翠貽貝對(duì)腹瀉性貝毒的累積與排出

翠貽貝對(duì)腹瀉性貝毒的累積與排出

大明軟海綿酸（oa）是ae級(jí)腹瀉性骨關(guān)節(jié)?。╬d）的主要毒素類型。這是蛋白質(zhì)磷酸酶pp1（protectionpharmace）和pp2a（sertorreprotectionpharmace2a）的特定抑制劑。由于其特定的化合物，它可以抑制許多酶的去除磷酸化，導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)路徑的變化和身體疾病。愛(ài)貝、貝貝或其他雙殼類動(dòng)物可以通過(guò)過(guò)濾食物中的毒藻來(lái)積累sd，但對(duì)貝類本身的生存影響不大。即使以毒藻為唯一的食物來(lái)源，死亡率也不會(huì)顯著增加。這表明貝體體內(nèi)存在一種特殊的耐堿或抗堿機(jī)制，這使貝體本身不會(huì)受到腹瀉性貝毒的傷害。sd耐受性和抗堿機(jī)制對(duì)研究具有重要的實(shí)用價(jià)值和理論意義。作為多生物異源物質(zhì)抗性機(jī)理(multixenobioticresistance,MXR)的重要組成部分,具有上調(diào)修復(fù)機(jī)制的熱激蛋白70(heatshockprotein70,HSP70)廣泛分布于各種生物體內(nèi),在生物體對(duì)環(huán)境脅迫和外源物質(zhì)的抗性與耐受機(jī)制中發(fā)揮重要作用.研究發(fā)現(xiàn),HSP70在熱激、高溫、紫外線、微量金屬、異源物質(zhì)(如細(xì)菌,毒素)都能誘導(dǎo)其表達(dá),由于HSP70的高度保守性、同源性及脅迫誘導(dǎo)的廣譜性,因此受污染土壤和海洋中的生物所產(chǎn)生的HSP可作為機(jī)體受到環(huán)境脅迫的標(biāo)記,并進(jìn)一步用于環(huán)境的監(jiān)測(cè)和分析.但貝毒素能否誘導(dǎo)HSP的表達(dá),HSP在貝類抗貝毒機(jī)制中是否發(fā)揮某種重要作用?目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道.本研究以利瑪原甲藻為餌料,通過(guò)室內(nèi)濾食實(shí)驗(yàn),考查了DSP在翡翠貽貝體內(nèi)的累積與排出規(guī)律,分析了HSP70基因的表達(dá)與毒素累積與排出之間的關(guān)系,探討了DSP毒素對(duì)HSP70基因表達(dá)的影響,為進(jìn)一步明確HSP70在貝類抗DSP毒素中的作用奠定基礎(chǔ).1材料和方法1.1角褐脂藻phaceodagctraft利瑪原甲藻(Prorocentrumlima)由美國(guó)CCMP(Provasoli-GuillardNationalCenterforCultureofMarinePhytoplankton)提供,編號(hào)2597.三角褐脂藻(Phaceodactylumtricornutum)由暨南大學(xué)赤潮與水環(huán)境研究中心提供.翡翠貽貝(Pernaviridis)采自廣東珠海海域.1.2儀器和檢測(cè)方法海鹽(Aquasonic,Ingieburn,N.S.W.,Australia);維生素VB1、維生素VB12和生物素(上海伯奧生物科技有限公司);Trizolreagent(Invitrogen);MMLVReverseTranscriptaseRnaseH(TOYOBO);Ribonucleaseinhibitor,TakaraLATaq和Sampleprotector(Takara);DSP檢測(cè)試劑盒(Abraxis).其他未注明試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.353型酶標(biāo)儀(LabsystemsMultiskanMK);CKX41倒置生物顯微鏡(Olympus);CD2105智能生物人工氣候箱(Xutemp,杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司);PCR擴(kuò)增儀(Bio-rad);凝膠成像系統(tǒng)(MultiGenius).1.3實(shí)驗(yàn)方法(1)培養(yǎng)基的設(shè)置利瑪原甲藻和三角褐脂藻的培養(yǎng)均采用f/2培養(yǎng)基,置于溫度(22±1)℃,光照強(qiáng)度4000lx、光暗循環(huán)為L(zhǎng)∶D=12∶12的人工氣候箱中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng).(2)飼養(yǎng)繁殖與培養(yǎng)將翡翠貽貝置于海水(25‰)中馴養(yǎng),連續(xù)充氣,每天換水一次,馴養(yǎng)餌料使用三角褐脂藻,飼養(yǎng)密度約20只/20L,使貝保持良好的生理狀態(tài).(3)實(shí)驗(yàn)貝的干質(zhì)量實(shí)驗(yàn)設(shè)5組,投喂不同體積比的利瑪原甲藻和三角褐脂藻(0∶100,30∶70,50∶50,70∶30,100∶0).其中全部喂飼利瑪原甲藻的藻密度為105/L,全部喂飼三角褐脂藻的藻密度為106/L.空白對(duì)照不加貝類,每組設(shè)3個(gè)平行,置盛有4L海水的大燒杯內(nèi)飼養(yǎng),氧氣泵充氣,實(shí)驗(yàn)時(shí)間為1h.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取水樣計(jì)數(shù),稱實(shí)驗(yàn)貝的干質(zhì)量.濾食率的計(jì)算公式為:G=V·(lnCt-lnCtf)·(Ctf-C0)/[N·W·t·(lnCtf-lnC0)]式中,G為濾食率[個(gè)/(g·h)],即單位質(zhì)量單位時(shí)間過(guò)濾的餌料細(xì)胞數(shù);V為食物溶液體積(L);W為實(shí)驗(yàn)貝軟組織的質(zhì)量(g);N為實(shí)驗(yàn)貝數(shù);Ctf為實(shí)驗(yàn)瓶中的剩余食物量(個(gè)/L);C0為起始食物量(個(gè)/L);Ct為對(duì)照瓶中的最終食物量(個(gè)/L);t為攝食時(shí)間(h).(4)角褐脂藻的飼養(yǎng)選取經(jīng)馴化飼養(yǎng)的、大小均一的90只貽貝,分3組,分別投喂不同體積比混合的利瑪原甲藻和三角褐脂藻(0∶100,30∶70,70∶30),相應(yīng)藻密度與1.3(3)節(jié)相同.3d后全部喂飼三角褐脂藻,繼續(xù)飼養(yǎng)3d.實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)每天取貝樣,每組6只.迅速開(kāi)殼,摘取鰓組織,并將其分成2份.一份置于含Sampleprotector的EP管中,5min后放入-80℃冰箱保存.一份保存于-20℃冰箱用于毒素的分析.(5)毒素含量測(cè)定毒素的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫試劑盒.取1g貝組織與體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇混勻、離心,取上清,定容到10mL.取其中的10μL,用樣品稀釋液稀釋到1mL.加入100μL稀釋樣品到檢測(cè)孔中(標(biāo)準(zhǔn)和樣品均做3個(gè)平行),依次加入50μL的酶偶聯(lián)液、抗體溶液,轉(zhuǎn)勻,室溫孵育1h.用洗液洗3次,在吸水紙上拍干,加入150μL底物溶液,室溫孵育30min,加入100μL停止液,450nm下讀板,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品中毒素的含量.(6)pcr擴(kuò)增條件的確定采用Trizol法提取鰓組織總RNA,用體積分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性.cDNA合成總體系25μL:1～5ngRNA,1μLRandomprimer,65℃15min,冰浴5min;然后加入5μL10mmol/LdNTP,5μL5×buffer,0.5μLRibonucleaseinhibitor,1μLMMLVReverseTranscriptaseRnaseH,5.5μLRNase-freeH2O.混勻,42℃溫浴1h,99℃5min使酶滅活.用于HSP70擴(kuò)增的引物參考文獻(xiàn),上游引物為:GACTTGGGTGGTGGAAC,下游引物為:GGCTACAGCTTCATCAGGG,片段大小為516bp.18SrRNA作為內(nèi)參,引物參考文獻(xiàn),上游引物:GGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCCTG,下游引物:GATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACC,片段大小為1700bp.PCR反應(yīng)體系20μL,上下游引物各0.5μL,10×LATaqbuffer2μL,LATaq酶0.2μL,cDNA2μL,雙蒸水14.8μL.為保證PCR擴(kuò)增在線性范圍內(nèi)進(jìn)行,需首先確定合適的模板量與PCR循環(huán)數(shù).根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,18S的擴(kuò)增條件確定為:模板量4ng;94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min,共30個(gè)循環(huán).最后1個(gè)循環(huán)后于72℃延伸10min.HSP70的反應(yīng)條件為:模板量8ng;94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,55℃退火40s,72℃延伸40s,共30個(gè)循環(huán).最后1個(gè)循環(huán)后于72℃延伸10min.擴(kuò)增產(chǎn)物用體積分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳后成像.2結(jié)果2.1不同投喂材料對(duì)貽貝濾食率的影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,翡翠貽貝死亡2只,對(duì)照組(0∶100)和實(shí)驗(yàn)組各1只.喂養(yǎng)毒藻的實(shí)驗(yàn)組均未觀察到明顯的不良反應(yīng).圖1為喂飼利瑪原甲藻后翡翠貽貝濾食率的變化情況.從圖中可以看出,隨著投喂毒藻在混合藻液中比例的增加,貽貝對(duì)藻細(xì)胞的濾食率明顯降低,呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系.對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)各組的濾食率分別為1.43×105、1.24×105、0.82×105、0.54×105、0.32×105/(g·h).表明利瑪原甲藻可顯著抑制貝類的濾食,這可能是貝類為減少毒藻暴露而采取的一種保護(hù)性行為.2.2兩組各克氏原螯蝦dsp的質(zhì)量分?jǐn)?shù)DSP在貽貝鰓組織中的累積與排出情況如圖2所示.從圖中可以看出,前3d翡翠貽貝鰓組織中DSP毒素顯著增加,呈明顯的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系.第2、3天時(shí),30∶70實(shí)驗(yàn)組鰓組織中DSP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為164.5、216.5ng/g;70∶30實(shí)驗(yàn)組分別為182.4、254.8ng/g;均明顯高于對(duì)照組(0∶100)(P<0.05).后3d,貽貝體內(nèi)毒素含量顯著下降.最后1d時(shí),毒素水平下降至染毒第一天的水平,表明貽貝排出毒素的能力比較強(qiáng).需要說(shuō)明的是,即使未染毒貝,鰓組織中也有一定的毒素檢出,表明貝自身已在自然海域中染毒,只是毒素濃度較低而已.這與楊莉等的調(diào)查結(jié)果是一致的,說(shuō)明廣東沿海貝類DSP毒素污染狀況比較嚴(yán)重.3.3hsp60基因表達(dá)量的檢測(cè)根據(jù)確定的PCR條件,以18S為內(nèi)參對(duì)HSP70基因進(jìn)行半定量RT-PCR分析,結(jié)果如圖3所示.進(jìn)一步用Bandscan軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行半定量分析,結(jié)果如圖3、表1所示.從圖表可以看出,隨著毒素的累積HSP70表達(dá)顯著增加,并于第2天達(dá)到高峰,30∶70實(shí)驗(yàn)組和70∶30實(shí)驗(yàn)組表達(dá)分別是對(duì)照組的4.89、6.31倍.后3d,隨著毒素從體內(nèi)逐漸清除,HSP70基因表達(dá)量呈降低的趨勢(shì).3討論3.1利瑪原甲藻的濾食率許多研究證實(shí),短期暴露于有毒甲藻中時(shí),貝類的濾清率(或攝食率)會(huì)顯著下降.朱明遠(yuǎn)等指出,給櫛孔扇貝全喂PSP產(chǎn)毒藻微小亞歷山大藻比全喂三角核脂藻的濾食率降低了1倍;Bauder等的研究結(jié)果顯示,海灣扇貝濾食率隨著利瑪原甲藻的濃度升高呈降低趨勢(shì).一般而言,對(duì)毒素敏感的貝類往往排斥作用較強(qiáng),毒素積累比較少;相反,對(duì)毒素不敏感的貝類往往對(duì)毒素有較高的累積能力,毒素的排出也慢.貝類暴露于產(chǎn)毒藻細(xì)胞時(shí),濾清率的變化可直接反映出該貝對(duì)毒素的敏感性,并能指示隨后的毒素積累情況.本研究發(fā)現(xiàn),翡翠貽貝暴露于產(chǎn)毒利瑪原甲藻后,其濾食率顯著下降,存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系,表明翡翠貽貝對(duì)DSP毒素比較敏感.3.2利瑪原甲藻的監(jiān)控不同貝類對(duì)DSP毒素的積累能力和排出能力不同.Viviani等研究指出,特定海域中,紫貽貝最易積累DSP毒素,體內(nèi)毒素累積最高;扇貝體內(nèi)次之,牡蠣體內(nèi)毒素積累最少.Bauder等觀察發(fā)現(xiàn),用105/L的利瑪原甲藻喂養(yǎng)海灣扇貝(Argopectenirradians)2d,鰓中DSP貝毒的累積最高為0.2μg/g;本研究顯示,翡翠貽貝喂食利瑪原甲藻后,第3天可達(dá)254.8ng/g,與海灣扇貝情況類似.一般而言,貝類中毒素的清除速率由快到慢,特別是前3d排出速率相對(duì)較快,而后轉(zhuǎn)入緩慢的排毒階段.Bricelj和Shumway按照毒素排除速率,將雙殼貝類劃分為慢速排毒者(排除率≤3%),快速排毒者(3%<排除率<15%).本研究發(fā)現(xiàn),翡翠貽貝體內(nèi)DSP的排除率平均12%.按照這一標(biāo)準(zhǔn),應(yīng)屬快速排毒者.說(shuō)明翡翠貽貝對(duì)利瑪原甲藻敏感性高,能通過(guò)自凈逐漸排除毒素.3.3hsp70表達(dá)變化熱激蛋白70廣泛分布于各種生物體內(nèi),具有短時(shí)性、高度的保守性、多樣性等特點(diǎn),具有分子伴侶功能,使生物獲得耐熱性、調(diào)控細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)及調(diào)控基因表達(dá)(即上調(diào)修復(fù)機(jī)制)等,可作為機(jī)體受到環(huán)境脅迫的標(biāo)記.目前有關(guān)環(huán)境脅迫誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)研究主要在蛋白表達(dá)水平上,mRNA水平上研究甚少.研究表明,雙殼貝類35℃熱激1h后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),HSP70表達(dá)量明顯上升,但1h出現(xiàn)短暫的降低,3h表達(dá)水平最高,24h后表達(dá)水平居高不下;暴露于0.75μmol/LHg2+6d,8h時(shí)HSP70表達(dá)水平均達(dá)到最高,6d后恢復(fù)正常水平;注射細(xì)菌Vibrioanguillarum后,48h時(shí)HSP70表達(dá)水平最高;而暴露于有機(jī)汞時(shí),HSP70表達(dá)水平表達(dá)受到顯著抑制.本研究探討了翡翠貽貝暴露于不同水平