蓖麻提取物對南方根結線蟲病的殺線活性及防治研究

蓖麻提取物對南方根結線蟲病的殺線活性及防治研究

根結線蟲是一個重要的植物致病性因素，其寄生范圍廣泛，包括谷物、油出版物、纖維、蔬菜、材料和花卉。根結線蟲通常會造成嚴重的經濟損失。通常有四種類型：南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、水生根結線蟲和北方根結線蟲。根結線蟲在中國南方的廣泛出現(xiàn)，嚴重影響了蔬菜生產。目前，化學預防仍然是控制植物寄生昆蟲疾病最重要的措施。然而，化學品具有毒性高、殘留高、成本高、易污染環(huán)境、環(huán)境相容性差等問題。天然寄生蟲植物具有快速分解、低殘留、少污染、少毒性等特點。因此，植物起源活性物質的利用將引起人們的注意。蓖麻(Ricinuscommunus)屬大戟科蓖麻屬,為雙子葉一年生或多年生植物.蓖麻是具有特殊工業(yè)用途的油料植物,是集多種開發(fā)功能于一體的生物資源,也是一種重要的生物殺蟲、抗癌和生物抗污染源.從蓖麻中提取的蓖麻毒素具有較強的殺蟲、殺菌作用,是制造生物農藥的重要來源.本文以南方根結線蟲為研究對象,通過毒力測定及盆栽試驗研究了蓖麻提取物的殺線蟲活性及防治效果,以期為該病害的生物防治提供參考.1材料和方法1.1供試植株及試劑毒力測試于2010年4—7月在南京農業(yè)大學土壤生態(tài)實驗室進行,盆栽試驗于2010年8—10月在南京農業(yè)大學土壤生態(tài)實驗室溫室大棚進行.供試蓖麻葉于2009年9月采自山東家祥蓖麻研究所.供試番茄(Lycopersiconesculentum)品種為蘇粉八號,由江蘇省江蔬種苗科技有限公司生產.供試線蟲經鑒定為南方根結線蟲.1.2人工繁殖培養(yǎng)在江蘇省宜興市固體有機廢棄物資源化高技術重點實驗室周邊根結線蟲危害嚴重的農田采集土樣,接種至番茄苗上進行人工繁殖.從感染根結線蟲的番茄病根挑取新鮮卵囊,置于培養(yǎng)皿(d=6cm),皿底墊濕潤濾紙1張,置于(25±1)℃培養(yǎng)箱,5~7d后待卵孵化產生大量2齡幼蟲時,收集線蟲備用.取病根于解剖鏡下挑取大小一致的卵囊,用1%的次氯酸鈉表面消毒3~4min,無菌水漂洗4~5次,備用.1.3l-1析水提物的制備供試蓖麻先采用微波提取法粗提.然后粗提物采用索氏提取法精提.得到精提物為白色針狀結晶.該精提物經核磁共振1H譜結構確定為蓖麻堿(ricinine),測其純度為89.1%.稱取已滅菌的蓖麻葉干粉5g,加無菌水50mL,于30℃振蕩浸提24h,1000×g低速離心2min,用無菌濾紙過濾,濾液用無菌水定容至50mL,制成100g·L-1蓖麻水提液.1.4試驗設計1.4.1和0.25gl-13參考翁群芳等浸漬法測定提取物對二齡幼蟲的毒力.根據預試驗的結果,用滅菌水將制備的蓖麻堿溶解稀釋成5個濃度梯度:2、1.5、1、0.5和0.25g·L-1;蓖麻水提液稀釋成5個濃度梯度:100、50、25、12.5和6.25g·L-1.分別量取3mL稀釋液加入d=2.5cm的培養(yǎng)皿(12孔板)中,隨后加入50~100條線蟲,每處理4個重復,以滅菌水為對照,放置于25℃培養(yǎng)箱中,48h后用針觸法鏡檢線蟲死亡數量.按Abbott公式計算校正死亡率,根據濃度對數和死亡機率值,采用最小二乘法求取毒力回歸方程,計算LC50.1.4.2評論員ld50在每個培養(yǎng)皿(d=6cm)中放入2個制備好的南方根結線蟲的卵囊,處理分別加4mL蓖麻堿稀釋液(1g·L-1)和4mL蓖麻水提液(25g·L-1),對照加4mL滅菌水.處理和對照各4次重復.置于25℃培養(yǎng)箱中,分別在2、6、10和14d于解剖鏡下觀察卵孵化數,并計算蓖麻堿和水提液對卵囊孵化的抑制率.1.4.3植物源農藥對照利用根據對二齡幼蟲的毒力測定結果,以蓖麻堿稀釋液1g·L-1、蓖麻水提液25g·L-1、滅菌蓖麻葉植物粉(與干沙土以1∶150施用)分別為處理組,以滅菌水為溶劑對照,并設0.36%苦參堿水劑(山西省侯馬市星火化工廠生產)稀釋1000倍為植物源農藥對照,辛硫磷(上海愛幫農科技有限公司生產)與干沙土以1∶150施用為常規(guī)化學農藥對照.采用滅菌土栽培法,將出苗30d后的番茄植株幼苗移栽至裝有滅菌土(沙、土比為1∶1)的直徑為9cm的塑料杯中,每盆1株,每處理5個重復,置于25℃溫室內生長.定植后5d的番茄植株分別接種1000條南方根結線蟲二齡幼蟲.6d后分別以蓖麻堿稀釋液、蓖麻水提液、滅菌水、苦參堿各6mL灌根,以滅菌蓖麻葉植物粉、辛硫磷各1.4g穴施,正常水肥管理,20d后調查試驗結果.1.5地上部植株鮮質量常規(guī)指標:挖取各處理番茄植株,洗凈抹干,將番茄植株平鋪,量地上部植株高度及地下部根長度,用電子天平準確稱量地上部植株鮮質量.以對照為標準,分別計算:地上部植株株高增長率、地上部植株鮮質量增長率、根長增長率.統(tǒng)計每株根結數,計算根結指數(GI)和根結形成抑制率.生化指標:采用α-萘胺法測定根系活力;采用氮藍四唑(NBT)法測定葉片的超氧化物歧化酶(SOD)活性,紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性.1.6數據處理與分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析Duncan多重比較方差分析,顯著性水平設為0.05.圖表中數據均用平均值±標準差表示.采用Excel2003軟件制圖.2結果與分析2.1監(jiān)測站.4-4-5gl-1和5.毒力測定顯示,不同濃度蓖麻堿對南方根結線蟲二齡幼蟲均有毒殺效果(表1),其毒力回歸方程、LC50分別為y=2.1017x-0.8161和0.6g·L-1.隨著處理濃度的提高其毒殺效果隨之增強.濃度為2和1.5g·L-1的處理,線蟲校正死亡率分別達到91.5%和79.4%,均顯著高于其他3個處理.濃度為1g·L-1時,校正死亡率為60.1%,且隨著濃度的降低毒殺效果顯著降低.不同濃度蓖麻水提液對南方根結線蟲二齡幼蟲的毒殺效果不同(表1),其毒力回歸方程、LC50分別為y=1.1412x+3.5588和18.3g·L-1.隨著處理濃度的提高其毒殺效果隨之增強.濃度為100和50g·L-1的處理,線蟲校正死亡率分別為83.5%和64.8%,均顯著高于其他3個處理,濃度為25g·L-1時,校正死亡率為52.4%.2.2東南角硅水提液與社會主義堿處理的抑制作用經過2、6、10和14d的觀察發(fā)現(xiàn),所有蓖麻堿和蓖麻水提液的處理對南方根結線蟲卵孵化都有抑制作用(表2).14d時蓖麻堿抑制作用最明顯,抑制率高達61.7%,顯著高于蓖麻水提液(49.0%).蓖麻堿和蓖麻水提液處理均在2d時就表現(xiàn)出抑制作用,6d時抑制率出現(xiàn)小幅度下降,10~14d時抑制率出現(xiàn)上升趨勢并最終達到最大值.6d時抑制率下降的原因可能是線蟲的孵化速率減慢.10~14d抑制率上升可能是由于處理液作用時間較長,導致孵化出的線蟲在一定程度上發(fā)生死亡分解.2.3提取物對番茄生長和根結的影響2.3.1苦參堿和辛硫磷對南方根結線蟲生長指標影響由表3可知,蓖麻提取物對番茄株高、地上部鮮質量及根長的影響相似,均有促進增長作用.其中,蓖麻堿處理的番茄株高、地上部鮮質量及根長的增長率顯著大于其他處理.蓖麻堿、蓖麻水提液和蓖麻葉植物粉處理的番茄株高分別比對照增長33.5%、22.6%和15.8%,與對照藥劑苦參堿和辛硫磷處理的增長率10.2%和12.3%相比差異顯著.蓖麻堿和蓖麻水提液處理的番茄地上部鮮質量分別比對照增長41.4%和18.9%,與對照藥劑苦參堿和辛硫磷相比差異顯著.蓖麻葉植物粉處理的番茄鮮質量增長率為10.1%,與對照藥劑差異不顯著.蓖麻堿、蓖麻水提液和蓖麻葉植物粉處理的番茄根長分別比對照增長46.8%、34.5%和33.8%,與對照藥劑苦參堿和辛硫磷處理的增長率24.5%和28.1%相比差異顯著.線蟲為害寄主植物時能分泌特殊物質造成植株形成根結、腫瘤和蟲癭,導致寄主植物發(fā)育停滯,矮化或葉片變薄、變黃等.以上試驗結果表明,蓖麻提取物3種處理對南方根結線蟲有一定的抑制作用,在很大程度上能促進植株的生長.2.3.2根結數及根結指數表3顯示,番茄根結數直觀地反映了蓖麻提取物對南方根結線蟲的控制效果,對照每株根結數多達(37.4±2.3)個,蓖麻提取物各處理植株根結數均顯著低于對照.其中,蓖麻堿處理后根結數最少,僅為每株(17.6±1.7)個,與對照藥劑苦參堿和辛硫磷處理的每株根結數(25.6±3.4)和(27.4±3.9)個相比差異顯著;其次為蓖麻水提液、蓖麻葉植物粉處理,根結數分別為每株(20.6±1.5)和(22.8±3.7)個,與對照相比差異顯著.蓖麻堿、蓖麻水提液和蓖麻葉植物粉處理的番茄根結形成抑制率分別比對照增長52.9%、44.9%和39.0%,與對照藥劑苦參堿和辛硫磷處理的根結形成抑制率31.6%和26.7%相比差異顯著.其中,蓖麻堿處理的根結形成抑制率顯著大于其他處理.根結指數可作為作物對根結線蟲的抗性及殺線劑藥效的評價指標.蓖麻堿處理后根結指數最低,僅為(24.5±5.4),與對照藥劑苦參堿和辛硫磷處理的(45.1±12.1)和(51.0±14.4)相比差異顯著,且顯著低于溶劑對照的(72.4±18.4).說明蓖麻堿處理的植株對根結線蟲抗性最大,蓖麻堿的殺線作用最強.蓖麻堿處理與蓖麻水提液及蓖麻葉植物粉處理的(34.1±18.7)和(38.0±5.9)相比差異顯著,蓖麻水提液與蓖麻葉植物粉處理之間差異不顯著,但均顯著低于對照.番茄根結數、根結形成抑制率及根結指數均能客觀反映蓖麻提取物對南方根結線蟲的控制效果.以上試驗結果說明,蓖麻提取物能抑制根結形成,減少植株根結數,防治效果優(yōu)于商品殺蟲劑(苦參堿、辛硫磷).2.3.3根結線蟲對根系活力的影響由圖1可知,不同處理對番茄植株根系活力的影響不同,蓖麻堿處理的番茄植株根系活力最大,達到121.6μg·g-1·h-1,遠大于對照的79.9μg·g-1·h-1,其處理效果最佳,最適合番茄植株根系的生長發(fā)育.蓖麻水提液與苦參堿處理、蓖麻葉植物粉與辛硫磷處理的根系活力差異不顯著,處理效果接近,但均高于對照.根系活力反映植物根系吸收與代謝能力的強弱,直接影響植株的抗逆性及地上部莖葉的生長和作物產量.由于蓖麻堿處理的根系活力最大,說明該處理下根結線蟲對根系的影響最小,其防治效果最好.而對照的根系活力最小,說明該處理下根系對根結線蟲的抗性最弱,根結線蟲對根系的影響最大.由圖2可知,不同處理對番茄植株葉片SOD酶和CAT酶活性的變化趨勢相似,處理與對照之間總體呈升高趨勢.由于在逆境條件下植物會增加活性氧自由基的清除能力,所以其體內超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等保護酶會增加,以減輕活性氧對植物的傷害.而對照處理葉片SOD酶活性最大,達到196.5U·g-1,說明在線蟲侵染的狀態(tài)下,植株體內SOD酶增加,以對抗線蟲侵染下活性氧的增加.蓖麻堿處理的葉片SOD酶活性相對最小,達到191.5U·g-1,說明蓖麻堿處理中根結線蟲對植株的影響最小,植株受害程度最小.其余各處理的葉片SOD酶活性差異不顯著,處理效果接近,均低于對照處理,這說明植株受害程度均比對照處理弱.番茄植株葉片CAT酶活性在對照處理達到最大值21.0U·g-1·min-1,蓖麻堿處理為最小值15.0U·g-1·min-1,其他處理CAT酶活性相近,變化幅度較小,差異不顯著,但均低于對照處理.該試驗中CAT酶在葉片中的活性及含量相對SOD酶弱,但其作用與SOD酶相似,也能間接指示植株在逆境下的抗性及受害程度.3類植物改革劑對南方根結線蟲的防治南方根結線蟲作為重要的植物害蟲,國內外均非常重視尋找合適的高效控制方法,其中印楝(Azadirachtaindica)、烏桕(Sapiumsebiferum)、檸檬桉(Eucalyptuscitriodora)、胡黃連(Picrorhizascrophulariiflora)、魚腥草(Houttuyniacordata)和夾竹桃(Neriumindicum)等植物源物質對其均有較好的控制作用.有報道,蓖麻堿對天幕毛蟲(Malacosomneustriatestacea)、桃蚜(Myzuspersicae)、小菜蛾(Plutellaxyllostella)等3種害蟲有不同程度的殺滅作用,蓖麻葉粉碎與肥料混施可以減少根瘤,有效控制根結線蟲二齡幼蟲.本試驗結果表明,蓖麻堿、蓖麻水提液和蓖麻葉植物粉3種物質均對南方根結線蟲具有強烈或較強的毒殺活性,而且能顯著促進盆栽番茄地上部植株高度、鮮質量和根長生長,顯著降低番茄根結數,降低根結指數,對根結形成具有較強的抑制效果,盆栽控制效果良好.根系活力反映植物根系吸收與代謝能力的強弱,直接影響植株的抗逆性及地上部莖葉的生長和作物產量,本試驗通過對根系活力的測定可以間接反映不同處理對根結線蟲的防治效果.同樣,對SOD和CAT兩種抗氧化酶的測定可以間接反映在逆境條件下植物的受害情況.苦參堿和辛硫磷是目前農藥市場上常用的兩種殺線劑.試驗發(fā)現(xiàn),與同稀釋濃度的苦參堿、辛硫磷相比,蓖麻堿對降低寄主植物根結數的作用效果更優(yōu),而蓖麻水提液和蓖麻葉植物粉處理與兩種農藥的作用效果接近.蓖麻精提物的化學成份為蓖麻堿,其化學名稱為3-氰基-4-甲氧基-1-甲基-2-吡啶酮,是一種中性生物堿.其分子中含氰基,所以毒