不同方法提取卵黃抗體的對(duì)比

隨著禽畜業(yè)的迅速發(fā)展，其規(guī)模化程度越來越高，抗生素濫用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性及抗生素殘留問題也越來越突出。加快尋找和使用其他安全可靠的產(chǎn)品來取代抗生素成為行業(yè)亟待解決的問題。雞源性的卵黃免疫球蛋白被認(rèn)為是一類非常重要的免疫物質(zhì)，其作用機(jī)制在于，可以抵御外界的病毒，并且可以促進(jìn)免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)作[1]，其作用機(jī)制主要表現(xiàn)在促進(jìn)免疫反應(yīng)，如促進(jìn)免疫系統(tǒng)的活性和免疫耐受性，減少病毒的傳播，防止病毒的蔓延。除了具備抵御病毒感染的能力，卵黃抗體也被證實(shí)是一種非常有效的毒素抑制劑，它的穩(wěn)定性極佳，特異性極強(qiáng)[2]，完全沒毒，沒有任何殘余，也沒有出現(xiàn)任何耐藥現(xiàn)象，而且它還能夠提升機(jī)體的免疫力，因而，它已經(jīng)成為動(dòng)物的健康監(jiān)測(cè)、預(yù)防與治療的首選手段[3]。隨著卵黃抗體的持續(xù)發(fā)展，它的獨(dú)特性、療效顯著超越了傳統(tǒng)的抗生素，成為一種可以快速獲得、精確分析、低毒副反應(yīng)、安全可靠的新一代“抗生素”。它的出現(xiàn)，使得抗生素的使用更加安全、環(huán)保，在畜牧業(yè)中發(fā)揮著越來越重要的作用[4]。在雞蛋黃中，蛋白質(zhì)和脂肪的比例通常在1∶2之間，而這些物質(zhì)的組成主要由蛋白質(zhì)和脂肪組成的脂蛋白。然而，這些脂蛋白很難被水解，而磷脂和不飽和脂肪酸也容易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而使得抗體的有效性受到影響，因此，給動(dòng)物注入發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的抗體可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物的死亡。由此去除卵黃抗體的脂蛋白和脂質(zhì)是至關(guān)重要的，若無法有效地去除這些成分，將可能導(dǎo)致其應(yīng)用于動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中，從而造成極其危險(xiǎn)的后果[5]。因此，有效地去除這些成分變得至關(guān)緊迫。在這項(xiàng)研究中，我們使用了多種技術(shù)來提純卵黃抗體，并對(duì)它們的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)進(jìn)行了全面的評(píng)估，旨在尋求最佳的技術(shù)，并將這些結(jié)果應(yīng)用于未來的生產(chǎn)實(shí)際[6]。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料及儀器tg16g臺(tái)式高速離心機(jī)、10~100μl8道移液器、96孔V型微量板、XK96-3型微量振蕩器以及北京勃林格殷格翰的高免蛋雞，均按照常規(guī)的雞類免疫程序進(jìn)行了處理，以滿足實(shí)驗(yàn)需求。1.2主要試劑新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原（批號(hào)：202111、中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）、禽流感H9亞型標(biāo)準(zhǔn)抗原（批號(hào)：2021001、哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司）、辛酸（批號(hào)：20201210、國(guó)藥集團(tuán)）、無水乙酸鈉（批號(hào)：20211111、國(guó)藥集團(tuán)）、三氯甲烷（批號(hào)：20210720、天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、PBS緩沖液（干粉）（批號(hào)：PM31132120、coolaber）、鹽酸分析純（批號(hào)：20190123、天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、乙酸分析純（批號(hào)：20171119、天津市福晨化學(xué)試劑）、75%乙醇（批號(hào)：20221129、山東福爾特消毒制品有限公司）。1.3試驗(yàn)方法為了確保產(chǎn)品的安全，我們需要對(duì)所有的雞蛋進(jìn)行處理。我們需要把它們放在42℃的0.1%新潔爾滅溶液中浸泡15min，接著，我們需要使用75%的乙醇來徹底洗滌，以消滅它們的細(xì)菌。最終，我們需要把它們分開，分離出蛋清和蛋黃，丟棄蛋清，只保留蛋黃。接下來，我們就要按照如下步驟來提取卵黃抗體[7]。（1）酸化水提取法：將卵黃和純化水按照1∶8的體積混合，即1mL卵黃+8mL純化水，震蕩均勻，用20%的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為5.2，4℃靜置6h，然后4℃、10000r/min離心25min，棄掉沉淀，收集上清液即可[8]。（2）氯仿萃取法：將卵黃和PBS緩沖液（pH7.5）按照1：8的體積混合，再加入同體積的三氯甲烷。即1mL卵黃+8mLPBS緩沖液，混合均勻，加入9mL三氯甲烷，振蕩均勻，4℃、10000r/min離心30min，取上層清液即可[9]。（3）將卵黃液和乙酸鈉緩沖液按1∶8的比例混合，1mL卵黃液和8mL乙酸鈉緩沖液混勻，再加入25%的辛酸，攪拌30min，最后以6000r/min的速度離心20min。將沉淀物拋棄，取出上層清澈的液體[10]。（4）安檢試驗(yàn)：我們從10日齡的SPF雞中挑選出40只，將它們隨機(jī)地劃分到4組，其中第3組接受免疫，第4組作為對(duì)照。我們將SPF雞按順序接種卵黃抗體，而另一組接種了與之相當(dāng)?shù)纳睇}水，最終將它們置于相同的環(huán)境中，通過14d的持續(xù)監(jiān)測(cè)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。（5）抗體效價(jià)檢測(cè)①血凝試驗(yàn)：將96孔的微量板放置，從第1孔到第12孔中添加0.1MPBS0.025mL，在第1孔中添加0.025mL的血凝素標(biāo)準(zhǔn)抗原，接著按順序進(jìn)行2倍的稀釋，一直到第12孔。棄去第12孔的稀釋液，并設(shè)置紅細(xì)胞對(duì)照孔，然后從第1孔到第12孔加入1%雞紅細(xì)胞懸液0.025mL，在振蕩器上混合均勻后，在10~30℃的環(huán)境下，靜置20~40min，到對(duì)照孔中的紅細(xì)胞呈顯著紐扣形態(tài)，即可確認(rèn)結(jié)果，使其100%的凝集的稀釋度，確認(rèn)為其凝集價(jià)。②血凝抑制試驗(yàn)：通過血凝素的凝集價(jià)，我們可以確定4HAU抗原。如果我們的凝集價(jià)值是1∶1024，那么我們可以得出4HAU抗原是1∶256。將1mL血凝素和9mL緩沖液混合在一起，使其成1∶10稀釋的混合液，取1∶10稀釋液1mL添加至24.6mL0.1Mol/LPBS緩沖液中，以達(dá)到1∶256的濃度。將待檢樣品取出，在96孔微量板分別標(biāo)記待檢樣品、病毒對(duì)照、紅細(xì)胞對(duì)照，取出3個(gè)加樣槽，分別標(biāo)記0.1mol/LPBS、4HAU、1%雞紅細(xì)胞懸液。從第1孔至第12孔，在待檢樣品組及病毒對(duì)照組中，每孔加入0.1mol/LPBS0.025mL，紅細(xì)胞對(duì)照組每孔加入0.1mol/LPBS0.05mL，使用移液器將被檢樣品混合均勻，然后加入第1孔中，進(jìn)行2倍背比稀釋，稀釋倍數(shù)依次為2、4、8、16...和4096孔，將4HAU的血凝素和1%的雞紅細(xì)胞懸液分別添加到待檢的樣本和病毒對(duì)照的試驗(yàn)孔內(nèi)，并將其放置于微量振蕩器震蕩均勻，在10~30℃的環(huán)境溫度下放置20~40min。然后每孔再加入1%雞紅細(xì)胞懸液0.025mL，同樣的環(huán)境溫度下放置20~40min，當(dāng)對(duì)照孔中的紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)即可開始判定結(jié)果。使紅細(xì)胞100%凝集抑制的樣品最高稀釋度為判定終點(diǎn)（凝集抑制價(jià)）。2結(jié)果與分析（1）通過本次實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，不同的提取方法會(huì)導(dǎo)致卵黃抗體的物理性質(zhì)發(fā)生變化。我們通過觀察提取液的顏色、氣味、透明度和體積，發(fā)現(xiàn)這些變化。具體情況可以參考表1和表2。表1使用不同方法提取卵黃抗體時(shí)的物理特征表23種方法提取卵黃抗體的體積由表1可知，酸化水提取的卵黃抗體具有良好的透明度，而辛酸法提取的卵黃抗體則存在一定的氣味，其中以氯仿法的效果最佳，但也會(huì)帶來一股刺鼻的氯仿氣味。由表2可知，本試驗(yàn)采取的3種提取卵黃抗體的方法中，用相同體積的卵黃原液，以氯仿萃取法提取的卵黃抗體量最多，其次為酸化水提取法，而辛酸法提取的抗體量最少。（2）安檢試驗(yàn)：通過觀察SPF雞的存活情況，發(fā)現(xiàn)14d后，3組免疫雞與對(duì)照組SPF雞一樣，均存活。這一情況表明，通過3種不同提取方法得到的卵黃抗體均對(duì)動(dòng)物機(jī)體無毒害作用，安全可靠。（3）通過對(duì)3種不同提取方法獲得的卵黃抗體進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)它們的抗體效價(jià)存在顯著差異，具體情況可參見表3。表33種方法提取卵黃抗體效價(jià)的對(duì)比由表3可知，本試驗(yàn)采取的3種提取卵黃抗體的方法中，氯仿萃取法得到的抗體，無論是新城疫還是禽流感，其效價(jià)最高，酸化水提取法略低于氯仿萃取法，而辛酸法的抗體效價(jià)最低。3小結(jié)與討論在這項(xiàng)研究工作中，本課題組認(rèn)為氯仿萃取法在提煉卵黃抗體時(shí)具有顯著的優(yōu)勢(shì)，它的提取速度快，體積大，溶解度良好，但是萃取劑三氯甲烷具有潛在的危險(xiǎn)，可導(dǎo)致嚴(yán)重的副反應(yīng)，包括嘔吐、消化不良、食欲不振和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，甚至可能導(dǎo)致病變。由于抗體的殘留可能會(huì)給動(dòng)物的健康帶來潛在的危險(xiǎn)，所以，應(yīng)當(dāng)采取措施避免這些情況的出現(xiàn)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，抗體的殘余可能影響酶標(biāo)板的吸附能力，從而使得ELISA檢測(cè)出現(xiàn)偽陽性，從而影響最終的診斷精度。酸化水提取法的提取率僅次于氯仿萃取法，且物理性狀較好，雖然抗體效價(jià)略低，但是后期如果用于生產(chǎn)，可以在生產(chǎn)過程中采用超濾濃縮技術(shù)，即可提高卵黃抗體效價(jià)。盡管辛酸法的抗體提取效率不高，抗體數(shù)量較少，抗體效價(jià)也不及其他兩種技術(shù)，然而，根據(jù)相關(guān)研究，它能夠更加準(zhǔn)確地清除卵黃脂類，并且由于辛酸的溶解度很高，因此，它的殘留量幾乎可以忽略不計(jì)，對(duì)動(dòng)物機(jī)體不會(huì)造成毒害作用[11]。經(jīng)過系統(tǒng)的研究，酸化水提取法在提取卵黃抗體方面具備了許多優(yōu)勢(shì)：操作簡(jiǎn)便、提取效果顯著、提取質(zhì)量?jī)?yōu)良、化學(xué)試劑消耗量小、提取過程中沒有任何危害，而且提取出來的抗體質(zhì)量更加穩(wěn)定，并且提取過程也更加便捷，提取的卵黃抗體質(zhì)量更加優(yōu)良，因此，它具備了大范圍的應(yīng)用前景。同時(shí)辛酸法去除脂類效果好，故而綜合考慮，酸化水提取法結(jié)合辛酸法是大規(guī)模生產(chǎn)最好的選擇[12]。4展望根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號(hào)公告，規(guī)定了從2020年元旦開始，我們將嚴(yán)格禁止飼料中抗生素的使用，以防止抗生素的過度使用帶來的危害。卵黃抗體是一種更具安全性、可靠性和療效的抗菌劑，近年來已經(jīng)被廣泛地運(yùn)用于生物技術(shù)、醫(yī)療保健和食品工業(yè)[13]。卵黃抗體具備的優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面：①制備原材料簡(jiǎn)單、只需收集高免蛋即可，無需采血，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體不會(huì)造成傷害[14]。②免疫蛋雞的飼養(yǎng)成本相對(duì)較低，只需要少量的資源，就能夠獲得高品質(zhì)的特異性卵黃抗體。③抗體的制備過程也相對(duì)簡(jiǎn)單，無需使用復(fù)雜的儀器設(shè)備，因此生產(chǎn)成本也相對(duì)較低。④由于不與蛋白A、G和Fc受體結(jié)合，因此在進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)時(shí)，可以避免出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性[15]。⑤卵黃抗體化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、耐熱、耐酸，在60℃巴氏滅菌溫度下活性不會(huì)下降，在室溫下可存放4個(gè)月，2~8℃可存放數(shù)十年