代謝控制發(fā)酵課件

代謝控制發(fā)酵

緒論第一節(jié)代謝控制發(fā)酵的

研究對(duì)象和任務(wù)

代謝控制發(fā)酵是發(fā)酵生理學(xué)的重要部分，是生物工程的重要專業(yè)基礎(chǔ)課。它是利用遺傳學(xué)或其它生物化學(xué)的方法，人為地在脫氧核糖核酸（DNA）的分子水平上，改變和控制微生物的代謝，使有用的代謝產(chǎn)物大量生成、積累的發(fā)酵技術(shù)。

一、幾個(gè)概念

生理學(xué)（Physiology）工業(yè)微生物（InductrialMicrobiology）微生物生理學(xué)（MicrobiolPhysiology）發(fā)酵生理學(xué)(FermentationPhysiology)發(fā)酵(Fermentation)代謝調(diào)節(jié)控制（調(diào)控）(Metaboliccontrol)代謝控制發(fā)酵(Metaboliccontrolfermentation)生理學(xué)（Physiology）研究生物的功能的科學(xué)。按生物類別分為：人體生理學(xué)、動(dòng)物生理學(xué)、植物生理學(xué)、微生物生理學(xué)等分科。按生理學(xué)研究的觀點(diǎn)和水平分有：比較生理學(xué)、器官生理學(xué)、細(xì)胞生理學(xué)和分子生理學(xué)。

工業(yè)微生物（InductrialMicrobiology）

是指在發(fā)酵工業(yè)上已經(jīng)應(yīng)用或具有潛在應(yīng)用價(jià)值的微生物，它包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌也包括藻類和病毒。其范疇隨科學(xué)技術(shù)的發(fā)展而不斷擴(kuò)大。

微生物生理學(xué)（MicrobiolPhysiology）

是微生物學(xué)的一個(gè)分支，是從生理生化的角度研究微生物細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能以及微生物生命活動(dòng)（及代謝）規(guī)律的學(xué)科。

發(fā)酵生理學(xué)(FermentationPhysiology)

是微生物生理學(xué)和生物工藝學(xué)（發(fā)酵工藝）的交叉分支，它是從生理、生化及發(fā)酵工藝角度研究工業(yè)微生物細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能以及微生物生命活動(dòng)（主要是代謝活動(dòng)）規(guī)律的學(xué)科。

發(fā)酵(fermentation)

（1）早期的概念微生物在無氧時(shí)的代謝進(jìn)程。有機(jī)物是通過另一個(gè)有機(jī)物還原而將自身氧化的生物學(xué)過程，脫氫體和受氫體均是有機(jī)物。（2）利用微生物生長和代謝活動(dòng)生產(chǎn)多種有用物質(zhì)。（3）利用微生物或通過細(xì)胞工程、酶工程、基因工程等獲得的生命體生產(chǎn)各種有用物質(zhì)。代謝調(diào)節(jié)控制（調(diào)控）

是研究生物體內(nèi)生命物質(zhì)相互制約、彼此協(xié)調(diào)及控制規(guī)律的科學(xué)。它的主要內(nèi)容是揭示各類調(diào)節(jié)的分子基礎(chǔ)，并闡明調(diào)節(jié)過程與機(jī)能相聯(lián)系的機(jī)制。代謝控制發(fā)酵(MetabolicControlFermentation)

它是采用分子生物學(xué)、（基因重組技術(shù)）或其它生物化學(xué)的方法，人為地在DNA水平上，改變和控制微生物的特性，使有用的代謝產(chǎn)物生成和積累的發(fā)酵技術(shù)。

二、

代謝控制發(fā)酵的發(fā)展

——代謝工程

（Metabolicengineering)1.代謝工程定義

2.代謝工程研究的內(nèi)容

3.代謝工程研究的任務(wù)

1.代謝工程定義

采用重組DNA技術(shù)和高精度的分析生物學(xué)技術(shù)相關(guān)的遺傳學(xué)方法，進(jìn)行精確目標(biāo)的基因操作，改變微生物原由調(diào)節(jié)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)提高目的代謝活性和目的代謝產(chǎn)物量。2.代謝工程研究的內(nèi)容（1）在微生物體內(nèi)建立新的微生物途徑以獲得新的代謝物（如鏈霉菌的聚乙酮）。（2）生產(chǎn)異源蛋白（如人體胰島素，人血清白蛋白）（3）改變已存在的途徑（如抗生素、工業(yè)酶、氨基酸、有機(jī)酸等的生產(chǎn)）

3.代謝工程研究的任務(wù)

對(duì)已知途徑而言，是了解生物過程環(huán)境變化時(shí)對(duì)代謝流及其分布的影響，確定流向終產(chǎn)物的比例；對(duì)未知途徑而言，是鑒別主要途徑，了解副產(chǎn)物途徑，以便指導(dǎo)遺傳操作來克服微生物自身的遺傳機(jī)制，去除副途徑等。

代謝工程研究的目的

構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)特定目的代謝物或具有過量生產(chǎn)能力的工程菌并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。根據(jù)微生物的不同代謝特征，一般采用：（1）改變代謝流向（2）擴(kuò)展代謝途徑流量（3）構(gòu)建新的代謝途徑第二節(jié)發(fā)酵（工程）的發(fā)展和學(xué)習(xí)本課程的目的要求及參考書

一、發(fā)酵（工程）的發(fā)展沿革

二、研究對(duì)象

三、研究任務(wù)

四、目的要求五、主要參考書年或年代學(xué)科發(fā)展發(fā)酵技術(shù)(生物技術(shù))發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品公元前10-30世紀(jì)

傳統(tǒng)古老的天然發(fā)酵果汁堆放生酒,發(fā)酵原始啤酒、醋、醬、奶酪等1680顯微鏡的發(fā)明天然釀造酒、醋、醬、奶酪等1857證明發(fā)酵是由微生物作用，是酶的作用天然釀造酒、醋、醬、奶酪等1882-1887用固體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)微生物純種發(fā)酵（固體）酵母、酒精、丙酮-丁醇、淀粉酶、大小曲1909-1943青霉素的發(fā)現(xiàn)，鏈霉素的生產(chǎn)深層液體發(fā)酵抗生素、維生素、有機(jī)酸、酶制劑20世紀(jì)40年代生物化學(xué)的發(fā)展，酶化學(xué)的進(jìn)步微生物轉(zhuǎn)換甾族化合物（可的松等多種固醇類激素）20世紀(jì)50年代生物化學(xué)的發(fā)展，微生物遺傳學(xué)的進(jìn)步發(fā)酵的代謝調(diào)節(jié)氨基酸、核苷酸發(fā)酵20世紀(jì)60年代石油微生物的研究應(yīng)用發(fā)酵原料的更換（石油發(fā)酵）石油蛋白及其它利用正烷烴和石油化工產(chǎn)品的發(fā)酵生產(chǎn)20世紀(jì)70年代微生物學(xué)及微生物遺傳學(xué)的發(fā)展生物工程的發(fā)展利用固定化細(xì)胞（酶）進(jìn)行發(fā)酵或制成生物傳感器；利用細(xì)胞融合和基因重組技術(shù)進(jìn)行育種，選育工程菌20世紀(jì)80年代微生物學(xué)的深入和應(yīng)用蛋白質(zhì)工程與新的代謝工程的發(fā)展利用定位突變技術(shù)和代謝調(diào)控原理，構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)新的產(chǎn)品20世紀(jì)90年代學(xué)科交叉滲透，計(jì)算機(jī)廣泛應(yīng)用進(jìn)入計(jì)算機(jī)自控的現(xiàn)代發(fā)酵工程氨基酸、核苷酸、生理活性物質(zhì)、新藥等一、發(fā)酵（工程）的發(fā)展沿革二、研究對(duì)象

研究的主要對(duì)象是為人類生產(chǎn)大量的抗生素、酶、氨基酸、有機(jī)酸、溶劑、醇類、多糖、維生素、蛋白質(zhì)、生理活性物質(zhì)、色素等有用產(chǎn)物的工業(yè)微生物及培養(yǎng)技術(shù)，主要是細(xì)菌、放線菌、酵母、霉菌等，當(dāng)然現(xiàn)在又?jǐn)U大到藻類、病毒、植物、動(dòng)物等的培養(yǎng)技術(shù)。三、研究任務(wù)及內(nèi)容

主要研究的微生物的生長、繁殖、發(fā)育、分化、代謝等生命活動(dòng)的規(guī)律，以及和周圍環(huán)境之間關(guān)系，從而控制工業(yè)微生物的生命活動(dòng)（代謝途徑），為提高發(fā)酵過程的生產(chǎn)、效率和創(chuàng)立新的發(fā)酵過程奠定理論基礎(chǔ)。本課程講授的主要內(nèi)容：

1.微生物代謝

2.微生物代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的分子基礎(chǔ)

3.微生物代謝調(diào)節(jié)的模式

4.代謝調(diào)控理論在工業(yè)發(fā)酵上的應(yīng)用——代謝控制發(fā)酵的實(shí)例四、目的要求

代謝控制發(fā)酵（微生物代謝調(diào)控學(xué)）是在微生物、微生物生理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)基礎(chǔ)上開設(shè)的一門專業(yè)必（限）修課，它是復(fù)習(xí)鞏固微生物、生物化學(xué)所學(xué)過的知識(shí)，加于深化提高。著重從代謝及代謝控制理論出發(fā)，有目的、人為地改造控制微生物的發(fā)酵過程，達(dá)到提高發(fā)酵水平和質(zhì)量之目的。要求學(xué)生通過本課程學(xué)習(xí)，會(huì)靈活、巧妙地應(yīng)用微生物生理及代謝控制的理論，去定向選育或改造原有菌種，選育優(yōu)良性狀微生物的科學(xué)思維的能力。具體要求，若選了這門課，希望能堅(jiān)持下來，認(rèn)真聽課作好筆記，認(rèn)真完成作業(yè)。主要參考書：1.張克旭等《代謝控制發(fā)酵》中國輕工業(yè)出版社19982.儲(chǔ)炬等《現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵調(diào)控學(xué)》化學(xué)工業(yè)出版社20023.李季倫《微生物生理學(xué)》北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社19934.朱玉賢《現(xiàn)代分子生物學(xué)》高等教育出版社19975.孫乃思等《分子遺傳學(xué)》南京大學(xué)出版社19906.沈萍等《微生物學(xué)》高等教育出版社19997.陶文沂等《工業(yè)微生物生理與遺傳育種學(xué)》中國輕工業(yè)出版社1996

代謝控制發(fā)酵的基本思想——（微生物代謝的人工控制）

微生物在正常情況下，通過細(xì)胞內(nèi)自我調(diào)節(jié)，維持各個(gè)代謝途徑的相互協(xié)調(diào)，使其代謝產(chǎn)物既不少又不會(huì)過多的積累，而人類利用微生物進(jìn)行發(fā)酵則需要微生物積累較多的代謝產(chǎn)物，為此對(duì)微生物的代謝必須進(jìn)行人工控制

。

人工控制微生物代謝的方法主要有兩種：一、改變微生物的遺傳特征二、控制發(fā)酵條件第一節(jié)

微生物生物合成途徑的遺傳控制圖3-1谷氨酸棒桿菌鳥氨酸生物合成途徑①乙酰谷氨酸合成酶②乙酰谷氨酸激酶③NO乙酰谷氨酸醛脫氫酶④乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶⑤NO乙酰谷氨酸O乙酰鳥氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶⑥鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶⑦精氨琥珀酸合成酶⑧精氨琥珀酸酶Arg對(duì)N-乙酰谷氨酸合成酶和N-乙酰谷氨酸激酶有反饋調(diào)節(jié)作用。當(dāng)選育瓜氨酸缺陷突變株（Cit-

），亞適量添加瓜氨酸（Cit

），就會(huì)積累大量的鳥氨酸。2、分支途徑

（1）

例如：谷氨酸棒桿菌、產(chǎn)氨短桿菌、黃色短桿菌的選育高絲氨酸脫氫酶缺陷型（hom-）來積累大量Lys。

二、選育抗反饋調(diào)節(jié)突變株

所謂抗反饋調(diào)節(jié)突變株就是已解除了反饋調(diào)節(jié)作用的突變株

。在這些突變株中，因?yàn)榉答佉种苹蜃瓒?，或兩者引起的自?dòng)調(diào)節(jié)作用已被削弱或解除，所以能合成較多的最終產(chǎn)物。

（一）選育抗代謝類似物的突變株（AnalogueResistanceMutant）

通常微生物生長需要各種代謝物。如維生素、嘌呤、氨基酸等。在正常情況下，代謝終產(chǎn)物如氨基酸A過量存在時(shí)，就會(huì)抑制或阻遏它自身生物合成酶。同時(shí)也能整合到蛋白質(zhì)中去。只有當(dāng)氨基酸A濃度足夠高時(shí)，A與調(diào)節(jié)酶的調(diào)節(jié)部位或調(diào)節(jié)基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合，產(chǎn)生反饋抑制或阻遏作用。當(dāng)細(xì)胞中的A參與蛋白質(zhì)合成，而使細(xì)胞中A的濃度下降到一定程度時(shí)，A就會(huì)從調(diào)節(jié)酶的調(diào)節(jié)部位或阻遏蛋白上脫落下來，從而解除反饋調(diào)節(jié)，又重新可以合成新的A。當(dāng)A的濃度再次上升到一定值時(shí)，反饋調(diào)節(jié)再次發(fā)生…….。

我們說代謝物和調(diào)節(jié)酶的變構(gòu)部位或阻遏蛋白的結(jié)合是可逆的。而代謝類似物，結(jié)構(gòu)類似物，即A′則不同，在培養(yǎng)基中添加A′其空間結(jié)構(gòu)與A相似。當(dāng)細(xì)胞中大量存在A′時(shí)，它也能和A一樣與調(diào)節(jié)酶的調(diào)節(jié)部位或調(diào)節(jié)基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合，發(fā)生反饋抑制與阻遏作用。由于A′不能整合到蛋白質(zhì)分子中去，細(xì)胞中的A′濃度不會(huì)自行下降。只要A′結(jié)合到調(diào)節(jié)酶的調(diào)節(jié)部位或阻遏蛋白上就不能脫落下來，這種結(jié)合是不可逆的。這樣也就沒有A的生物合成，氨基酸缺乏的細(xì)胞會(huì)因饑餓而死亡。因此代謝結(jié)構(gòu)類似物對(duì)微生物細(xì)胞來說是有毒的，只要有結(jié)構(gòu)類似物存在，菌種不會(huì)存活。

若我們通過誘導(dǎo)等手段獲得突變株，已解除了終產(chǎn)物對(duì)酶的反饋調(diào)節(jié)，也就是說終產(chǎn)物A不再與調(diào)節(jié)酶的調(diào)節(jié)部位或阻遏蛋白結(jié)合。那么A的結(jié)構(gòu)類似物A′也同樣不再與調(diào)節(jié)酶的調(diào)節(jié)部位或胞質(zhì)阻遏蛋白結(jié)合，也就是A′對(duì)菌株的毒害作用表現(xiàn)不出來，我們就說該菌株對(duì)A′有抗性。（resistance）我們常常將經(jīng)過各種手段誘變的突變株放到含有終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物A′的培養(yǎng)基上，挑出長出來的抗性菌株。若突變株抗A′性能越強(qiáng)（在含高濃度A′上長出來），則說明該菌株解除A對(duì)其生物合成系統(tǒng)的反饋調(diào)節(jié)就越徹底，那么A積累就越多。

根據(jù)上述原理，只要選取結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，就有可能得到解除反饋抑制或阻遏的突變株。在這個(gè)意義上結(jié)構(gòu)類似物抗性可以作為解除反饋調(diào)節(jié)菌株的“篩子”。除了氨基酸外還有嘌呤、嘧啶、維生素等的結(jié)構(gòu)類似物。通過選育這些結(jié)構(gòu)類似物菌株

，已獲得氨基酸、核苷酸、核苷、維生素等各種代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株。

（二）從營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株中獲得對(duì)途徑中調(diào)節(jié)酶解除反饋抑制的突變株

調(diào)節(jié)酶的變構(gòu)特性是由它的結(jié)構(gòu)基因決定的，若調(diào)節(jié)酶因編碼它的基因發(fā)生突變而失活，則有兩種可能：

1、是編碼為催化亞基與調(diào)節(jié)亞基的基因發(fā)生了變化。

2、僅僅是編碼催化亞基（或活性部位）的基因發(fā)生變化。

若通過再次突變，使調(diào)節(jié)酶的活性恢復(fù)，這時(shí)又有兩種可能：一是催化亞基和調(diào)節(jié)亞基恢復(fù)（或大體恢復(fù)）到第一次突變前那樣的狀態(tài)。另一種是催化亞基得到恢復(fù)，而調(diào)節(jié)亞基卻喪失了調(diào)節(jié)作用，這情況實(shí)質(zhì)上是編碼調(diào)節(jié)亞基的DNA突變，解除了反饋抑制作用。調(diào)節(jié)酶的失活與否，可能直接表現(xiàn)為某種營養(yǎng)缺陷型?？梢圆捎脿I養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變的方法，從營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株中獲得對(duì)途徑中的調(diào)節(jié)酶解除反饋調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)突變株。

三、產(chǎn)物降解酶缺失突變株

為了使產(chǎn)物在發(fā)酵液中穩(wěn)定地存在，以提高發(fā)酵單位，可通過誘變獲得缺乏降解產(chǎn)物酶的突變株，其方法是誘變處理后，如圖所示：

四、增加前體物的合成

通過選育某些營養(yǎng)缺陷型或結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株以及克隆某些關(guān)鍵酶的方法，增加目的產(chǎn)物的前體合成，有利于目的產(chǎn)物的大量積累。

五、細(xì)胞膜組分缺失突變株

第二節(jié)

生物發(fā)酵條件的控制（外因）

當(dāng)菌株選育確定后，環(huán)境條件合適與否是發(fā)酵成敗的重要因素。環(huán)境條件既影響微生物生長，又影響代謝速度和方向及產(chǎn)物形成與積累?，F(xiàn)以谷氨酸棒桿菌（corynebacteriumglutamicacid）發(fā)酵為例來說明控制發(fā)酵條件包括O2濃度、NH4濃度、pH、磷酸鹽濃度、生物素濃度等，環(huán)境條件改變，可使代謝轉(zhuǎn)換方向，不生成Glu，而生成乳酸、a-KGA、琥珀酸、谷酰胺等產(chǎn)物。

表3-1環(huán)境因素對(duì)Glu產(chǎn)生菌

發(fā)酵的影響

第三節(jié)

代謝控制發(fā)酵實(shí)例一、丙酮酸的代謝控制發(fā)酵（一）丙酮酸用途及生產(chǎn)狀況丙酮酸（pyruvicacid）又稱a-氧代丙酸，a-酮基丙酸或乙?；姿?，為無色至淡黃色液體，呈醋酸香氣和愉快酸味，是最重要的a-氧代羥酸之一。丙酮酸不僅在生物能量代謝中具有十分重要的作用，而且是多種有用化合物的前體。例如：治療帕金森病的正多巴和L-半脫氫酸L-Leu、B6和B12的前體，也是合成氫化阿托酸，谷物保護(hù)劑等多種農(nóng)藥的前體，因此在化工、制藥和農(nóng)用化學(xué)品等工業(yè)及科學(xué)研究中有廣泛用途。

作為一種化工產(chǎn)品，丙酮酸早已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但是直到20世紀(jì)90年代工業(yè)上生產(chǎn)丙酮酸還沿用HowardFraeer（1932）開發(fā)的酒石酸脫水脫羥法，沒有多大改進(jìn)，此法是將酒石酸+硫酸氫鉀混合在220℃下蒸餾，餾出物再經(jīng)真空精餾即可得丙酮酸，工藝簡單易行。其主要缺點(diǎn)（1）丙酮酸產(chǎn)率較低（為酒石酒量的29～30%）。（2）得到1g丙酮酸需消耗5g硫酸氫鉀，以目前(酒石酸1.5萬元/噸,硫酸氫鉀0.6萬元/噸)市場價(jià)計(jì)算,僅原料成本至少需8萬元/噸,為此在很長一段時(shí)間內(nèi),丙酮酸的價(jià)格居高不下,限制其推廣應(yīng)用。1995年國外一些研究機(jī)構(gòu)發(fā)表丙酮酸鈣在減肥保健上具有獨(dú)特療效的報(bào)道后，國外（主要是美國）對(duì)丙酮酸鈣的需求量激活，刺激國內(nèi)一些化工廠一擁而上，一時(shí)間國內(nèi)丙酮酸（化學(xué)法）的生產(chǎn)能力達(dá)2000噸/年左右,丙酮酸及其鹽的市場價(jià)由當(dāng)時(shí)28萬元/噸降低到9萬元/噸。如何解決丙酮酸的市場需求不斷擴(kuò)大，但其價(jià)格又無法進(jìn)一步下降這一矛盾呢？顯然開發(fā)成本更低的丙酮酸生產(chǎn)技術(shù)，即采用直接發(fā)酵或生物轉(zhuǎn)化法是解決此問題的根本出路。

盡管一些微生物能夠積累丙酮酸，但其產(chǎn)量無法達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)要求而選育高產(chǎn)丙酮酸菌株十分困難，發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸真正取得突破是1988年，日本東麗工業(yè)株式會(huì)社的研究人員宮田令子和米原撤選育出一系列丙酮酸產(chǎn)量超過50g/mL的球擬酵母菌株，使得發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的工業(yè)化成為可能。1989年實(shí)現(xiàn)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，其產(chǎn)酸率最高達(dá)67.8g/L。1992年日本開始采用發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸產(chǎn)量為400噸/年,售價(jià)為4000日元/Kg。

（二）酵母代謝控制發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸

Ⅰ、丙酮酸脫羧酶（PDC）；Ⅱ、丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（PT）；Ⅲ、丙酮酸羧化酶（PC）；Ⅳ、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（PDH）。NA和B1是丙酮酸脫氫酶系（PDH）的輔因子Bio是丙酮酸羧化酶（PC）的輔因子B6是丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（PT）的輔因子B1是丙酮酸脫羧酶（PDC）輔助因子二、D-核糖代謝控制發(fā)酵（一）D-核糖發(fā)酵機(jī)制

（二）D-核糖發(fā)酵的代謝控制育種

1、出發(fā)菌株選擇芽孢桿菌屬的細(xì)菌轉(zhuǎn)酮酸缺陷突變株積累D-核糖具有普遍性。而Ecoli屬傷寒沙門氏等細(xì)菌的轉(zhuǎn)酮酸缺陷突變株并不積累核糖，都采用芽孢桿菌屬細(xì)菌。2、轉(zhuǎn)酮酶缺陷突變株的分離（選育）（1）選育不利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖的突變株，因?yàn)镈-葡萄糖酸和L-阿拉伯糖必須通過磷酸戌糖途徑進(jìn)行代謝，若轉(zhuǎn)酮酶發(fā)生缺陷，那樣菌體自然也就不能利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖。（2）選育莽草酸缺陷突變株（3）選育L-色氨酸-、L-酪氨酸-、L-phe-、CoQ-、Vk-或葉酸缺陷突變、莽草酸缺陷、4-赤蘚糖合成受阻、轉(zhuǎn)酮酶-、轉(zhuǎn)醛酶-。3、其它標(biāo)記

在維持轉(zhuǎn)酮酶缺陷的情況下，進(jìn)一步誘變使菌體帶上具有高葡萄糖脫氫酶活性和喪失孢子形成能力，可使D-核糖大量積累。葡萄糖脫氫酶是芽孢桿菌屬序細(xì)菌的孢子所特有的酶，該酶由于NAD、NADP和NADH2、NADPH2會(huì)發(fā)生分子型的變換，結(jié)果在菌體對(duì)生長期被誘導(dǎo)，導(dǎo)致D-核糖大量積累，若生孢子D-核糖減少。4、利用基因工程

日本巖木盾等人首先將枯草桿菌染色體DNA中的轉(zhuǎn)酮酶基因克隆到載體質(zhì)粒PUB110中，然后將氯霉素?；D(zhuǎn)移酶基因插入到轉(zhuǎn)酮酶基因之中，造成轉(zhuǎn)酮酶基因的不可逆失活。經(jīng)限制性內(nèi)切酶Smal切后得到線狀重組質(zhì)粒，將該線狀重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草桿菌宿主菌中，構(gòu)建轉(zhuǎn)酮酶失活的D-核糖工程菌株。其核糖產(chǎn)量達(dá)52g/L。小林等人將葡萄糖脫氫酶基因克隆到載體質(zhì)粒PHY300PLK中，然后轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中去。構(gòu)建擴(kuò)增葡萄糖脫氫酶的D-核糖工程菌，350C發(fā)酵80h可積累49g/LD-核糖。

5、發(fā)酵控制

發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源：葡萄糖、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、麥芽糖、乳糖、甘油、糊精、可溶性淀粉等。氮源：干酵母、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、（NH4）2SO4、CaCO3。要在好氣條件下，pH中性，溫度370C

。

三、r-亞麻酸代謝控制發(fā)酵

（一）絲狀真菌利用葡萄糖生物合成

r-亞麻酸的代謝途徑(二)高產(chǎn)r-亞麻酸菌株的選育思路圖3-9高產(chǎn)r-亞麻酸菌株的選育思路1、出發(fā)菌株

多采用被孢霉（Mortierella）毛霉（Mucor）紅酵母（Rhodotorula）小克銀漢霉（Cunninghamella）等產(chǎn)油脂高的真菌作出發(fā)菌株。2、切斷或減弱支路代a-亞麻酸-、花生四烯酸-、二十碳五烯酸-花生四烯酸L、二十碳五烯酸L3、解除反饋調(diào)節(jié)選育脂肪酸結(jié)構(gòu)類似物，如（LTBr），耐高濃度的r-亞麻酸突變株。

4、強(qiáng)化能量代謝提高菌體細(xì)胞內(nèi)ATP的水平有利于脂肪酸合成。選育呼吸抑制劑（丙二酸、氰化鉀、亞伸酸等）抗性突變株。選育ADP磷酸化抑制劑（羥胺、2.4二硝基酚等）抗性突變株。選育抑制能量代謝的抗生素(寡霉素、結(jié)元氨霉素、制霉素)抗性突變株。5、增加前體

菌體生物合成γ-亞麻酸與HMP、EMP途徑直接相關(guān)。增加HMP途徑，NADPH的數(shù)量增多，有利于γ-亞麻酸產(chǎn)量的提高。過量的磷酸鹽或通氣不足會(huì)使EMP途徑增強(qiáng)。而產(chǎn)生NADPH的HMP途徑受阻，導(dǎo)致不飽和脂肪酸的合成降低。通過選育單氟乙酸敏感、碘乙酸敏感、萘啶酮酸敏感突變株，均有助于γ-亞麻酸產(chǎn)量的提高。另據(jù)報(bào)道，選育異檸檬酸脫氫酶滲漏突變殊，也有利于γ-亞麻酸產(chǎn)量的提高。

6、選育△-6脫氫酶活力強(qiáng)的突變株

△-6脫氫酶是生物合成r-亞麻酸關(guān)鍵酶之一。其活性高低直接與r-亞麻酸含量的高低密切有關(guān)，可采用選育呼吸缺陷型相反的方法，即呼吸增強(qiáng)型，通過誘變后菌株涂在含有TTC的一種無色的氧化還原劑的生長培養(yǎng)基上，若△-6脫氫酶強(qiáng)，即可將TTC還原成紅色的物質(zhì)，紅色越強(qiáng)，表明菌體細(xì)胞內(nèi)△-6脫氫酶越強(qiáng)，r-亞麻酸的積累量也就越多。

7．選育低溫生長突變株細(xì)胞膜是重要的微生物細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成。脂質(zhì)分子中不飽和脂肪酸的含量越高，其在低溫條件下細(xì)胞膜的沉動(dòng)性也就越大，即微生物細(xì)胞生長的溫度就越低。據(jù)報(bào)道，選育在相對(duì)低溫(15℃)條件下生長良好的突變抹，結(jié)果其γ-亞麻酸的產(chǎn)量提高了1.4倍。

8．選育耐高糖的突變株在代謝控制發(fā)酵中，常采用耐高滲透壓突變株。γ-亞麻酸發(fā)酵與培養(yǎng)基中糖濃度有密切關(guān)系，在一定范圍內(nèi)，γ-亞麻酸的產(chǎn)墜隨糖濃度的增加而增加，但糖濃度過高就會(huì)抑制菌體生長。降低產(chǎn)物的積累。因此，通過選育耐高糖的突變抹?？墒咕w高效率地利用葡萄糖，從而提高γ-亞麻酸的產(chǎn)量。四、檸檬酸代謝控制發(fā)酵

2001年以來世界檸檬酸的產(chǎn)量為100萬噸左右，2004年我國檸檬酸產(chǎn)量達(dá)45萬噸，其中80%出口，已經(jīng)成為世界檸檬酸生產(chǎn)和銷售大國。我國檸檬酸發(fā)酵水平：薯干粉產(chǎn)酸12%，發(fā)酵周期64h，轉(zhuǎn)化率95%；玉米粉液化液產(chǎn)酸15%，發(fā)酵周期54～64h，轉(zhuǎn)化率95%以上。(一)黑曲霉生物合成檸檬酸有機(jī)酸及多元醇途徑1、葡萄糖氧化酶2、內(nèi)酯酶3、己糖激酶或葡萄糖激酶4、P-葡萄糖異構(gòu)酶

5、果糖運(yùn)輸6、己糖7、1-P-甘露（糖）醇脫氫酶8、1-磷酸甘露（糖）醇磷酸（酯）酶9、甘露（糖）醇運(yùn)輸10、磷酸果糖激酶11、醛縮酶12、丙糖-P異構(gòu)酶13、3-P甘油醛脫氫酶14、丙酮酸激酶15、丙酮酸羧化酶16、草酰乙酸水解酶17、草酸運(yùn)輸18檸檬酸運(yùn)輸19、蘋果酸脫氫酶20、三羧酸載體21、檸檬酸合成酶22、丙酮酸脫氫酶系1、葡萄糖化酶是胞外酶，直接受環(huán)境pH的影響。當(dāng)pH＜3.5時(shí),此酶失活,當(dāng)一旦檸檬酸積累使pH降至1.8,從而導(dǎo)致葡萄糖氧化酶失活。2、草酸是由草酰乙酸水解酶的催化生成的，該酶是細(xì)胞質(zhì)酶，草酰乙酸水解酶的生物合成也受外界pH值調(diào)節(jié)，盡管其調(diào)節(jié)機(jī)制現(xiàn)還沒有搞清楚，但是研究表明誘導(dǎo)此酶的最適pH值為5～6，而當(dāng)pH為2時(shí)，僅觀察到非常低的酶活性。過去采用糖蜜，孢子接種發(fā)酵pH太低，不利于b孢子萌發(fā)，一般發(fā)酵前期控制pH5～6，因此存在少量的葡萄糖或草酸，現(xiàn)在我國采用淀粉質(zhì)原料的液化液，并采用菌絲大接種量接種，再加上我國的黑曲霉產(chǎn)的糖化酶是耐酸的，因此當(dāng)黑曲霉大量繁殖后，就產(chǎn)生檸檬酸，發(fā)酵液的pH是較低的。

3、多元醇（甘露醇、赤蘚醇、丙三醇〈甘油〉）是由糖生成的，一旦糖類底物被耗盡，它們就會(huì)遭到再次分解，因此只要糖類底物最終能全部消耗多元醇就不可能是影響檸檬酸最終產(chǎn)量的主要因素。綜上所述高產(chǎn)Aspnger檸檬酸產(chǎn)生菌應(yīng)該在發(fā)酵中只生成檸檬酸。事實(shí)上，經(jīng)天津工微所的研究表明，控制好發(fā)酵條件，我國檸檬酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵液經(jīng)低層析，只有一個(gè)檸檬酸斑點(diǎn)。

（二）黑曲霉生物合成檸檬酸機(jī)制

五、賴氨酸代謝控制發(fā)酵（一）賴氨酸生物合成途徑及調(diào)節(jié)機(jī)制微生物合成Lys的途徑主要有兩種：1.在霉菌和酵母中的L-賴氨酸是經(jīng)α-氨基己二酸途徑：釀酒酵母：同型檸檬酸合成酶存在兩種同功酶（HSⅠ，HSⅡ），它們都受Lys相同程度的反饋抑制，HSⅠ較易受L-Lys阻遏。薄膜假絲酵母：同型檸檬酸合成酶也存在兩種同功酶，但只有HSⅡ受Lys反饋抑制。解脂復(fù)膜孢酵母：沒有發(fā)現(xiàn)同工酶，其HS強(qiáng)烈受Lys反饋抑制。產(chǎn)黃青霉菌：同型檸檬酸合成酶受Lys和青霉素G的協(xié)同反饋抑制。

2、在細(xì)菌、藍(lán)、綠藻中存在另一條重要的途徑。是以天冬氨酸為起點(diǎn)，經(jīng)二氨基庚二酸（DAP）生物合成L-Lys，稱為天冬氨酸途徑，亦稱α-ε-二氨基庚二酸途徑。

E.coli和黃色短桿菌，（谷氨酸棒桿菌等Glu產(chǎn)生菌）是研究較為深入的兩類細(xì)菌，具有一定的代表性。在大腸桿菌合成Lys的天冬氨酸途徑中，含有三種ASP激酶（AK）同功酶和兩種高絲氨酸脫氫酶（HD）同功酶，每個(gè)同功酶受不同終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)，而且每個(gè)分支途徑后的初始酶分別受各自產(chǎn)物的反饋抑制。如Lys分支途徑第一個(gè)酶和第二個(gè)酶（二氫吡啶二羧酸合成酶與二氫吡啶二羧酸還原酶）受Lys的反饋抑制等。然后在黃色短桿菌，谷氨酸棒桿菌，乳糖發(fā)酵短桿菌等Glu生產(chǎn)菌中的關(guān)鍵酶AK卻都是單一的，該酶受Thr+Lys的協(xié)同反饋抑制。此外還有以下與大腸桿菌不同：

(1)沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)ASP激酶（AK）或天冬氨酸半醛脫氫酶的反饋?zhàn)瓒簟?/p>

(2)Lys分支途徑的第一個(gè)酶和第二個(gè)酶（二氫吡啶二羧酸合成酶與二氫吡啶二羧酸還原酶）既不受Lys的反饋抑制，也不受Lys的阻遏，這對(duì)Lys的積累十分有益。（3）未發(fā)現(xiàn)Lys脫羧酶，有利于生產(chǎn)Lys

綜上所述可以采用黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、北京棒桿菌等Glu產(chǎn)生菌選為出發(fā)菌株進(jìn)行誘變或DNA重組技術(shù)選育高產(chǎn)Lys菌株。若采用DNA重組技術(shù)，因E.coli遺傳背景研究較清楚，可以將產(chǎn)Lys的關(guān)鍵酶基因克隆到E.coli中，讓其表達(dá)。(二)谷氨酸產(chǎn)生菌的賴氨酸生物合成調(diào)節(jié)機(jī)制圖3-13乳糖發(fā)酵短桿菌賴氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制1、丙酮酸羧化酶2、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶3、天冬氨酸激酶4、DDP合成酶5、DDP還原酶6、高絲氨酸脫氫酶7、高絲氨酸激酶8、琥珀酰高絲氨酸合成酶9、蘇氨酸脫氨酶1、優(yōu)先合成：Met比Thr、Lys優(yōu)先合成，Thr比Lys優(yōu)先合成，HD酶活為PS酶活的15倍。2、AK受Thr+Lys協(xié)同反饋抑制3、Lys和Leu代謝互鎖，PS受Leu阻遏4、乙酰CoA和取平衡合成5、Glu優(yōu)于Asp合成(三)高產(chǎn)Lys菌株的育種思路（四）采用細(xì)胞工程和基因工程選育高產(chǎn)Lys菌株1.細(xì)胞融合選育高產(chǎn)Lys菌株高產(chǎn)乙醇的酵母菌的選育思路

——呼吸缺陷型突變株的篩選

如果你分離到一株啤酒酵母，其生長速度是已知生產(chǎn)菌株的二倍，因此你將其用于生產(chǎn)酒精的試驗(yàn)，但結(jié)果表明，該酵母株發(fā)酵葡萄糖的產(chǎn)物是酒精和其它產(chǎn)物的混合物，并且酒精產(chǎn)量只有現(xiàn)在生產(chǎn)菌株的50%。請(qǐng)你寫出如何改造你新分離的酵母菌株，使其優(yōu)于現(xiàn)有的生產(chǎn)菌株的方案。呼吸抑制發(fā)酵：在低糖0.2%酵母比生長速率0.1/h時(shí)，還是進(jìn)行呼吸和生長的，而使其生長速率大大提高，因此可以篩選呼吸缺陷型突變株。

微生物代謝途徑的調(diào)節(jié)模式

前邊我們較詳細(xì)地介紹代謝調(diào)節(jié)的機(jī)制，酶的合成和酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制，同時(shí)還介紹了化能異養(yǎng)微生物對(duì)有機(jī)化合物分解代謝和合成代謝的途徑，微生物是怎樣調(diào)節(jié)這些代謝途徑的？有那種調(diào)節(jié)模式？第一節(jié)反饋抑制和阻遏（feedbackinhibition，feedbackrepression）

一、反饋抑制和阻遏的概念在微生物細(xì)胞中，初級(jí)代謝產(chǎn)物的水平，也就是分解代謝和合成代謝的途徑主要受反饋控制體系的調(diào)節(jié)，主要有反饋抑制和反饋?zhàn)瓒?。反饋抑制（feedbackinhibition）：是指代謝途徑的終產(chǎn)物對(duì)催化該途徑中的一個(gè)反應(yīng)（通常是第一個(gè)反應(yīng)）的酶活力的抑制，其實(shí)質(zhì)是終產(chǎn)物結(jié)合到酶的變構(gòu)部位，從而干擾酶和它底物的結(jié)合，當(dāng)然與此相反為酶活性的激活。反饋?zhàn)瓒簦╢eedbackrepression）：是指終產(chǎn)物（或終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似物）阻止催化該途徑的一個(gè)或幾個(gè)反應(yīng)中的一個(gè)或幾個(gè)酶的合成，其實(shí)質(zhì)是調(diào)節(jié)基因的作用，這是微生物不通過基因突變而適應(yīng)于環(huán)境改變的一種措施，當(dāng)然與此相反有酶合成的誘導(dǎo)。二、反饋抑制與反饋?zhàn)瓒舻谋容^反饋抑制或激活，不涉及到蛋白質(zhì)（酶）合成過程，比較直接而快、當(dāng)終產(chǎn)物濃度或底物濃度達(dá)到一定水平時(shí)，即使酶活性暫時(shí)喪失（或提高），待最終產(chǎn)物的濃度降低（或底物耗盡）后，酶活力又重新恢復(fù)（或降低）。反饋?zhàn)瓒簦ㄕT導(dǎo)）是對(duì)酶合成的阻遏（促進(jìn)）所以其效果不如反饋抑制那樣迅速，但可以節(jié)約原料，對(duì)微生物來說是經(jīng)濟(jì)的。第二節(jié)影響酶活性的調(diào)節(jié)方式例如：乳糖發(fā)酵短桿菌的AK酶受Thr和Lys的增效抑制。

從以上圖可看出：乳糖發(fā)酵短桿菌中，AK酶受Thr和Lys單獨(dú)過量各自的反饋抑制。當(dāng)Thr和Lys同時(shí)過量時(shí)，對(duì)AK酶的抑制比Thr、Lys兩者單獨(dú)過量時(shí)發(fā)生的抑制之和還要大。3、終產(chǎn)物的累積性抑制（cumulatireinhibition）判別特征是：任一終產(chǎn)物單獨(dú)過剩時(shí)，能獨(dú)立地對(duì)共同途徑的一個(gè)多價(jià)變構(gòu)酶產(chǎn)生部分反饋抑制（某個(gè)百分比抑制），并且各終產(chǎn)物的反饋抑制作用互不影響，指既無協(xié)作也無對(duì)抗。當(dāng)多種終產(chǎn)物同時(shí)過剩時(shí)它們的反饋抑制作用是累積的。例如Ecdi中的谷氨酰胺合成酶（GInS）受8種化合物的累積抑制。

例如枯草桿菌芳香族氨基酸合成就是這種調(diào)節(jié)。（1）第一步DAHP縮合酶是三種同工酶催化，每種同工酶受其各自的終產(chǎn)物抑制。（2）莽草酸激酶受分支酸和予苯酸的反饋抑制。（3）預(yù)苯酸脫水酶受苯丙氨酸反饋抑制。（4）預(yù)苯酸脫氫酶受賴氨酸反饋抑制。（5）鄰氨基苯甲酸合成酶受Trp過量的抑制。例如：E.codi中ASP族氨酸合成途徑中AK為三個(gè)同功酶，HD為兩個(gè)同功酶。

因此要完全解除終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)，所有終產(chǎn)物都應(yīng)很少，這對(duì)我們打破其代謝調(diào)節(jié)使Lys、Met、Thr、Ile大量積累帶來困難。例如谷氨酸棒桿菌的Asp族氨基酸合成代謝途徑中第三節(jié)影響酶分子數(shù)量的調(diào)節(jié)方式

影響細(xì)胞內(nèi)酶分子數(shù)量的因素很多，酶的阻遏和誘導(dǎo)，細(xì)胞分裂，酶分子的降解等都會(huì)使酶分子數(shù)改變，但主要調(diào)節(jié)方式是阻遏、誘導(dǎo)。

L-Thr是Ile的前體，丙酮酸是纈氨酸的直接前體（a-酮異己酸是Leu的前體）。這三種氨基酸合成中有4種酶是共用的，特別是分支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶是三種氨基酸合成都需要。這些共用酶受Ile、Val、leu的阻遏。

微生物的代謝第一節(jié)微生物的代謝體系

一、微生物代謝體系代謝（Metabolism）是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的各種化學(xué)反應(yīng)的總稱，它主要由分解代謝（Catabolism）和合成代（Anabolism）兩個(gè)過程組成。

分解代謝合成代謝

總之，微生物的代謝體系主要有：（1）分解代謝體系（2）結(jié)構(gòu)單位物質(zhì)合成體系（3）復(fù)雜生物大分子物質(zhì)的合成體系

二、三種主要代謝體系的聯(lián)系

1.體系Ⅰ產(chǎn)生的ATP供給體系Ⅱ和Ⅲ使用，但體系Ⅰ中ATP如何合成并不嚴(yán)重影響體系Ⅱ、Ⅲ對(duì)ATP的使用。從這個(gè)意義上講可以認(rèn)為體系Ⅰ與整個(gè)合成體系（包括體系Ⅱ和Ⅲ）之間的聯(lián)系較為松散。

2.體系Ⅰ合成的小分子化合物可用作體系Ⅱ中結(jié)構(gòu)單位的碳架，其質(zhì)和量強(qiáng)烈地影響體系Ⅱ的運(yùn)行，因此體系Ⅰ和Ⅱ的聯(lián)系是緊密的，而體系Ⅰ與Ⅲ之間幾乎只通過ATP相聯(lián)系。因此它們之間的聯(lián)系是松散的。結(jié)構(gòu)單位（如氨基酸）在細(xì)胞內(nèi)常以游離狀態(tài)存在，由此推測體系Ⅱ和Ⅲ也只是保持松散關(guān)系。3.既然體系Ⅰ和Ⅱ分別與體系Ⅲ只發(fā)生松散聯(lián)系，體系Ⅰ就具有相對(duì)獨(dú)立的運(yùn)轉(zhuǎn)能力，同時(shí)體系Ⅰ和Ⅱ可作為一個(gè)整體，具有相對(duì)獨(dú)立的運(yùn)轉(zhuǎn)能力。4.由于細(xì)胞的分泌機(jī)制，體系Ⅰ的相對(duì)獨(dú)立運(yùn)轉(zhuǎn)使細(xì)胞有可能分泌如乙醇等代謝副產(chǎn)物；體系Ⅰ和Ⅱ一起相對(duì)運(yùn)轉(zhuǎn)，使細(xì)胞有可能分泌氨基酸等生物大分子的前體。

三個(gè)體系協(xié)調(diào)運(yùn)轉(zhuǎn)，不但使微生物細(xì)胞生長迅速，而且有可能分泌酶、多糖等生物大分子。

在代謝過程中，微生物通過分解代謝產(chǎn)生化學(xué)能，光合微生物還可將光能轉(zhuǎn)換成化學(xué)能，這些能量除用于合成代謝外，還可用于微生物的運(yùn)動(dòng)和運(yùn)輸，另有部分能量以熱或光的形式釋放到環(huán)境中去。某些微生物在代謝過程中除了產(chǎn)生其生命活動(dòng)所必需的代謝產(chǎn)物和能量外，還會(huì)產(chǎn)生一些次級(jí)代謝產(chǎn)物。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物除了有利于這些微生物的生存外，還與人類的生產(chǎn)與生活密切相關(guān)。三、化能異養(yǎng)型微生物碳架物質(zhì)

的代謝流向

第二節(jié)微生物產(chǎn)能與耗能代謝

一、微生物的產(chǎn)能代謝

（一）異養(yǎng)微生物的生物氧化異養(yǎng)微生物氧化有機(jī)物的方式，根據(jù)氧化還原反應(yīng)中電子受體的不同可分為發(fā)酵和呼吸。

1、發(fā)酵（Fermentation）

微生物發(fā)酵葡萄糖最為重要，有機(jī)物只是部分被氧化，如葡萄糖丙酮酸，稱為糖酵解（Glycolysis），主要有四種途徑。（1）EMP途徑（2）HMP途徑（3）ED途徑（4）磷酸解酮途徑EMP途徑主要生理功能是：1、提供ATP和NADH2、產(chǎn)生中間產(chǎn)物又可提供微生物合成代謝的碳骨架3、可逆轉(zhuǎn)合成多糖（2）HMP途徑

是從葡萄糖-6-P開始，即單磷酸己糖基礎(chǔ)上開始降解，故亦稱為單磷酸己糖途徑，磷酸戊糖支路（HMP途徑中3-P-甘油醛可以進(jìn)入EMP途徑）。HMP途徑的一個(gè)循環(huán)最終結(jié)果是：

一般認(rèn)為HMP途徑不是產(chǎn)能途徑，而是為生物合成提供大量的還原力NADPH和中間代謝產(chǎn)物，如核酮糖-5-P是合成核酸、某些輔酶及組氨酸的原料；NADPH是合成脂肪酸、類固醇和谷氨酸的供氫體。另外，核酮糖-5-P還可以轉(zhuǎn)化為核酮糖-1,5二磷酸，在羧化酶作用下固定CO2，對(duì)于光能自養(yǎng)菌，化能自養(yǎng)菌具有重要意義。雖然這條途徑中產(chǎn)生的NADPH可經(jīng)呼吸鏈氧化產(chǎn)能，1mol葡萄糖經(jīng)HMP途徑最終可得到35molATP，但這不是代謝的主要方式，不能把HMP途徑看作產(chǎn)生ATP的有效機(jī)制。（3）ED途徑

ED途徑是在研究嗜糖假單胞菌（PseudomonasSaccharophila）時(shí)發(fā)現(xiàn)的，在ED途徑中，葡萄糖-6-P首先脫氫產(chǎn)生葡萄糖酸-6-P，接著在脫水酶和醛縮酶的作用下，產(chǎn)生一分子甘油醛-3-P和一分子丙酮酸，然后甘油醛-3-P進(jìn)入EMP途徑轉(zhuǎn)變成丙酮酸。一分子葡萄糖經(jīng)ED途徑最后生成兩分子丙酮酸，一分子ATP，一分子NADPH和NADH。ED途徑在G-菌中分布較廣泛，特別是假單胞菌和固氮菌的某些菌株較多存在。ED途徑可不依賴于EMP,HMP途徑而單獨(dú)存在，但對(duì)于靠底物水平磷酸化類的ATP的厭養(yǎng)菌而言，ED途徑不如EMP途徑經(jīng)濟(jì)。

（4）磷酸解酮途徑

磷酸解酮途徑是明串珠菌在進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵過程中分解己糖和戊糖的途徑。該途徑的特征性酶是磷酸解酮酶。根據(jù)解酮酶不同，把具有磷酸戊糖解酮酶的稱PK途徑，把具有磷酸己糖解酮酶的叫HK途徑。

2、呼吸作用

微生物在降解底物過程中，將釋放出電子傳給NAD（P）+FAD或FMN等電子載體，在經(jīng)電子傳遞系統(tǒng)傳給外源電子受體，從而生成水或其它還原型產(chǎn)物并釋放出能量的過程稱為呼吸作用。

（1）有氧呼吸以分子氧作為最終電子受體的稱為有氧呼吸（Aerobicrespiration）。呼吸作用與發(fā)酵作用的根本區(qū)別在于：電子載體不是將電子直接傳遞給底物降解的中間產(chǎn)物，而是交給電子傳遞系統(tǒng)，逐步釋放出能量后，再交給最終電子受體。

許多不能被發(fā)酵的有機(jī)化合物能夠通過呼吸作用被分解，這是因?yàn)樵谶M(jìn)行呼吸作用的生物電子傳遞系統(tǒng)中發(fā)生了NADH的再氧化和ATP的生成。因此，只要生物體內(nèi)有一種能將電子從該化合物轉(zhuǎn)移給NAD+的酶存在，而且該化合物的氧化水平低于CO2即可。能通過呼吸作用進(jìn)行分解的有機(jī)物包括某些CH化合物、脂肪酸、許多醇類。但對(duì)人造化合物，PVC、PP等微生物的呼吸作用具有顯著抗性，可在環(huán)境中積累，造成有害的生態(tài)影響。

根據(jù)原核生物與真核生物不同，葡萄糖完全氧化總共可獲得36或38個(gè)ATP.

在TCA循環(huán)中丙酮酸完全氧化為3個(gè)CO2同時(shí)生成4分子NADH2和一分子FADH2。NADH、FADH2可經(jīng)電子傳遞系統(tǒng)全部被氧化。氧化一個(gè)NADH生成3分子ATP，氧化FADH2生成2分子ATP，再加上琥珀酰CoA氧化成延胡索酸中，包括底物水平磷酸化作用，由此產(chǎn)生1分子ATP，因此每一次TCA循環(huán)可獲得4×3+1×2+1=15ATP。此外，糖酵解過程中產(chǎn)生2分子NADH，即2×3=6ATP。葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)閮煞肿颖徇€可借底物水平磷酸化生成兩分子ATP。因此，葡萄糖完全氧化總共可獲得6+2+15×2=38ATP，假設(shè)ATP高能磷酸鍵有31.8KJ/mol的能量，那么每1mol葡萄糖完全氧化成CO2和H2O時(shí)就有31.8×38=1208KJ的能量轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP中的高能磷酸鍵的鍵能，因此完全氧化1mol葡萄糖可獲得的總能量大約是2822KJ，因此呼吸作用的效率大約是43%，其余的能量以熱的形式散失。

（2）無氧呼吸

以氧化型化合物作為最終電子受體的稱為無氧呼吸（Anaerobicrespiration）某些厭氧和兼性厭氧微生物在無氧條件下進(jìn)行無氧呼吸。無氧呼吸的最終電子受體不是氧，而是像NO3-、NO2-、SO42-、S2O32-、CO2等這類外源受體。無氧呼吸也需要細(xì)胞色素等電子傳遞體，并在能量分級(jí)釋放過程中伴有磷酸化作用，也能產(chǎn)生較多的能量用于生命活動(dòng)。但由于部分能量隨電子轉(zhuǎn)移傳給最終電子受體，所以生成的能量不如有氧呼吸產(chǎn)生的多。

在無氧條件下，某些微生物在沒有氧、氮或硫作為呼吸作用的最終受體時(shí)，可以磷酸鹽代替，其結(jié)果是生成磷化氫PH3，一種易燃?xì)怏w。當(dāng)有機(jī)物腐敗變化時(shí)，經(jīng)常會(huì)發(fā)生這種情況。若埋葬尸體的墳?zāi)狗饪诓粐?yán)時(shí)，這種氣體就很易溢出。農(nóng)村的墓地通常位于山坡上，埋葬著大量尸體，在夜晚，氣體燃燒會(huì)發(fā)出綠幽幽的光。長期以來人們無法正確地解釋這種現(xiàn)象，將其稱為“鬼火”。

（二）自養(yǎng)（以無機(jī)物CO2為唯一或主要碳源）微生物的生物氧化

一些微生物可以從氧化無機(jī)物獲得能量，同化合成細(xì)胞物質(zhì)，這類微生物稱為化能自養(yǎng)微生物。它們在無機(jī)能源氧化過程中主要通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP。

氨的氧化NH3、NO2-亞硝酸硝酸亞硝化細(xì)菌

硝化細(xì)菌

硫的氧化H2SS亞硫酸鹽氧化

硫氧化酶細(xì)胞色素系統(tǒng)產(chǎn)生4ATP直接氧化

磷酸腺苷硫酸氧化途徑

鐵的氧化

亞鐵的氧化僅在嗜酸性的氧化亞鐵硫桿菌中進(jìn)行，在低pH下此菌能利用亞鐵氧化放出的能量生長。在該菌的呼吸鏈中發(fā)現(xiàn)了一種含銅蛋白質(zhì)，它與幾種細(xì)胞色素C和一種細(xì)胞色素a1氧化酶構(gòu)成電子傳遞鏈，盡管電子傳遞過程中的放能部位，和放出有效能的多少有待進(jìn)一步研究，但已發(fā)現(xiàn)在電子傳遞到氧的過程中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有質(zhì)子消耗，從而驅(qū)動(dòng)ATP的合成。

氫的氧化

氫細(xì)菌都是一些呈G-兼性化能自養(yǎng)菌。它們能利用分子H2氧化產(chǎn)生能量同化CO2，也能利用其它有機(jī)物生長。氫細(xì)菌的細(xì)胞膜上有泛醌、維生素K2及細(xì)胞色素等呼吸鏈組分。在該菌中，電子直接從H2電子傳遞系統(tǒng)，電子在呼吸鏈傳遞中產(chǎn)生ATP。在多數(shù)氫細(xì)菌中，有兩種與氫氧化有關(guān)的酶。（1）是位于壁膜間隙或結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)膜上的不需NAD+的顆粒狀氧化酶，它可催化

H22H++2e-

。該酶在氧化氫，并通過電子傳遞系統(tǒng)傳遞電子過程中可驅(qū)動(dòng)質(zhì)子的跨膜運(yùn)輸，形成跨膜質(zhì)子梯度為合成ATP提供動(dòng)力。

（2）是可溶性氫化酶的氧化，而使NAD+還原的反應(yīng)。所生成的NADH主要用于CO2的還原。

（三）能量轉(zhuǎn)換

1.底物水平磷酸化（SubstrateLevelPhosphorylation）物質(zhì)在生物氧化過程中，常生成一些含有高能鍵的化合物，這些化合物可直接偶聯(lián)ATP或GTP的合成，這種產(chǎn)生ATP等高能分子的方式稱底物水平磷酸化。2.氧化磷酸化（OxidatirePhosphorylation）物質(zhì)在生物氧化過程中，形成NADH和FADH2可通過位于線粒體內(nèi)膜和細(xì)胞質(zhì)膜上的電子傳遞系統(tǒng)將電子傳遞給氧或其它氧化型物質(zhì)。在這個(gè)過程中偶聯(lián)著ATP的合成，這種產(chǎn)生ATP的方式稱為氧化磷酸化。3.光合磷酸化（Photophosphorylation）光合磷酸化是指光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能的過程，以用于從CO2合成細(xì)胞物質(zhì)。當(dāng)一個(gè)葉綠素分子吸收光量子時(shí)，葉綠素性質(zhì)上即被激活，導(dǎo)致葉綠素（或細(xì)菌葉綠素）釋放一個(gè)電子而被氧化，釋放出的電子在電子傳遞系統(tǒng)中的傳遞過程中逐步釋放能量，這就是光合磷酸化的基本動(dòng)力。（1）環(huán)式光合磷酸化（2）非環(huán)式光合磷酸化

二、微生物的耗能代謝

（一）細(xì)胞物質(zhì)的合成

微生物利用能量代謝產(chǎn)生的能量、中間產(chǎn)物以及從外界吸收的小分子合成復(fù)雜的細(xì)胞物質(zhì)的過程稱為合成代謝。合成代謝所需的能量由ATP和質(zhì)子動(dòng)力提供。糖類、氨基酸、脂肪酸、嘌呤、嘧啶等主要細(xì)胞成分的合成反應(yīng)的生化途徑中，合成代謝和分解代謝盡管存在共同的中間代謝物。例如由分解代謝產(chǎn)生的丙酮酸、乙酰CoA、草酰乙酸、3-P甘油醛等化合物亦可作為合成反應(yīng)的起始物。（1）生物合成途徑中一個(gè)分子的生物合成化學(xué)途徑與它的分解代謝途徑通常是不同的，其中可能有相同的步驟，但導(dǎo)向一個(gè)分子合成的途徑與從該分子開始的降解途徑間至少有一個(gè)酶促反應(yīng)步驟是不同的。（2）需能的生物合成途徑與產(chǎn)能的ATP分解反應(yīng)相偶聯(lián)，因而生物合成方向是不可逆的。（3）調(diào)節(jié)生物合成的反應(yīng)與相當(dāng)?shù)姆纸獯x途徑的調(diào)節(jié)機(jī)制無關(guān)，因?yàn)榭刂品纸獯x途徑速率的調(diào)節(jié)酶，并不參與生物合成途徑。生物合成途徑主要是被它們的末端產(chǎn)物濃度所調(diào)節(jié)。

1、CO2固定

CO2是自養(yǎng)微生物的唯一碳源，異養(yǎng)微生物也能利用CO2作為輔助的碳源。將空氣的CO2同化成細(xì)胞物質(zhì)過程，稱為CO2的固定作用。微生物有兩種同化CO2的方式，（1）是自養(yǎng)式，（2）為異養(yǎng)式。在自養(yǎng)式中，CO2加在一個(gè)特殊的受體上，經(jīng)過循環(huán)反應(yīng)，使之合成糖并重新生成該受體。在異養(yǎng)式中CO2被固定在某種有機(jī)酸上。因此異養(yǎng)微生物即使能同化CO2，最終卻必須靠吸收有機(jī)碳化合物生存。自養(yǎng)微生物同化CO2所需的能量來自光能或無機(jī)物氧化所得的化學(xué)能，固定CO2的途徑主要有以下三條：

（1）卡爾文循環(huán)（Calvincycle）

化能自養(yǎng)微生物和大部分光合細(xì)菌中。

（2）還原性TCA環(huán)固定CO2

在光合細(xì)菌、綠硫細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)此途徑

每循環(huán)一次可固定四分子CO2，合成一分子草酸乙酰，消耗3分子ATP，兩分子NAD（P）H和一分子FADH2。

（3）還原的單羧酸環(huán)

這個(gè)體系與還原羧酸環(huán)不同，不需ATP，只要有Fd（red）就可運(yùn)轉(zhuǎn)，F(xiàn)d（red）由H2或NADH2提供電子生成。光合細(xì)菌也可利用此途徑體系把CO2轉(zhuǎn)換成乙酸。

異養(yǎng)型微生物同化CO2

異養(yǎng)型微生物的CO2固定主要是合成TCA環(huán)中間產(chǎn)物。從理論上講，利用1分子草酸乙酰就可以不斷地推動(dòng)TCA環(huán)的運(yùn)行（因?yàn)椴菟嵋阴？赏ㄟ^TCA環(huán)再生）。假如TCA環(huán)中的中間產(chǎn)物被用作它用，那么就須加以補(bǔ)充，才能維持TCA的正常運(yùn)行。異養(yǎng)型微生物固定CO2生產(chǎn)二羧補(bǔ)充TCA環(huán)的中間產(chǎn)物主要有以下反應(yīng)。

毫無疑問以上六種酶，并不同時(shí)存在一個(gè)有機(jī)體中。例如腸桿菌科中就以磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶為主催化CO2，而黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌中就以丙酮酸羧化酶為主催化CO2。

2、生物固氮

所有生物都需要氮，氮的最終來源是無機(jī)氮。盡管大氣中氮?dú)獾谋壤?9%，但所有的動(dòng)植物以及大多數(shù)微生物都不能利用分子態(tài)氮作氮源。目前僅發(fā)現(xiàn)一些特殊類群的原核生物能將分子態(tài)N2還原NH3，然后再由氨轉(zhuǎn)化為多種細(xì)胞物質(zhì)。微生物將氮還原成氨的過程稱生物固氮。

微生物之所以能夠在常溫壓條件下固氮，關(guān)鍵靠固氮酶的催化作用。固氮酶的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，由鐵蛋白和鉬鐵蛋白連兩個(gè)組分組成。固氮作用是一個(gè)耗能反應(yīng)，固氮反應(yīng)必須在有固氮酶和ATP參與下才能進(jìn)行。每固定1mol氮大約需要21molATP，這些能量來自氧化磷酸化或光合磷酸化。在體內(nèi)進(jìn)行固氮時(shí)還需要特殊的電子傳遞體，主要是鐵氧還蛋白和含有FMN作為輔基的黃素氧還原白。鐵氧還原蛋白和黃素氧還原蛋白的電子供體來自NADPH，受體是固氮酶。3、二碳化合物的同化

TCA環(huán)是產(chǎn)能反應(yīng)和生物合成的重要代謝環(huán)節(jié)，其中的有機(jī)酸可被微生物利用，作為電子的供體和碳源。四碳、五碳、六碳酸均可在有氧條件下被微生物利用，通過氧化磷酸化產(chǎn)生能量。TCA環(huán)只有在受體分子草酰乙酸在每次循環(huán)后都能得到再生的情況下才能順利進(jìn)行。若將TCA中的有機(jī)酸分子移作他用（生物合成）將會(huì)影響TCA環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)。我們知道微生物可利用回補(bǔ)途徑（Replenishmentpathway）來解決這個(gè)矛盾。什么是回補(bǔ)途徑？是指補(bǔ)充兼用（可）代謝途徑（如TCA環(huán)）中因合成代謝而消耗的中間代謝產(chǎn)物的反應(yīng)。

不同微生物以及在不同條件下具有不同的回補(bǔ)途徑，總起來主要有：（1）CO2的固定反應(yīng)CO2的固定反應(yīng)上面已介紹不重復(fù)。（2）乙醛酸循環(huán)

（3）甘油酸途徑

乙醛酸途徑甘油酸途徑

由乙醛酸生成甘油酸的途徑稱為甘油酸途徑。許多微生物都有這條途徑，可以利用乙醇酸、草酸、甘氨酸等二碳化合物為唯一碳源生長。

4、糖類的合成

5、氨基酸的合成

6、核苷酸的合成

（1）嘌呤核苷酸的生物合成（2）嘧啶核苷酸的生物合成（3）

嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸的補(bǔ)救合成途徑

（4）脫氧核苷酸的合成

（1）嘌呤核苷酸的生物合成

（2）

嘧啶核苷酸的生物合成

（3）

嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸的補(bǔ)救合成途徑

（4）脫氧核苷酸的合成

脫氧核苷酸是由核苷酸糖基第2位碳上的-OH還原為H而成的，是一個(gè)耗能過程。E.coli核糖核苷二磷酸水平上脫氧德氏乳酸菌核糖核苷三磷酸水平上脫氧DNA的胸腺嘧啶脫氧核苷酸是在形成尿嘧啶脫氧核糖核苷二磷酸后脫去磷酸，再經(jīng)甲基化生成的。（二）其他耗反應(yīng)

1.運(yùn)動(dòng)鞭毛運(yùn)動(dòng)鞭毛纖毛中均具有ATP酶，水解ATP產(chǎn)生自由能成為運(yùn)動(dòng)所需的動(dòng)力。2.運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸有四種機(jī)制。擴(kuò)散、促進(jìn)擴(kuò)散、主動(dòng)運(yùn)輸(需要消耗能量)、膜泡運(yùn)輸(需要消耗能量)。

3.發(fā)光

許多活的生物體，包括某些細(xì)菌、真菌和藻類都能發(fā)光。盡管它們的發(fā)光機(jī)制不同，但在所有例子中，發(fā)光都包含能量的轉(zhuǎn)移，是形成一種分子激活態(tài)，當(dāng)這種激活態(tài)返回基態(tài)時(shí)即發(fā)出光來。

細(xì)菌發(fā)光涉及兩種特殊成分（1）熒光色素酶（2）一種長鏈脂肪族醛。另外黃素單核苷酸和氧參與，NADPH是主要電子供體。

微生物的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制第一節(jié)微生物細(xì)胞中代謝調(diào)節(jié)的

部位與舉措

一、原核微生物細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)部位

（一）與細(xì)胞質(zhì)膜密切相關(guān)的調(diào)節(jié)

1.膜的脂質(zhì)（磷脂及其它脂類）的分子結(jié)構(gòu)，以及環(huán)境條件（如離子強(qiáng)度、溫度、pH等）對(duì)膜脂質(zhì)理化性質(zhì)的影響。2.膜蛋白（如酶、載體蛋白、電子傳遞鏈的成員及其它蛋白質(zhì)）的絕對(duì)數(shù)量及其活性的調(diào)節(jié)。3.跨膜的電化學(xué)梯度以及ATP、ADP、AMP體系及無機(jī)（P）濃度對(duì)溶質(zhì)輸送的調(diào)節(jié)。4.細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)（特別是骨架結(jié)構(gòu)）的部分破壞或變形，間接影響到膜對(duì)溶質(zhì)的通透性。

（二）細(xì)胞空間內(nèi)存在的酶分子的數(shù)量及它們活性的調(diào)節(jié)

1.微生物可改變生物合成代謝途徑中的酶量，特別是關(guān)鍵酶合成或降解的相對(duì)速率，進(jìn)而調(diào)節(jié)代謝流向。

2.可改變酶的活性，特別是關(guān)鍵酶的活性（力）來調(diào)節(jié)代謝速度。

3.酶和底物的相對(duì)位置

限制酶與基質(zhì)的有形接觸（代謝途徑的區(qū)域化）

二、真核微生物細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)部位

三、原核生物和真核生物在

基因表達(dá)上的重要區(qū)別

四、生物進(jìn)化與代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的出現(xiàn)（1）

酶水平的調(diào)節(jié)（2）

細(xì)胞水平的調(diào)節(jié)（3）

激素水平的調(diào)節(jié)（4）

神經(jīng)水平的調(diào)節(jié)五、微生物細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)的主要舉措

1.

酶合成的調(diào)節(jié)

2.

酶活性的調(diào)節(jié)

3.

能荷的調(diào)節(jié)

4.細(xì)胞膜透性的調(diào)節(jié)

第二節(jié)酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制

酶合成調(diào)節(jié)機(jī)制主要有：

1.酶的誘導(dǎo)負(fù)向控制（如乳糖對(duì)β-半乳糖苷酶）與正向控制。2.終產(chǎn)物阻遏作用和弱化調(diào)節(jié)。3.分解代謝物阻遏（如葡萄糖對(duì)β-半乳糖苷酶的阻遏）。4.轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)。

一、誘導(dǎo)作用（酶合成的誘導(dǎo)作用）

是指培養(yǎng)基中某種基質(zhì)與微生物接觸而增加（誘導(dǎo)）細(xì)胞中相應(yīng)酶的合成速率。誘導(dǎo)的生理作用是可以保證能量與氨基酸不浪費(fèi)，不把它們用于合成那些暫時(shí)無用的酶上，只有在需要時(shí)細(xì)胞才迅速合成它們。（一）誘導(dǎo)機(jī)制（操縱子轉(zhuǎn)錄）

1.操縱子（元）Operen

所謂操縱子（元）是指結(jié)構(gòu)上、功能上、協(xié)同作用的相關(guān)基因組成的一個(gè)片段（區(qū)域）。操縱子假說認(rèn)為：編碼一系列功能相關(guān)的酶的基因在染色體中緊密排列在一起，且它們的表達(dá)與關(guān)閉是通過同一控制點(diǎn)協(xié)同進(jìn)行的。

每個(gè)操縱子（元）至少由4個(gè)基因（部分）組成。（1）調(diào)節(jié)基因（R.I.C）（Regulatorygene)（2）操縱基因（Operatorgene）

（3）結(jié)構(gòu)基因（Structuralgene）

（4）啟動(dòng)基因（Promotergene）（1）調(diào)節(jié)基因（R.I.C）（Regulatorygene)

它能編碼、調(diào)節(jié)（阻遏）蛋白，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)有兩種調(diào)節(jié)蛋白：

1.陰性（負(fù)作用）調(diào)節(jié)蛋白（Negatire-actingprotein），此種調(diào)節(jié)蛋白也稱為阻遏物（Repressor）。

2.正作用調(diào)節(jié)蛋白（Positire-acting-protein）,此種調(diào)節(jié)蛋白也稱為激活因子（Actiration）。

（2）操縱基因（Operatorgene）

是操縱子中一個(gè)成員，它能控制決定蛋白質(zhì)（酶）的氨基酸順序的一整套結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，而操縱基因可受調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏物所阻遏，許多情況下，單個(gè)操縱基因可以控制一個(gè)或一個(gè)以上（多個(gè)）結(jié)構(gòu)基因。

（3）結(jié)構(gòu)基因（Structuralgene）

是指在操縱基因鄰近（一般在下游處）存在一個(gè)或多個(gè)基因，它編碼不起調(diào)控轉(zhuǎn)錄作用的蛋白質(zhì)，如酶、膜蛋白和核糖體等。一部分結(jié)構(gòu)基因的RNA合成速度精確地被控制，但許多結(jié)構(gòu)基因以一種（或多或少）不變的速度持續(xù)地轉(zhuǎn)錄DNA上的遺傳信息，生成相應(yīng)的信使RNA（mRNA）進(jìn)而轉(zhuǎn)譯成特定的酶（蛋白質(zhì)）。（4）啟動(dòng)基因（Promotergene）

啟動(dòng)子（基因）含有兩個(gè)和RNA多聚酶結(jié)合的順序，一個(gè)集中在RNA多聚酶起始位置前約10個(gè)堿基對(duì)，另一個(gè)則集中在這個(gè)位置前35個(gè)堿基對(duì)，當(dāng)RNA多聚酶與啟動(dòng)子接觸并結(jié)合上去，mRNA合成即開始。如阻遏物（阻遏調(diào)節(jié)蛋白）與Operatorgene結(jié)合，則RNA聚合酶就不能和Operatorgene結(jié)合，就不能向前移動(dòng)，也就不能轉(zhuǎn)錄出互補(bǔ)于結(jié)構(gòu)基因（S）的DNA順序的mRNA。也就沒有酶的生成。而在E.coli中啟動(dòng)基因必須經(jīng)過（環(huán)化AMP受體蛋白復(fù)合物）的激活后，才能啟動(dòng)。

這些基因形成整套調(diào)節(jié)控制機(jī)制，才能使生命系統(tǒng)在功能上有序、有效及開放。

2、

DNA與蛋白（阻遏蛋白）的結(jié)合

蛋白質(zhì)與核酸的相互作用一般可分為非專一性，蛋白質(zhì)可以結(jié)合到核酸的任何部位；專一性，蛋白質(zhì)結(jié)合到特定的核酸的部位。

(二)酶合成的誘導(dǎo)（轉(zhuǎn)錄的負(fù)控誘導(dǎo)和正控誘導(dǎo)）實(shí)例及機(jī)制實(shí)例

（1）酶合成的負(fù)誘導(dǎo)機(jī)制（大腸桿菌乳糖操縱子）

（2）轉(zhuǎn)錄的正控誘導(dǎo)麥芽糖操縱子

機(jī)制轉(zhuǎn)錄的正負(fù)誘導(dǎo)調(diào)控

當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞以阿拉伯糖作為生長所需碳源和能源時(shí)，它們產(chǎn)生三種將阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的酶。

圖2-12阿拉伯糖對(duì)ara操縱子araC位點(diǎn)的調(diào)控作用

（三）誘導(dǎo)物的種類

誘導(dǎo)分解代謝酶類屬于誘導(dǎo)酶的范疇。例如，淀粉酶是由淀粉誘導(dǎo)合成的，蔗糖酶與脲酶分別由蔗糖和尿素誘導(dǎo)。細(xì)胞在代謝過程中生成的產(chǎn)物也可以作為誘導(dǎo)物。熒光假單孢菌在色氨酸大量存在時(shí)。色氨酸的代謝產(chǎn)物——犬尿酸便可誘導(dǎo)分解色氨酸的酶系。

（四）誘導(dǎo)調(diào)節(jié)的克服

只有需要時(shí)才合成所需的酶是微生物應(yīng)有的、正常的調(diào)節(jié)機(jī)制。如不設(shè)法繞過這種機(jī)制，就難于使所需要的誘導(dǎo)酶大量生產(chǎn)。據(jù)此，我們可采用誘變方法，借強(qiáng)力因素誘變，引起突變，消除誘導(dǎo)酶，合成所必需依賴誘導(dǎo)物這種障礙，如突變不是發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因上，而是發(fā)生在調(diào)節(jié)基因或操縱基因上，從而導(dǎo)致調(diào)節(jié)基因編碼的阻遏物（阻遏蛋白）無活性，或操縱基因?qū)钚宰瓒粑锏挠H和力衰退，則無需誘導(dǎo)物便能產(chǎn)生誘導(dǎo)酶，這種突變作用稱為調(diào)節(jié)性或組成型突變。具有這種特性的菌株稱為組成型突變株。組成型突變株的獲得、富集方法。

1.在誘導(dǎo)物為限制性基質(zhì)的恒化器中篩選。

2.將菌株輪番在有、無誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

3.使用誘導(dǎo)性能很差的基質(zhì)。

4.使用阻礙誘導(dǎo)作用的抑制劑。

5.提高篩選效率的方法，即組成型突變株的富集。

二、酶合成的阻遏和弱化（終產(chǎn)物的阻遏、弱化）實(shí)例及機(jī)制(一)實(shí)例

(1)轉(zhuǎn)錄的負(fù)控阻遏

L-色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)

圖2-14大腸桿菌trp操縱子

trpoperon阻遏系統(tǒng)——終產(chǎn)物的阻遏機(jī)制

(2)轉(zhuǎn)錄的衰減（弱化作用）

弱化子隨著對(duì)trpoperon

的深入研究，發(fā)現(xiàn)有些現(xiàn)象與以阻遏作為唯一調(diào)節(jié)機(jī)制的觀點(diǎn)不相一致。例如，在高濃度和低濃度下觀察到，trpoperon的表達(dá)水平相差約600倍，然而阻遏作用只可使轉(zhuǎn)錄減少70倍。，顯然trpoperon表達(dá)的這種控制與上述阻遏物的控制無關(guān)，必須有一種稱為弱化作用的調(diào)控機(jī)制。這個(gè)前導(dǎo)區(qū)域稱為弱化區(qū)域，這個(gè)前導(dǎo)肽稱為弱化子。

（二）機(jī)制

(1)轉(zhuǎn)錄弱化作用的調(diào)控

A.當(dāng)trp缺乏時(shí)（低水平的trp時(shí)）

B.Trp濃度很高時(shí)（2）阻遏作用和弱化作用的區(qū)別與協(xié)調(diào)

A.區(qū)別可阻遏操縱子的表達(dá)：在無阻遏物存在時(shí)，取決于RNA聚合酶與啟動(dòng)子的相互作用或啟動(dòng)頻率，若終產(chǎn)物（氨基酸）過量時(shí)，它作為輔阻遏物（corepressor）干擾轉(zhuǎn)錄的發(fā)動(dòng)。

Trp、His等操縱子中存在弱化子，操縱子的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄起始頻率以及啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)關(guān)系不大，而主要取決于弱化子的控制。RNA多聚酶要么在弱化子處停止最終脫落下來，要么向結(jié)構(gòu)基因方向通過去。也就是當(dāng)過量的終產(chǎn)物（氨基酸）存在時(shí)，使細(xì)胞內(nèi)有過量的對(duì)應(yīng)氨基酸的氨基酰tRNA產(chǎn)生，它能使已發(fā)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄終止在第一結(jié)構(gòu)基因前。

B.協(xié)調(diào)一般認(rèn)為野生型細(xì)胞中同時(shí)存在著有活性和無活性的阻遏物。若獲得無活性阻遏物的突變細(xì)胞，Trp合成酶的濃度就比野生型細(xì)胞高出10倍以上。因此培養(yǎng)基中色氨酸濃度的變化就會(huì)影響這兩種阻遏物的平衡，使之發(fā)生傾斜，最終發(fā)出關(guān)閉或啟動(dòng)Trp操縱子的命令，從而維持細(xì)胞內(nèi)色氨酸的含量。

那么細(xì)菌中為什么還需要弱化子調(diào)控系統(tǒng)呢？其原因可能是：

a.阻遏物從有活性到無活性的轉(zhuǎn)變速度極低，需要有一個(gè)能更快地做出反應(yīng)的系統(tǒng)來維持適當(dāng)氨基酸的水平。

b.弱化子系統(tǒng)主要是對(duì)外源氨基酸（色氨酸）濃度作出反應(yīng)。

為什么還要阻遏體系呢？沒有阻遏體系，似乎只有弱化作用也可以調(diào)節(jié)色氨酸酶系的合成。目前認(rèn)為當(dāng)有大量外源色氨酸存在時(shí)，通過阻遏體系阻止非必須的先導(dǎo)mRNA合成，使合成更加經(jīng)濟(jì)。當(dāng)然His操縱子中，沒有阻遏體系，只有弱化子調(diào)節(jié)。所以說明弱化子的調(diào)節(jié)作用是控制轉(zhuǎn)錄的終止，控制轉(zhuǎn)錄精細(xì)，是阻遏調(diào)控體系的次級(jí)調(diào)節(jié)。

三、分解代謝物阻遏（cataboliticrepression）調(diào)控

（一）分解代謝物阻遏的概念

所謂分解代謝物阻遏是指當(dāng)細(xì)胞內(nèi)具有一優(yōu)先利用的營養(yǎng)物（通常是，但并不總是葡萄糖）時(shí)，其分解產(chǎn)物對(duì)分解利用其它（難利用）營養(yǎng)物質(zhì)所需的酶系合成起阻遏作用。

（二）分解代謝物阻遏的實(shí)質(zhì)

分解代謝物阻遏的實(shí)質(zhì)是由于細(xì)胞內(nèi)缺少了cAMP。(三)cAMP是對(duì)酶合成水平的控制（1）Lac.opern中的啟動(dòng)基因P包含兩個(gè)位點(diǎn)：A，與CRP基因編碼的一種調(diào)節(jié)蛋白，稱cAMP受體蛋白簡稱CRP或CAP結(jié)合點(diǎn)。B，和RNA多聚酶結(jié)合的位點(diǎn)。(2)轉(zhuǎn)錄開始時(shí)，cAMP先與CAP或結(jié)合生成cAMP-CAP復(fù)合物。

(3)CAP-cAMP復(fù)合物再與Lac.opern中的啟動(dòng)基因P的CAP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而激活了位點(diǎn)，進(jìn)而促進(jìn)RNA多聚酶與它的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)（注意CRP起正的作用），所以解除了分解代謝物的阻遏。（4）

RNA多聚酶進(jìn)入RNA多聚酶位點(diǎn)向前漂移（5）當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，RNA多聚酶進(jìn)入操縱基因O位點(diǎn)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（6）cAMP在乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄中是通過CAP-cAMP復(fù)合物與DNA結(jié)合時(shí)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的，這種調(diào)控是正調(diào)控。

（7）細(xì)胞內(nèi)cAMP水平在某些方向反映出細(xì)胞內(nèi)能量的狀態(tài)。

ATPcAMPAMPcAMP水平與腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶的相對(duì)活性有關(guān)。

若CRP基因失活的突變株，就不能誘導(dǎo)任何分解代謝物阻遏系統(tǒng)酶的合成，因而只能在易被利用的基質(zhì)上生長。若腺苷酸環(huán)化酶喪失的突變株，那么cAMP水平下降，那么就不能在受阻遏的碳源（如甘油、乳糖、蔗糖）等上生長，但它和CRP缺陷突變株不同，外源加入cAMP還是有效的。(四)葡萄糖對(duì)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的調(diào)節(jié)（1）可能是由于葡萄糖分解過程中的某些中間產(chǎn)物抑制了細(xì)胞內(nèi)cAMP的形成。（2）可能是這種中間產(chǎn)物激活了cAMP的分解（五）分解代謝阻遏的分子機(jī)制（六）分解代謝物阻遏作用的克服1、生產(chǎn)培養(yǎng)基內(nèi)不使用阻遏性碳源，將有利于對(duì)分解代謝物阻遏敏感酶的生產(chǎn)。

2、可利用一種不能代謝的誘導(dǎo)物的類似物，或緩慢補(bǔ)入誘導(dǎo)物或使用只能緩慢代謝的誘導(dǎo)物的衍生物來增加酶的生產(chǎn)。3、選育耐（