授課用-高分辨率溶解曲線資料課件

高分辨率溶解曲線內容提示高分辨熔解曲線（HighResolutionMelting）高分辨熔解曲線在遺傳育種中的應用

—篩查突變（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+內標法（SmallAmpliconGenotyping）

—非標記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—檢測甲基化HRM儀器HighResolutionDNAMelting（HRM)是基于有序列變化的Amplicon之間微弱的Tm值差異，通過DNA片段熔解曲線的差異進行突變檢測，比如：PCRTube1Tube2Tube3WildtypeHomozygoteHeterozygoteLightScanner突變檢測原理Lightscanner高分辨溶解曲線結果SaturatingdyeLCGreenplus——高分辨溶解曲線專用熒光染料內容提示高分辨熔解曲線（HighResolutionMelting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應用

—篩查突變（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+內標法（SmallAmpliconGenotyping）

—非標記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—檢測甲基化HRM儀器MutationScanning未知SNP掃描等對北京油雞CAPN1基因外顯子進行掃描，篩查其潛在SNPs。BernhardJ.HoWnger·Hai-ChunJing·KimE.Hammond-Kosack·KostyaKanyuka(BarleyApplication)TheorApplGenet()119:851–865數據來自英國洛桑農業(yè)實驗站Bernhard等對Barley的eukaryotictranslationinitiationfactor4E(eIF4E)gene基因外顯子進行突變掃描結果高分辨熔解曲線在遺傳育種中的應用1Probe–1SNP,AllPossibleSNPsApplicationoghigh-resolutionDNAmeltingforgenotypingandvariantscanningofdiploidandautotetraploidpotatoMolBreeding()Applicationoghigh-resolutionDNAmeltingforgenotypingandvariantscanningofdiploidandautotetraploidpotatoMolBreeding()7%（<400bp）Heterozygote高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應用2Probes,2SNPs,2Amplicons-HFE—檢測甲基化時間大約2小時（包含試劑準備）RosarioMuleo（）等用HRM方法對三個品種的SSRDCA4進行分析，DCA4的等位基因有131bp的重復序列，雜合等位基因的序列為131-133bp，分析結果如圖8所示，HRM曲線可以將純合樣品和雜合樣品明顯的區(qū)分，其中一個等位基因只相差2bp?！∑?內標法（SmallAmpliconGenotyping）Hammond-Kosack·KostyaKanyukaLightScanner突變檢測原理高分辨熔解曲線在遺傳育種中的應用—非標記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）—檢測甲基化內容提示高分辨熔解曲線（HighResolutionMelting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應用

—篩查突變（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+內標法（SmallAmpliconGenotyping）

—非標記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—檢測甲基化HRM儀器SmallAmpliconGenotyping擴增小片段直接進行基因型鑒定使用已知Tm值的雙鏈DNA做溫度內標，低溫內標Tm(~61℃),高溫內標Tm(~92℃)內標能夠實現96/384孔板的溫度均一矯正。PCR片段的Tm值范圍：70-88℃優(yōu)點：不需要探針，直接利用PCR產物針對已知突變位點進行基因分型為何要使用溫度內標A>TSNPwithoutCalibration–72bpApplyTemperatureCalibrationA>TSNPwithCalibrationSmallAmpliconGenotyping等對北京油雞A-FABP基因進行小片段法基因分型，擴增片段為56bp，灰色曲線顯示的是雜合型（CT），藍顏色和紅顏色曲線分別代表純合型CC和TT。內容提示高分辨熔解曲線（HighResolutionMelting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應用

—篩查突變（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+內標法（SmallAmpliconGenotyping）

—非標記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—檢測甲基化HRM儀器HRM–LunaprobegenotypingHRM–Lunaprobegenotyping1Probe–1SNP,AllPossibleSNPs1Probe–1SNP,AllPossibleSNPsClass1C:T,G:AClass2C:A,G:TClass3C:GClass4A:T1Probe,2SNPs,1Amplicon重復性—LightScanner重復性100%Genome52:252-260MixRR:Rrby1:1RRRr1Probe–1SNP,AllPossibleSNPs在PCR反應前加入LCGreen熒光染料檢測未知及已知突變準確性100%、特異性92.Class1C:T,G:ALightScanner96/384—小片段+內標法（SmallAmpliconGenotyping）Genome52:252-2602Probes,2SNPs,2Amplicons-HFERosarioMuleo（）等用HRM方法對三個品種的SSRDCA4進行分析，DCA4的等位基因有131bp的重復序列，雜合等位基因的序列為131-133bp，分析結果如圖8所示，HRM曲線可以將純合樣品和雜合樣品明顯的區(qū)分，其中一個等位基因只相差2bp。MutationScanning高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應用7%（<400bp）2Probes,2SNPs,1Amplicon-ApoE2Probes,2SNPs,2Amplicons-HFEAmpliconScanning–發(fā)現新的突變DavidDe，YongSongatel.Applicationoghigh-resolutionDNAmeltingforgenotypingandvariantscanningofdiploidandautotetraploidpotatoMolBreeding()25:67–90rrRRRrMixRr:rrby1:1RrrrMixRR:Rrby1:1RRRr內容提示高分辨熔解曲線（HighResolutionMelting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應用

—篩查突變（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+內標法（SmallAmpliconGenotyping）

—非標記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—檢測甲基化HRM儀器RosarioMuleo（）等用HRM方法對三個品種的SSRDCA4進行分析，DCA4的等位基因有131bp的重復序列，雜合等位基因的序列為131-133bp，分析結果如圖8所示，HRM曲線可以將純合樣品和雜合樣品明顯的區(qū)分，其中一個等位基因只相差2bp。三種顏色（淺灰，深灰、黑色）表明3種不同的品種。RosarioMuleo等得出結論：HRM是一種快速、重復性高、成本低，操作簡單，且可以應用于其他物種的SNP檢測及SSR基因分型的方法。RosarioMuleo,MarirChiaraColao,DarioMianoatel.Genome52:252-260內容提示高分辨熔解曲線（HighResolutionMelting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應用

—篩查突變（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+內標法（SmallAmpliconGenotyping）

—非標記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—檢測甲基化HRM儀器內容提示高分辨熔解曲線（HighResolutionMelting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應用

—篩查突變（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+內標法（SmallAmpliconGenotyping）

—非標記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—檢測甲基化HRM儀器2005LightScanner96/38496/384孔板~8分鐘/板~2-6秒/樣品溫度均一性：

oC數據采集速度：大于100pts/秒升溫速度：oC/秒

LS3232樣品轉盤,玻璃毛細管HRM檢測60分鐘內完成定量PCR和HRM檢測HRM檢測升溫速度可以在0.05～oC/秒之間調節(jié)在升溫速度小于≤℃/秒時，溫度均一性：±oC數據采集速度：20pts/秒～400pts/秒（與升溫速度有關）oC/秒升溫速度=67pts/℃oC/秒升溫速度=400pts/℃LightScanner高分辨溶解曲線應用LunaProbes非標記探針基因分型未知SNP掃描SmallAmplicon小片段基因分型HRM分析流程在PCR反應前加入LCGreen熒光染料時間大約2小時（包含試劑準備）在LightScanner上進行高分辨溶解曲線分析大約需要5-10分鐘數據分析和