【知識(shí)精講精研】高三生物一輪復(fù)習(xí)課件微生物培養(yǎng)與發(fā)酵工程

生物學(xué)技術(shù)與工程專題第一講：微生物的培養(yǎng)與發(fā)酵工程第二講：細(xì)胞工程與胚胎工程第三講：基因工程

·上第四講：基因工程

·下第五講：酶工程、凝膠電泳與色譜、DNA粗提與鑒定等01.培養(yǎng)基02.無(wú)菌技術(shù)03.微生物的培養(yǎng)04.發(fā)酵工程本節(jié)看點(diǎn)1.理解代謝類型不同微生物的培養(yǎng)要求2.區(qū)分碳源與能源的差異3.區(qū)分選擇培養(yǎng)基與鑒別培養(yǎng)基微生物的代謝類型微生物：一般指直徑小于0.1mm的生物營(yíng)養(yǎng)類型碳源能源舉例光能自養(yǎng)型化能自養(yǎng)型異養(yǎng)型氧化NH3

NO2?

氧化

? NO3附：硝化細(xì)菌的自養(yǎng)方式C6H12O6

合成放能放能CO2光能藍(lán)藻等CO2化學(xué)能硝化細(xì)菌、硫化細(xì)菌等有機(jī)物化學(xué)能真菌、病毒、原生動(dòng)物等培養(yǎng)基的化學(xué)成分成分作用碳源無(wú)機(jī)碳源：

CO2，

NaHCO3等①用于合成微生物的細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物②異養(yǎng)型微生物的主要能源物質(zhì)有機(jī)碳源：糖類，脂肪酸等注意：

碳源

≠

能源如光能自養(yǎng)型微生物(藍(lán)藻)的培養(yǎng)中，

CO2作為碳源，但其能源來(lái)自于光能培養(yǎng)基的化學(xué)成分成分作用碳源無(wú)機(jī)碳源：

CO2，

NaHCO3等①用于合成微生物的細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物②異養(yǎng)型微生物的主要能源物質(zhì)有機(jī)碳源：糖類，脂肪酸等氮源無(wú)機(jī)氮源：

N2，

NH3

，硝酸鹽等用于合成蛋白質(zhì)、核酸和含氮的代謝產(chǎn)物有機(jī)氮源：尿素，牛肉膏蛋白胨等牛肉膏：

是采用新鮮牛肉經(jīng)過(guò)剔除脂肪、消化、過(guò)濾、濃縮而得到的一種棕黃色至棕褐色的膏狀物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黃色蛋白胨：

將肉、酪素或明膠用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外觀呈淡黃色的粉劑，具有肉香的特殊氣息。蛋白質(zhì)經(jīng)酸、堿或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨注意：1.

某些微生物可以利用氮源作為能源，如硝化細(xì)菌2.某些既含碳元素又含氮元素的物質(zhì)(如牛肉膏蛋白胨等)可以同時(shí)提供碳源和氮源3.

牛肉膏主要為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素培養(yǎng)基的化學(xué)成分成分作用碳源無(wú)機(jī)碳源：

CO2，

NaHCO3等①用于合成微生物的細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物②異養(yǎng)型微生物的主要能源物質(zhì)有機(jī)碳源：糖類，脂肪酸等氮源無(wú)機(jī)氮源：

N2，

NH3

，硝酸鹽等用于合成蛋白質(zhì)、核酸和含氮的代謝產(chǎn)物有機(jī)氮源：尿素，牛肉膏蛋白胨等水H2O①作為溶劑溶解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)②調(diào)節(jié)溶液濃度，維持滲透壓③為培養(yǎng)對(duì)象的生存提供相應(yīng)的水環(huán)境無(wú)機(jī)鹽磷酸鹽，

硫酸鹽，

鉀

、鈣，

鈉，

鎂，鐵等鹽類①維持滲透壓②維持生物大分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性③某些微生物的生長(zhǎng)能源物質(zhì)鐵細(xì)菌：

一類生活在含有高濃度二價(jià)鐵離子的池塘、湖泊、溫泉等水域中，能將二價(jià)鐵鹽氧化成三價(jià)鐵化合物，并能利用此氧化過(guò)程中產(chǎn)生的能量來(lái)同化二氧化碳進(jìn)行生長(zhǎng)的細(xì)菌的總稱培養(yǎng)基的化學(xué)成分成分作用碳源無(wú)機(jī)碳源：

CO2，

NaHCO3等①用于合成微生物的細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物②異養(yǎng)型微生物的主要能源物質(zhì)有機(jī)碳源：糖類，脂肪酸等氮源無(wú)機(jī)氮源：

N2，

NH3

，硝酸鹽等用于合成蛋白質(zhì)、核酸和含氮的代謝產(chǎn)物有機(jī)氮源：尿素，牛肉膏蛋白胨等水H2O①作為溶劑溶解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)②調(diào)節(jié)溶液濃度，維持滲透壓③為培養(yǎng)對(duì)象的生存提供相應(yīng)的水環(huán)境無(wú)機(jī)鹽磷酸鹽，

硫酸鹽，

鉀

、鈣，

鈉，

鎂，鐵等鹽類①維持滲透壓②維持生物大分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性③某些微生物的生長(zhǎng)能源物質(zhì)生長(zhǎng)因子維生素、氨基酸、堿基、嘌呤、嘧啶、生物素、煙酸等一般是酶和核酸的組成成分注意：

培養(yǎng)基中必須具備生長(zhǎng)因子，但未必需要“單獨(dú)添加”培養(yǎng)基的類型液體培養(yǎng)基：主要用于工業(yè)生產(chǎn)、擴(kuò)大化培養(yǎng)及動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不加凝固劑固體培養(yǎng)基：主要用于微生物的分離、純化、鑒定、計(jì)數(shù)等加入較多的凝固劑，如瓊脂或明膠半固體培養(yǎng)基：

主要用于觀察微生物的運(yùn)動(dòng)加入較少的凝固劑物理狀態(tài)天然培養(yǎng)基：如牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基、鋸末培養(yǎng)基、牛糞培養(yǎng)基等人工合成培養(yǎng)基：

如MS培養(yǎng)基等化學(xué)成分培養(yǎng)基的類型——依照功能分類根據(jù)微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)需求配制培養(yǎng)基或加入某種化學(xué)物質(zhì)，允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)常用于培養(yǎng)、分離特定微生物※

選擇培養(yǎng)基

※類型1

：根據(jù)微生物特殊營(yíng)養(yǎng)需求1.

以纖維素為唯一碳源——分離纖維素分解菌2.

以尿素為唯一氮源——分離尿素分解菌3.

缺乏單獨(dú)添加氮源——分離固氮菌類型2：加入化學(xué)物質(zhì)抑制或殺死其他微生物1.

加入青霉素——分離真菌2.

加入高濃度食鹽——分離金黃色葡萄球菌3.

加入10%酚——分離放線菌培養(yǎng)基的類型——依照功能分類培養(yǎng)基中加特定化學(xué)物質(zhì)，某種微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物可與培養(yǎng)基中化學(xué)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生特征性變化主要用于微生物快速分類鑒定和篩選產(chǎn)生某種

代謝產(chǎn)物的微生物菌種※

鑒別培養(yǎng)基

※加入顯色指示劑或顯形指示劑如伊紅-美藍(lán)、剛果紅、酚紅、明膠等鑒別不同種類微生物圖為伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌效果培養(yǎng)基的類型——依照功能分類常見(jiàn)的鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基名稱用途加入化學(xué)物質(zhì)微生物代謝產(chǎn)物培養(yǎng)基特性變化伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基鑒別大腸桿菌伊紅、美藍(lán)酸性物質(zhì)黑色剛果紅培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌剛果紅纖維素酶透明圈酚紅培養(yǎng)基鑒別尿素分解菌酚紅脲酶培養(yǎng)基變紅明膠培養(yǎng)基鑒別產(chǎn)蛋白酶菌株明膠胞外蛋白酶明膠液化纖維素分解菌釋放纖維素酶分解菌落周邊纖維素使其變?yōu)槠咸烟枪┳陨砝米⒁猓骸巴该魅Α钡睦斫馀c使用剛果紅

+

纖維素

=

紅色AB透明圈半徑菌落半徑越大效果越好培養(yǎng)基配置的基本原則細(xì)菌、放線菌——6.5~7.5酵母菌、霉菌——4.5~6營(yíng)養(yǎng)全面、協(xié)調(diào)：碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子目的明確：分離？鑒別？選擇？擴(kuò)大化培養(yǎng)？控制pH條件配制原則滅菌處理01.培養(yǎng)基02.無(wú)菌技術(shù)03.微生物的培養(yǎng)04.發(fā)酵工程本節(jié)看點(diǎn)1.理解滅菌與消毒的核心區(qū)別2.理解常見(jiàn)的滅菌與消毒操作無(wú)菌技術(shù)項(xiàng)目條件結(jié)果常用方法應(yīng)用范圍消毒較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部部分對(duì)人體有害的微生物不包括芽孢和孢子煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高溫的液體化學(xué)藥劑消毒法用75%酒精擦拭雙手用氯氣消毒水源等芽孢又稱內(nèi)生孢子，是細(xì)菌休眠體。芽孢含水量極低，抗逆性強(qiáng)，能經(jīng)受高溫、紫外線，電離輻射以及多種化學(xué)物質(zhì)滅殺等孢子是脫離親本后能直接或間接發(fā)育成新個(gè)體的生殖細(xì)胞。它是有絲分裂或減數(shù)分裂的產(chǎn)物；多數(shù)為單倍體，少數(shù)為二倍體芽孢外膜芽孢殼核芯皮層芽孢壁芽孢內(nèi)膜無(wú)菌技術(shù)項(xiàng)目條件結(jié)果常用方法應(yīng)用范圍滅菌強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有微生物包括芽孢和孢子濕熱滅菌法(高壓蒸汽滅菌法)培養(yǎng)基及容器的滅菌干熱滅菌法玻璃器皿及金屬工具灼燒滅菌法接種工具干熱滅菌箱干熱滅菌：

160?170

℃下加熱1?2h高壓蒸汽滅菌鍋100kPa

、121℃下維持15?30min。灼燒滅菌(酒精燈)01.培養(yǎng)基02.無(wú)菌技術(shù)03.微生物的培養(yǎng)04.發(fā)酵工程本節(jié)看點(diǎn)1.理解培養(yǎng)基的配制流程2.理解單菌落的定義及其獲得方式3.掌握平板劃線法的基本操作4.理解稀釋涂布平板法的計(jì)數(shù)規(guī)則5.區(qū)分菌種保藏的不同方式培養(yǎng)基的配置流程

滅菌

倒平板

平板倒置計(jì)算

稱量

溶化

調(diào)pH牛肉膏(膏狀物)稱量紙注意：由于牛肉膏為膏狀物(粘稠)，所以在稱量之后須連同稱量紙一起進(jìn)入溶化步驟培養(yǎng)基的配置流程

滅菌

倒平板

平板倒置計(jì)算

稱量

溶化

調(diào)pH②③④①1.

將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左后拔出棉塞2.右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過(guò)火焰3.

用左手拇指和食指將培養(yǎng)皿打開(kāi)一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約10~20ml)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿皿蓋4.

等待平板冷卻凝固，大約5~10min。然后將平板倒過(guò)來(lái)放置，使皿蓋在下，皿底在上

培養(yǎng)基的配置流程

滅菌

倒平板

平板倒置計(jì)算

稱量

溶化

調(diào)pH注意：

平板倒置的目的平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠。將平板倒置，既可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，又可以避免

培養(yǎng)基中水分過(guò)快的蒸發(fā)補(bǔ)充：接種前：防止培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿脫離；易于拿取接種后：減少空氣流通；防止失水干裂；防止雜菌污染；利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的富集與吸收；防止菌落過(guò)

快擴(kuò)散，方便計(jì)數(shù)平板正置平板倒置單菌落由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體單菌落分離：在一定的培養(yǎng)條件下，不同種微生物表現(xiàn)出各自穩(wěn)定的菌落特征大小、形態(tài)、隆起程度和顏色培養(yǎng)∴

形成單菌落的核心，是讓每個(gè)微生物之間在培養(yǎng)基上的“距離”變大微生物B微生物A培養(yǎng)平板劃線法接種環(huán)酒精燈菌液①將接種環(huán)放在火焰上灼

燒，直到接種環(huán)燒紅在火焰旁冷卻接種環(huán)，

并打開(kāi)棉塞將試管通過(guò)火焰②③④將已冷卻的接種環(huán)伸入

菌液中，沾取一環(huán)菌液將試管口通過(guò)火焰，并

塞上棉塞⑤⑥⑦左手將皿蓋打開(kāi)一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋，注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃

線的末端開(kāi)始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以

上操作。在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連平板劃線法接種環(huán)酒精燈菌液冷卻再插，燒后再畫頭尾不連，用力不大平板劃線法接種環(huán)酒精燈菌液冷卻再插，燒后再畫頭尾不連，用力不大注意：

平板劃線法可以對(duì)微生物進(jìn)行分離、純化、鑒定，但無(wú)法計(jì)數(shù)稀釋涂布平板法將涂布器浸入盛有酒精的燒杯中取少量菌液(一般

為0.1mL)滴加到培

養(yǎng)基表面將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后冷卻8-10s用涂布器將菌液均與的

涂布在培養(yǎng)基表面，涂

布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使

菌液涂布均勻①②③

④

⑤

⑥涂布器①②③④思考：1.

稀釋液的要求2.

稀釋倍數(shù)的選擇3.

同一稀釋梯度實(shí)驗(yàn)次數(shù)

4.

是否需要空白對(duì)照5.

統(tǒng)計(jì)結(jié)果可靠性6.

與血球計(jì)數(shù)板的對(duì)比稀釋涂布平板法注意：1.

稀釋液要嚴(yán)格保證無(wú)菌，所以一般采用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋。

2.

涂布平板用菌液量一般為0.1ml3.

通常選擇一定稀釋范圍的樣液培養(yǎng)，保證菌落數(shù)在30~300之間

4.

同一稀釋度的對(duì)照平板不少于3個(gè)，且菌落數(shù)不應(yīng)相差很大5.

設(shè)置空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度6.相較于血球計(jì)數(shù)板，稀釋涂布平板法只對(duì)活菌計(jì)數(shù)

7.

統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌實(shí)際數(shù)目偏小將涂布器浸入盛有酒精的燒杯中取少量菌液(一般

為0.1mL)滴加到培

養(yǎng)基表面將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后冷卻8-10s用涂布器將菌液均與的

涂布在培養(yǎng)基表面，涂

布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使

菌液涂布均勻①②③

④

⑤

⑥涂布器①②③④菌種保藏方法操作目的頻繁使用的菌種臨時(shí)保藏①菌種接種到試管固體斜面培養(yǎng)基上，適宜溫度培養(yǎng)②菌落長(zhǎng)成后將試管放入4℃冰箱中保藏③每隔3~6個(gè)月，轉(zhuǎn)移菌種至新培養(yǎng)基注意：臨時(shí)保藏菌種易被污染或產(chǎn)生變異保持菌種的純凈長(zhǎng)期保存甘油管藏①3ml甘油管中裝入1ml甘油，滅菌②將1ml培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油管中與甘油充分混合③將甘油管放入-20℃冷凍箱中保存增大接種面積，創(chuàng)造合適的條件固體斜面培養(yǎng)基常見(jiàn)微生物生長(zhǎng)的影響因素環(huán)境因素影響機(jī)理最適條件不適宜因素導(dǎo)致結(jié)果溫度影響蛋白質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)25~37℃低溫時(shí)反應(yīng)速率降低；高溫時(shí)蛋白質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)被破壞pH影響酶活性和膜穩(wěn)定性細(xì)菌：

6.5~7.5真菌：

4.5~6.0酶活性或膜穩(wěn)定性改變；新陳代謝受阻氧氣影響微生物呼吸作用或生命不同微生物所需條件不同①嚴(yán)格厭氧型：短時(shí)間有氧造成生長(zhǎng)停滯或死亡②兼性厭氧型：無(wú)氧時(shí)無(wú)氧呼吸，有氧時(shí)有氧呼吸③好氧型：無(wú)氧條件下難以生存微生物的生長(zhǎng)規(guī)律01.培養(yǎng)基02.無(wú)菌技術(shù)03.微生物的培養(yǎng)04.發(fā)酵工程本節(jié)看點(diǎn)1.理解傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的原理2.理解各菌種的代謝類型3.掌握亞硝酸鹽鑒定的基本方式傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)——果酒菌種代謝

類型發(fā)酵原理發(fā)酵條件注意事項(xiàng)物質(zhì)鑒定果

酒酵母菌(真核)異養(yǎng)兼性

厭氧有氧呼吸細(xì)胞增殖酵母菌有氧呼吸增加細(xì)胞數(shù)量無(wú)氧呼吸酒精發(fā)酵酵母菌無(wú)氧呼吸產(chǎn)生酒精與CO2T:18-25℃pH:5-61.實(shí)驗(yàn)器具70%酒精消毒

2.葡萄先沖洗后去梗3.果汁量不高于發(fā)酵瓶2/34.注意及時(shí)排氣5.果酒酒精濃度不高于14%酸性重鉻酸鉀橙黃

→灰綠選取葡萄沖洗榨汁發(fā)酵10-12天1.

葡萄先沖洗后去梗——

防雜菌污染2.70%酒精對(duì)器皿消毒3.

先發(fā)酵瓶留1/3空間——先有氧增殖

（或者先通氣后密封也可）4.發(fā)酵過(guò)程控溫18-25℃5.

發(fā)酵過(guò)程嚴(yán)格密封6.

果酒濃度一般不超過(guò)14%

（酵母菌會(huì)死亡）7.

注意定期排氣

（排出CO2）8.

生成物檢測(cè)：

酸性重鉻酸鉀——橙黃

→

灰綠酵母菌傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)——果醋菌種代謝

類型發(fā)酵原理發(fā)酵條件

注意事項(xiàng)物質(zhì)鑒定果

醋醋酸桿菌(原核)異養(yǎng)需氧

型糖源充足

糖

醋酸糖源不足酒精

醋酸T:30-35℃O2

充足全通氣果醋鑒定1.

有糖用糖，無(wú)糖用酒2.發(fā)酵過(guò)程控溫30-35℃3.

持續(xù)通氧

（無(wú)菌空氣是最經(jīng)濟(jì)的選擇）4.

果醋的鑒定方法①觀察菌膜的形成②嗅味和品嘗③比較發(fā)酵前后的pH選取糖源

沖洗

榨汁

發(fā)酵7-8天醋酸桿菌傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)——腐乳菌種代謝

類型發(fā)酵原理發(fā)酵條件注意事項(xiàng)物質(zhì)鑒定腐乳毛霉(真核)異養(yǎng)需氧

型酶的催化1.蛋白酶Pr

氨基酸

+多肽2.脂肪酶

脂肪

甘油

+

脂肪酸T:15-18℃1.豆腐含水量70%2.加鹽調(diào)味并析出豆腐水分3.越接近瓶口鹽量越大4.鹽浸提毛霉菌絲的蛋白酶

5.鹵湯含12%酒精，抑菌

6.香辛料調(diào)味，抑菌——1.

豆腐含水量70%左右（否則易碎）2.

發(fā)酵過(guò)程控溫15-18℃3.加鹽調(diào)味并析出豆腐水分，防止酥爛4.

越接近瓶口，鹽量越大

（防雜菌污染）5.加鹽還可以浸提毛霉菌絲的蛋白酶6.

鹵湯中加12%酒精，抑制微生物生長(zhǎng)7.

香辛料調(diào)制風(fēng)味，防腐殺菌8.

封瓶時(shí)將瓶口通過(guò)酒精燈火焰，防止污染豆腐上長(zhǎng)出毛霉

加鹽腌制

加鹵湯裝瓶密封腌制毛霉傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)——泡菜菌種代謝

類型發(fā)酵原理發(fā)酵條件注意事項(xiàng)物質(zhì)鑒定泡菜乳酸菌(原核)異養(yǎng)厭氧型乳酸菌無(wú)氧呼吸T:20℃1.5%~20%鹽水2.鹽水煮沸后冷卻2.泡菜壇嚴(yán)格密封3.標(biāo)準(zhǔn)顯色液現(xiàn)用現(xiàn)配亞硝酸鹽鑒定

發(fā)酵

成品鹽水沒(méi)過(guò)全部菜料泡菜壇嚴(yán)格密封壇蓋邊沿水槽中注滿水稱取

食鹽配制

鹽水泡菜

鹽水修整、洗滌、晾曬

切分成條狀或片狀加入調(diào)味

料，裝壇亞硝酸鹽

含量測(cè)定選擇原料

乳酸桿菌/鏈球菌5%~20%濃度鹽水，煮沸后冷卻鹽調(diào)味抑菌；煮沸殺菌，冷卻為保乳酸菌存活亞硝酸鹽的鑒定亞硝酸鹽是一種分布廣泛的食品添加劑，低劑量不危害人類健康，大部分隨尿液排出亞硝酸鹽在適宜的pH、溫度和一定的微生物作用會(huì)轉(zhuǎn)化為亞硝胺亞硝胺具有致癌作用，對(duì)動(dòng)物具有畸形和突變作用