值大于0的最低濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液i對應(yīng)的ATP物質(zhì)的RLUaa——RLU示值大于0的最低濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液i的儀器示值平均對于式(1)計算的背景噪聲值(ATP法)大于10的儀器，由RLU示值平均值大于背景噪聲值的最低濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其RLU示值平均值與背景噪聲值的比值為該濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的信噪比R,由其對應(yīng)的ATP物質(zhì)的量(mol),按式(3)計算，將信噪比為3時對應(yīng)的ATP物質(zhì)的量作為檢測限。ntop——儀器的檢測限對應(yīng)的ATP物質(zhì)的量，mol;3——檢測限對應(yīng)的信噪比；nga——RLU示值平均值大于背景噪聲值的最低濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液i對應(yīng)R——RLU示值平均值大于背景噪聲值的最低濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液i對應(yīng)RLUsa——RLU示值平均值大于背景噪聲值的最低濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液i的儀7.3線性范圍及相關(guān)系數(shù)4在超凈工作臺中，用(1～10)μL移液器分別移取5個濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各10μL。建議的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(至少做5個點，根據(jù)最低和最高濃度測出的RLU值的大小，可對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度值做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整):對于手持式儀器，為1×10~13mol/mL、1×10-12mol/mL、1×10~l1mol/mL、1×10-1010-°mol/mL;對于臺式儀器(采用光電倍增管檢測器),為1×10-1mol/mL、1×10-“mol/mL、1×10-mol/mL、1×10~12mol/mL和1×10~l1mol/mL。將10μL的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液滴于拭子的擦拭頭上，與熒光素和熒光素酶混合試劑混合反應(yīng)，記錄儀器RLU示值。以ATP物質(zhì)的量(x)和儀器示值RLU(y)繪制校準(zhǔn)曲線，進行線性擬合，得到校準(zhǔn)方程，按式(4)計算相關(guān)系數(shù)r,取r≥0.995的濃度范圍作為線性范圍。若r<0.995時，則去掉最高濃度點，增加0.5倍最高濃度值的檢測點，與余下的濃度點重新繪制校準(zhǔn)曲線；若r≥0.995,則新范圍作為線性范圍。若r仍然<0.995,則繼續(xù)下調(diào)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。7.3.2可調(diào)弱光發(fā)生器模擬法將可調(diào)弱光發(fā)生器的發(fā)光探頭放入儀器的檢測倉中，調(diào)節(jié)發(fā)光亮度。對于手持式儀器，設(shè)定≥7個測試點(如使RLU示值分別為1、10、100、1000、2500、5000和7500左右);對于臺式儀器(光電倍增管檢測器),設(shè)定≥7個測試點(如使RLU示值分別為10、100、1000、5000、10000、100000和1000000左右)。記錄下控制器數(shù)字顯示的對應(yīng)的光亮度(cd/m2)和儀器RLU示值。以儀器RLU示值和光亮度(cd/m2)進行線性擬合，按式(4)計算相關(guān)系數(shù)r,取r≥0.995的光亮度范圍作為線性范圍。若r<0.995時，則去掉高值光亮度點1～2個，取余下的光亮度點，重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，直至r≥0.995,將新范圍作為線性范圍。r——線性相關(guān)系數(shù)；x;——第i個測量點的ATP物質(zhì)的量或可調(diào)弱光發(fā)生器的光亮度，mol或cd/m2;x——用于計算線性范圍的測量點的ATP物質(zhì)的量或可調(diào)弱光發(fā)生器的光亮度的y?——第i個測量點的儀器示值，RLU;y——用于計算線性范圍的測量點的儀器示值的平均值，RLU;n——用于計算線性范圍的測量點的個數(shù)。7.4重復(fù)性在超凈工作臺中，用(1～10)μL移液器移取某濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10μL(移取的ATP物質(zhì)的量是檢出限的100倍，如檢測限為1×10~12mol的儀器，則濃度選1×10-8mol/mL),滴于拭子的擦拭頭上或檢測池中，與熒光素和熒光素酶混合試劑5混合反應(yīng)，記錄下儀器RLU示值。重復(fù)測定10次，以10次實驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD值)表示儀器測量的重復(fù)性。7.4.2可調(diào)弱光發(fā)生器模擬法將可調(diào)弱光發(fā)生器的發(fā)光探頭放入儀器的檢測倉中，調(diào)節(jié)發(fā)光亮度為某數(shù)值(cd/m2),使RLU示值為100左右(手持式)或1000左右(臺式)。重復(fù)測定10次，記錄RLU示值。以10次實驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD值)表示儀器測量的重復(fù)性。按式(5)計算儀器測量的重復(fù)性：RSD——儀器測量的重復(fù)性(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差),%R;——第i次測量的結(jié)果，RLU;R——n次測量結(jié)果的平均值，RLU;7.5線性誤差將7.4.1中10次重復(fù)性測定的某濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的儀器RLU示值的平均值，代入由7.3.1中數(shù)據(jù)得到的校準(zhǔn)方程中，計算得到此ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中ATP含量的測定值。以ATP物質(zhì)的量(x)和儀器示值RLU(y)繪制校準(zhǔn)曲線，進行線性擬合，得到校準(zhǔn)方程。按式(6)計算ATP物質(zhì)的量測量的線性誤差：△X:——ATP物質(zhì)的量測量的線性誤差，%;c;——按照校準(zhǔn)方程計算得到的ATP物質(zhì)的量的測定值，molATP物質(zhì)的量測量的線性誤差校準(zhǔn)不確定度評定示例見附錄B。7.5.2可調(diào)弱光發(fā)生器模擬法將7.4.2中10次重復(fù)性測定的某光亮度下儀器RLU示值的平均值，代入由7.3.2中數(shù)據(jù)得到的校準(zhǔn)方程中，計算得到此RLU示值對應(yīng)的光亮度測定值L;。按式(7)計算光亮度測量的線性誤差：L;——按照校準(zhǔn)方程計算得到的光亮度的測定值，cd/m26光亮度測量的線性誤差校準(zhǔn)不確定度評定示例見附錄C。ATP法推薦的校準(zhǔn)原始記錄格式見附錄D。可調(diào)弱光發(fā)生器模擬法推薦的校準(zhǔn)原始記錄格式見附錄E。經(jīng)校準(zhǔn)的ATP熒光檢測儀，出具校準(zhǔn)證書，校準(zhǔn)證書應(yīng)符合JJF1071—2010中5.12的要求，推薦的校準(zhǔn)證書(內(nèi)頁)格式內(nèi)容見附錄F。由于復(fù)校時間間隔的長短是由儀器的使用情況、使用者、儀器本身質(zhì)量等諸決定的，因此，送校單位可根據(jù)實際使用情況自主決定復(fù)校時間間隔。復(fù)校時間間隔建議不超過1年。7系列ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制A.1.2高壓滅菌水或注射用水，配置ATP溶液前，作為空白用手持式儀器測試，A.2.2移液器：(10～100)μL,(100～1000)μL各1支，經(jīng)檢定合格。精確取ATP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)約8.00mg(精確到0.01mg),置于15mL離心管中，加水(A.1.2)14mL溶解定容，稱量加入的水的質(zhì)量(精確到0.01mg)?；靹?，得到ATP10mL溶解定容，稱量加入的水的質(zhì)量(精確到0.01mg)?；?附錄BATP物質(zhì)的量測量的線性誤差校準(zhǔn)不確定度評定示例B.1測量模型按式(B.1)計算線性誤差：cw——ATP物質(zhì)的量的配制值，mol。式中：x按照校準(zhǔn)方程計算得到的第i點的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的ArP物質(zhì)的測定值moB.2方差和靈敏系數(shù)B.3不確定度分量的計算B.3.1u(x;)分量按式(B.6)計算線性最小二乘法校準(zhǔn)的不確定度：其中，校準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差見式(B.7):9式中：SR校準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差；a——校準(zhǔn)曲線的截距；b——校準(zhǔn)曲線的斜率；m用于測量線性誤差的某濃度ATP溶液的測量次數(shù)，m=10;n——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測量的總次數(shù)，n=4;x;——由校準(zhǔn)方程計算得到的用于測量線性誤差的某濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液中ATPz——不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的AFP物質(zhì)的量的平均值，mol;y;——各濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的儀器示值，RLU。序號j的物質(zhì)的量x,各濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的1234編號由校準(zhǔn)方程求得的樣品溶液中ATP的含量之由校準(zhǔn)方程求得的樣品123456789則用于測量線性誤差的第i點ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的ATP物質(zhì)的量的不確定度。使用十萬分位天平精密稱取標(biāo)準(zhǔn)溶液和稀釋超純水。天平計量證書標(biāo)明其稱量(0.01～5)g和(5~20)g時的示值誤差都為10μg,稱量重復(fù)性(變動性)為40μg。假定均為矩形分布，換算成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為23.8μg。稱量質(zhì)量約8mg,故ATP稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：根據(jù)ATP有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，其標(biāo)稱值為99.7%±0.4%(k=2)。ATP有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：ug(P)=0.4%/2/99.7%=0.ATP分子量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度很小，忽略不計。溶解ATP固體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的水的質(zhì)量m?稱量引入的不確定度為：用多次逐級稀釋樣品引入的不確定度。取ATP標(biāo)準(zhǔn)母液工作溶液100μL,稱量m2,加水10mL溶解定容，稱量總質(zhì)量mg,得到ATP標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。取ATP標(biāo)準(zhǔn)中間溶液100μL,加超純水900μL,混勻，得到ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1。再依此法10倍梯度稀釋6次，得到1×10-15mol/mL的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。用100μL移液器移取100μL溶劑時，容量允差±0.8%的差異，按矩形分布，則u?(V?)=100×0.8%/√3=0.46(多次移取100μL液體體積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.15%,則重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確u?(V?)=100×0.15%=0.15(溫度對體積的影響很小，可忽略。因此，將上述樣品溶液定容體積V的不確定度分量合成，則溶解樣品的水的體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V?)=√0.462+0.152=0.48(V?的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：用1000μL移液器移取900μL溶劑時，容量允差±0.6%的差異，按矩形分布，則標(biāo)u?(V?)=900×0.8%/√3=4.16(多次移取900μL液體體積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%,則重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確u?(V?)=900×0.1%=0.9(溫度對體積的影響很小，可忽略。因此，將上述樣品溶液定容體積V的不確定度分量合成，則溶解樣品的水的體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：u(V?)=√4.162+0.92=4.25(V?的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：將多步稀釋的不確定度分量來源進行合成，得到多次逐級稀釋樣品引入的不確u:a(D)=√usa2(mz)+ura2(m?)+7×ul3(V?)+7×u-a2(V?將以上4個不確定度分量合成，得到測量線性誤差的第i點ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的ATP物質(zhì)的量的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：uya(xg)=√uía(m)+uíg(P)+ug(m?)+ug(M)+ufa(D)=0.018則u(xg)=ug(xg)×x=0.018×100×10~1?mol=1.8×10~1(B.4合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度根據(jù)規(guī)范，選100×10~15molATP樣品溶液的測量線性誤差，所以x為100×10-15mol。由校準(zhǔn)方程計算得到的用于測量線性誤差的某濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液中ATP的物質(zhì)的量α;為100.9×10~15mol。則ue(△X?)=√0.00034=0.B.5擴展標(biāo)準(zhǔn)不確定度在95%的置信概率下取包含因子k=2,將相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子，計算得到ATP含量線性誤差測量結(jié)果的相對擴展標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：U=k·u?(△X?)=0.018×2=附錄C光亮度測量的線性誤差校準(zhǔn)不確定度評定示例C.1測量模型按式(C.1)計算光亮度測量的線性誤差：△X;——光亮度測量的線性誤差，%;L;——按照校準(zhǔn)方程計算得到的光亮度的測定值，cd/m2;△X;——第i點的可調(diào)弱光發(fā)生器光亮度測量的線性誤差，%;x;——按照校準(zhǔn)方程計算得到的第i點的可調(diào)弱光發(fā)生器光亮度的測定值，cd/m2;xg——第i點的可調(diào)弱光發(fā)生器光亮度的設(shè)定值，cd/m2。C.2方差和靈敏系數(shù)C.3不確定度分量的計算C.3.1u(x;)分量按式(C.6)計算線性最小二乘法校準(zhǔn)的不確定度：其中，按式(C.7)計算校準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差：b——校準(zhǔn)曲線的斜率；m——用于測量線性誤差的可調(diào)弱光發(fā)生器某個各校準(zhǔn)用系列標(biāo)準(zhǔn)光亮度的測定結(jié)果見表C.1。序