北極海泥中抗菌活性海洋真菌的篩選與初步鑒定

北極海泥中抗菌活性海洋真菌的篩選與初步鑒定

從海洋微生物中尋找草藥已成為開發(fā)藥物資源的重要策略之一。國內(nèi)外對海洋細(xì)菌和放線菌的活性天然產(chǎn)物的研究起步較早,發(fā)現(xiàn)的新化合物數(shù)量也較多,相比之下對海洋真菌的系統(tǒng)研究起步較遲,直到20世紀(jì)90年代才進入較快速的發(fā)展階段。目前,人們已經(jīng)從海洋真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了1000多種新的次生代謝產(chǎn)物,這些代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)出良好的抗腫瘤、抗菌、抗病毒等生物活性,成為當(dāng)前海洋藥物研究的熱點。作者從北極海泥中分離真菌,采用其發(fā)酵液進行抗菌活性篩選,并鑒定其種類、研究其活性代謝產(chǎn)物的性質(zhì),以期發(fā)現(xiàn)具有顯著抗菌活性的菌株,為建設(shè)海洋真菌種質(zhì)資源庫、開發(fā)新的微生物藥物奠定基礎(chǔ)。1實驗1.1材料表面1.1.1樣本來源北極海泥來自北極黃河站附近海域潮間帶。1.1.2菌株來源atcc金黃色葡萄球菌(Staphyloccusaureus)ATCC25925、大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922、多株金黃色葡萄球菌臨床分離耐藥菌、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaalbicans),均由中國藥科大學(xué)微生物學(xué)實驗室提供。1.1.3主試劑DNAMarker、TaqMasterMix,康為;引物由上海生工合成;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2培養(yǎng)基1.2.1培養(yǎng)基的制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基:馬鈴薯去皮,200g切成小塊,加水煮沸30min,4～6層紗布過濾,加20g葡萄糖、20g海鹽、15～20g瓊脂,蒸餾水1000mL。察氏培養(yǎng)基:NaNO32g,K2HPO41g,MgSO4·7H2O0.5g,KCl0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,蔗糖30g,海鹽20g,瓊脂15～20g,蒸餾水1000mL。沙氏培養(yǎng)基:蛋白胨10g,葡萄糖4g,瓊脂15～20g,蒸餾水1000mL。改良的馬丁培養(yǎng)基:葡萄糖20g,蛋白胨5g,酵母粉2g,K2HPO41g,MgSO4·7H2O0.5g,海鹽20g,瓊脂15～20g,蒸餾水1000mL。葡萄糖酵母膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基:葡萄糖10g,蛋白胨2g,酵母膏0.5g,海鹽20g,瓊脂15～20g,蒸餾水1000mL。1.2.2指示器菌的培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化鈉5g,瓊脂15～20g,蒸餾水1000mL。1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基種子發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基:察氏液體培養(yǎng)基。1.3方法1.3.1菌落純化和純化采用平板稀釋法分離菌株。取海泥樣品1g,用無菌海水逐級稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5數(shù)量級,各取0.2mL均勻涂布于分離平板上,每個稀釋度涂3個平板,28℃倒置培養(yǎng),每天觀察是否有新菌落出現(xiàn),挑取形態(tài)相異的菌落劃線純化,純化的菌株斜面置于4℃冰箱保存。1.3.2種子培養(yǎng)從活化斜面中取菌絲塊或孢子接種于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,28℃、200r·min-1下培養(yǎng)3d作為種子。將種子以8%的接種量接入裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中,28℃、200r·min-1下培養(yǎng)7d。將發(fā)酵液用低溫高速離心機8000r·min-1離心20min,取上清布氏漏斗抽濾,得到澄清發(fā)酵液,用無菌的0.22μm濾膜過濾,得無菌體的澄清發(fā)酵液,4℃冰箱保存。1.3.3抑菌圈的測定采用濾紙片法進行抗菌實驗。用無菌水將斜面培養(yǎng)的指示菌洗下,與適量培養(yǎng)基混勻倒平板,將含有待測樣品的無菌濾紙片貼于平板上,細(xì)菌培養(yǎng)24h,真菌培養(yǎng)48h,觀察是否有清晰透明的抑菌圈產(chǎn)生,并測量抑菌圈的直徑大小。1.3.45、細(xì)菌的識別1.3.4.1.培訓(xùn)的特點采用標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)菌株,觀察并記錄PDA平皿菌落特征,包括菌落的正背面顏色、菌落直徑、菌落質(zhì)地、有無分泌物等。1.3.4.2.微觀形態(tài)觀察挑取菌株產(chǎn)孢器及菌絲制成水封片,呂氏堿性美藍(lán)染色,進行鏡下觀察,記錄菌絲特征及分枝情況、孢子和產(chǎn)孢器結(jié)構(gòu)等。1.3.4.pcr和測序采用改良的CTAB法提取基因組DNA。ITS序列的PCR擴增采用通用引物:ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR擴增條件:95℃預(yù)變性4min,95℃30s,55℃40s,72℃1min,循環(huán)30次,72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測,純化后交南京思普金公司測序。將測序得到的ITS序列通過Blast與GenBank中的核酸序列進行比對,利用BioEdit7.0.9.0及Mega5.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用鄰接法(Neighborjoiningmethod)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并對所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進行自舉分析(Bootstrap),Bootstrap檢驗值≥50%(1000次重復(fù)),估算其內(nèi)分支的支持率。1.3.5在菌株h下發(fā)酵溶液中測定抗菌活性物質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)1.3.5.體外抑菌活性測定將發(fā)酵液12等分,分別調(diào)pH值至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,再將各份5等分,分別置于4℃、40℃、60℃、80℃及100℃水浴1h,各樣品以不同pH值水溶液和原發(fā)酵液為對照進行體外抗菌實驗,觀察抑菌效果。1.3.5.有機相的抑菌活性測定將發(fā)酵液12等分,分別調(diào)pH值至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,再將各份6等分,分別加入等體積的乙酸乙酯、氯仿、甲苯、乙酸丁酯、石油醚及正丁醇,4℃靜置,待完全分層后分別取有機相和水相,水相將pH值調(diào)回中性后同有機相均以原發(fā)酵液為對照進行抑菌實驗,觀察抑菌效果。1.3.6脫鹽粗提物的制備將發(fā)酵液調(diào)pH值2.0,過濾,除去不溶性雜質(zhì),然后過已預(yù)處理的大孔離子交換樹脂D380,去除大部分色素及雜質(zhì),收集洗滌液,接著用大孔吸附樹脂HPD300吸附,再用50%乙醇洗脫,分部收集洗滌液、洗脫液,測定不同洗滌液、洗脫液的活性,將有活性的部分合并,減壓濃縮成膏狀物,即得活性物質(zhì)的脫鹽粗提物。1.3.7不同化合物顯色研究將粗提物溶于少量甲醇中,在硅膠G板(20cm×15cm)上點樣,篩選后選用正己烷-正丁醇(4∶1)為展開劑,展層后干燥,在245nm的紫外燈下觀察,并用10%硫酸乙醇溶液噴霧顯色。2結(jié)果與討論2.1菌株抗菌活性的比較本實驗選用添加鏈霉素的5種不同的培養(yǎng)基從北極海泥樣品中共分離得到17株真菌。對這17株真菌的發(fā)酵產(chǎn)物進行抗菌活性初步篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株H5、H6對一種或幾種指示菌有抗菌活性。其抑制6種指示菌的能力比較見表1。從表1可以看出,菌株H5的抗菌活性較強且抗菌譜較廣,且對多株金黃色葡萄球菌臨床分離耐藥菌有較好的抑制作用,因此選取H5進行后續(xù)研究。2.25年的診斷結(jié)果2.2.1菌落形態(tài)、形態(tài)菌株H5在PDA平板上生長速度較快,培養(yǎng)7d后,菌絲蔓延至整個平板;菌落中心灰藍(lán)色,外緣白色,反面鮮黃色;菌落呈圓形,正面扁平且中心略微突起,邊緣呈樹枝狀,產(chǎn)鮮黃色色素;質(zhì)地疏松,絨毛狀,無明顯紋飾(圖1)。生物電鏡下觀察菌絲具橫隔,無分枝;分生孢子梗頂端膨大成為頂囊,呈半球形,頂端著生成串的球形分生孢子(圖2)。根據(jù)其形態(tài)特征初步鑒定為煙曲霉屬(Aspergillusfumigatus)。2.2.2系統(tǒng)發(fā)育樹檢測PCR擴增得到的菌株H5的ITS序列全長為557bp。將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的真菌ITS序列進行Blast分析,結(jié)果表明,菌株H5的ITS序列與煙曲霉屬的菌株相似度較高,系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。由圖3可知,菌株H5與煙曲霉屬Aspergillusfumigatusisolate13-F2處于同一分支,親緣關(guān)系最近,同源性達到99%,因此可以確定菌株H5屬于煙曲霉屬。2.3在微生物h發(fā)育液中，抗菌活性物質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)2.3.1不同ph值對抗菌活性的影響由圖4可知,菌株H5發(fā)酵液在酸性至中性條件下抗菌活性較高且性質(zhì)較穩(wěn)定(不同pH值水溶液、對照均無抑菌圈形成,排除因pH值不同對實驗結(jié)果造成干擾的可能)。pH值1～5的發(fā)酵液沸水浴lh后抗菌活性幾乎不變。但在堿性條件下其抗菌活性明顯減弱,pH>8時喪失抗菌活性,表明抗菌物質(zhì)可能在堿性條件下被破壞。2.3.2有機溶劑萃取通過觀察萃取后各樣品形成的抑菌圈的大小,發(fā)現(xiàn)菌株H5的發(fā)酵液只有在酸性至中性條件下才能被有機溶劑萃取,在乙酸乙酯、氯仿、甲苯、乙酸丁酯、石油醚、正丁醇萃取液中有不同濃度活性物質(zhì)存在(見圖5),正丁醇的萃取效果相對最好,說明活性物質(zhì)極性較大。2.4液噴霧顯色觀察發(fā)酵液的粗提物經(jīng)硅膠G薄層層析后,通過10%硫酸乙醇溶液噴霧顯色可觀察到4個斑點。經(jīng)活性檢測后發(fā)現(xiàn)其中1個斑點(Rf=0.4)具有較強的抗菌活性,且與其它斑點之間的分離度良好(表2),為后續(xù)分離純化工藝奠定了基礎(chǔ)。3菌株的活性成分從北極海泥中分離篩選抗菌活性海洋真菌,共分離得到真菌17株,其中菌株H5、H6的發(fā)酵液具有較好的抗菌活性,菌株H5的活性更強。根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析結(jié)果,鑒定菌株H5屬煙曲霉屬(Aspergillusfumiga