乳酸菌作為基因工程菌的研究進(jìn)展

乳酸菌作為基因工程菌的研究進(jìn)展

蘑菇是一種常見的革蘭氏陽性厭氧菌，可以發(fā)酵養(yǎng)分（主要是葡萄糖），主要包括腸球菌、乳菌、明珠菌、桿菌、球形細(xì)菌和雙叉菌。傳統(tǒng)乳制品制作有著幾千年的歷史,其中的乳酸菌是重要的可利用生物資源,乳球菌和乳桿菌的許多種通常是被認(rèn)為具有安全(Generally-regarded-as-safe,GRAS)的特性,是一種食品級的微生物。在過去的20年里,LAB的特性、新陳代謝、種類、遺傳特性等方面的研究逐步增加,近幾年,LAB在基因工程領(lǐng)域有了很大的發(fā)展,包括內(nèi)源性質(zhì)粒的去除、電穿孔方法的建立等,已建立了一系列具有不同用途的選擇標(biāo)記和突變系統(tǒng)等,以及LAB的模式菌Lactococcuslactis的基因組的測序完成,這些都為LAB在食品、醫(yī)藥工程方面的應(yīng)用提供了可能,而食品級的高效表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和應(yīng)用更是近年來的研究熱點。1菌株的致病性乳酸菌是人和大多數(shù)動物腸道內(nèi)的常見細(xì)菌,已證明其在食品工業(yè)各個領(lǐng)域中的長期應(yīng)用不具有致病性,目前主要以乳酸球菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌作為基因工程菌。1.1乳酸球形蛋白檢測乳酸球菌是乳酸菌中的典型菌種,乳酸球菌作為基因工程菌有其獨特的優(yōu)勢:首先,乳酸球菌是無強抗原性;其次,乳酸球菌本身分泌蛋白較少,Usp45是迄今已知乳酸球菌分泌的唯一可檢測蛋白,減少了載體表達(dá)的自身蛋白對外源分泌蛋白的干擾;第三,乳酸球菌不產(chǎn)生任何細(xì)胞外蛋白酶,不會引起分泌蛋白發(fā)生細(xì)胞外的降解。但是乳酸球菌基本不在胃腸道內(nèi)定植,因而不能長期持續(xù)分泌外源蛋白。1.2尿激酶iga的制備乳桿菌為棒狀、厭氧或微厭氧的革蘭氏陽性、非致病菌,能在呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)定植,對維持微生態(tài)平衡具有重要作用;作為基因工程菌可簡化表達(dá)產(chǎn)物的后期處理工藝;同腸胃外免疫途徑相比,可通過黏膜免疫誘發(fā)IgA產(chǎn)生;具有免疫佐劑作用及對膽汁酸的抵抗力,因此乳酸桿菌作為基因工程受體菌的應(yīng)用前景十分廣闊。1.3雙歧桿菌穿透載體雙歧桿菌作為基因工程受體菌的研究相對較少,Sgorbati等對1461株共24個種的雙歧桿菌進(jìn)行了質(zhì)粒的檢測,發(fā)現(xiàn)4個種的雙歧桿菌即長雙歧桿菌、球雙歧桿菌、星狀雙歧桿菌及印度雙歧桿菌含有質(zhì)粒。Missich等成功地構(gòu)建了1個大腸埃希菌-長雙歧桿菌的穿梭載體,將該重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌和雙歧桿菌,均篩選到重組子,說明該重組質(zhì)粒為穿梭載體。大腸埃希菌-雙歧桿菌穿梭載體的成功構(gòu)建,將為今后雙歧桿菌遺傳分子機(jī)理的研究和基因工程菌的研制提供有力的工具。2抗性基因傳統(tǒng)的乳酸菌載體為保持一定的選擇壓力都帶有一個或多個編碼特定抗生素(紅霉素、氯霉素)抗性的基因,由于抗性因子具有可轉(zhuǎn)移性,將其釋放到環(huán)境或被人或動物攝入體內(nèi)會帶來嚴(yán)重的生物安全性后果,美國FDA早已禁止在食品中使用此類標(biāo)記。目前,已開發(fā)出應(yīng)用于乳酸菌的非抗生素抗性選擇標(biāo)記,主要有3類:糖類選擇標(biāo)記、細(xì)菌營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記以及編碼細(xì)菌素抗性的標(biāo)記。2.1lacf基因缺失菌株的構(gòu)建糖類利用選擇性標(biāo)記包括乳糖、蔗糖、木糖、蜜二糖等。目前,在乳酸菌的糖類利用中,以乳糖操縱子研究得最為深入。Maccormick等將完整的乳糖操縱子插入到無質(zhì)粒的乳酸乳球菌MG5276的染色體中,然后通過雙交換同源重組使LacF基因失活,細(xì)菌表型為Lac-,當(dāng)將克隆有LacF基因的質(zhì)粒導(dǎo)入LacF缺陷株時,細(xì)菌就恢復(fù)了Lac+表型,并可以通過含乳糖指示劑的溴甲酚紫平板來篩選重組菌落。當(dāng)使用含乳糖的培養(yǎng)基時,這種含LacF基因的質(zhì)粒穩(wěn)定地存在于乳酸乳球菌中而起到選擇性標(biāo)記的作用。此外還可利用乳酸菌具有發(fā)酵特殊糖類的表型特征構(gòu)建新的食品級載體,蜜二糖是乳酸菌的一個特殊的發(fā)酵底物,Labrie等利用棉子糖乳球菌的aga基因的Mel+表型特征開發(fā)了新的選擇標(biāo)記。2.2規(guī)劃系統(tǒng)中nd-pcr擴(kuò)增Dickely等構(gòu)建了一個乳酸菌食品級載體pFG1,它由乳酸乳球菌一個質(zhì)粒的最小復(fù)制子、乳球菌的赭石突變抑制基因supB及一段人工合成的含有11個限制酶切位點的多克隆位點組成,載體大小約2kb。當(dāng)乳酸乳球菌嘌呤生物合成途徑中的基因發(fā)生赭石突變時,表現(xiàn)為嘌呤營養(yǎng)缺陷型。而pFGl載體中的supB基因產(chǎn)物可以抑制這種營養(yǎng)缺陷型,因此supB基因可作為選擇標(biāo)記。但是pFG1在工業(yè)菌株中卻很不穩(wěn)定,Sorensen等在pFGl的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個新的食品級表達(dá)載體pFG200,pFG200以琥珀突變抑制基因為選擇標(biāo)記,并且除了一小段多克隆位點外全部由乳球菌DNA構(gòu)成,在不含嘧啶培養(yǎng)基中可有效地選擇和保持含克隆載體的菌株。2.3nisin生物合成在食品級載體中使用的細(xì)菌素抗性標(biāo)記主要是乳鏈菌肽(Nisin),Nisin是乳酸乳球菌中某些菌株產(chǎn)生的小肽,對人體安全無毒,是天然的食品保藏劑。Nisin的生物合成涉及到nisin基因簇的nisZ/ABTCIPRKFEG的11個基因,以及nisA、nisR、nisF基因前的3個啟動子。Takala等構(gòu)建了一個包括pSH71的復(fù)制子、選擇性標(biāo)記nisI基因以及啟動子P45食品級克隆載體pLEB590,并在L.lactis成功地表達(dá)了來源脯氨酸亞氨基肽酶的基因pepi。3蘑菇的出現(xiàn)系統(tǒng)3.1乳狀液發(fā)生突變可能引起大腸桿菌t7rna聚合酶基因表達(dá)乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的乳糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是其LacA啟動子不受乳糖分解代謝物阻遏,而是受到自我調(diào)節(jié)的LacR阻遏物控制。LacA強啟動子是由乳糖在細(xì)胞內(nèi)的分解代謝物轉(zhuǎn)變成了中間代謝物6-磷酸塔格糖(tagatose-6-phosphate),使LacR阻遏物激活而造成的。把大腸桿菌T7RNA聚合酶基因連接在LacA啟動子后,該基因的表達(dá)受到乳糖的調(diào)節(jié)。戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)的xyl基因受到木糖誘導(dǎo),把無啟動子的cat-86基因連接在xylA基因的啟動子下,轉(zhuǎn)化到戊糖乳桿菌中表達(dá),分別以含有木糖和葡萄糖培養(yǎng)基上培養(yǎng),CAT表達(dá)量差別很大,前者表達(dá)的CAT活性比后者高出60~80倍。3.2乳酸乳球形保鮮將LacZ作為報告基因放在ψ31啟動子后面,構(gòu)建成質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌中,被ψ31噬菌體感染后,產(chǎn)生大量的β-半乳糖苷酶,質(zhì)粒在未被噬菌體ψ31感染前在宿主菌內(nèi)是低拷貝的,而一旦被感染后,1~2h內(nèi)基因的表達(dá)量可以增加1000倍以上。3.3細(xì)胞外有乳鏈球菌素乳鏈球菌素表達(dá)系統(tǒng)(nisin-controlledexpression,NICE)是乳鏈球菌素表達(dá)系統(tǒng)典型的代表,當(dāng)細(xì)胞外有乳鏈球菌素時,具有傳感蛋白作用的NisK能夠識別乳鏈球菌素,使NisR磷酸化去激活nisA啟動子,導(dǎo)致下游基因的表達(dá),這種小肽信息素依賴的調(diào)節(jié)系統(tǒng)在革蘭陽性菌中廣泛存在。該系統(tǒng)表達(dá)的產(chǎn)物可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白的10%~60%,產(chǎn)量提高數(shù)千倍。Sorvig等在該系統(tǒng)基礎(chǔ)上建立了誘導(dǎo)性乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。3.4絲裂霉素對rro基因和tec基因表達(dá)的控制由于對乳酸桿菌溫和噬菌體ψo(hù)rlt基因全序列的測定,分析發(fā)現(xiàn)了一個與溶原轉(zhuǎn)變有關(guān)的調(diào)控區(qū)。它由與轉(zhuǎn)錄方向相反的2個基因啟動子(P1和P2)組成,分別控制rro基因(編碼一個阻遏物)和tec基因(編碼Cro的拓?fù)洚悩?gòu)體)的表達(dá)。P2的表達(dá)受到Rro阻遏,加入絲裂霉素可以緩解這種阻遏。通過設(shè)計一個熱不穩(wěn)定性的Rro的阻遏變異體Rrol2,構(gòu)造了溫控表達(dá)系統(tǒng),將乳酸桿菌生長溫度從24℃提高到42℃時,使P2控制的外源蛋白表達(dá)量有了很大的提高。4可混養(yǎng)成分配產(chǎn)品隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展,各種乳酸菌食品級基因表達(dá)系統(tǒng)也得到了進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用,有助深入了解乳酸菌的基因功能和表達(dá)調(diào)控的規(guī)律。通過改造乳酸菌使其更適宜人體的需要,制成微生態(tài)制劑和活菌疫苗等保健品或藥品,是LAB分子生物學(xué)研究的一個重要方向。同時,可