生物化學(xué)：RNA的生物合成(轉(zhuǎn)錄)

RNA的生物合成（轉(zhuǎn)錄）RNABiosynthesis,Transcription轉(zhuǎn)錄(transcription)以DNA單鏈為模板，以NTP為原料，由DNA指導(dǎo)的RAN聚合酶催化的合成RNA的過(guò)程。

轉(zhuǎn)錄RNADNA5′3′3′5′編碼鏈3′5′模板鏈參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)原料:

NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:

DNA酶:

RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)其他蛋白質(zhì)因子RNA的生物合成體系第一節(jié)一、DNA模板DNA雙鏈中按堿基配對(duì)規(guī)律指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(templatestrand)，也稱作反意義鏈、負(fù)鏈或Watson鏈。其堿基與mRNA互補(bǔ)。相對(duì)的另一股單鏈?zhǔn)蔷幋a鏈(codingstrand)，也稱為有意義鏈、正鏈或Crick鏈。其堿基與mRNA一致（除U→T）。5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C編碼鏈模板鏈mRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)

不同基因的模板鏈與編碼鏈，在DNA分子上并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。在DNA分子雙鏈某一區(qū)段上，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄。核心酶α2ββ’：參與轉(zhuǎn)錄全過(guò)程σ亞基：識(shí)別起始點(diǎn)啟動(dòng)子，延長(zhǎng)時(shí)脫落。二、RNA聚合酶

（DNA-dependentRNApolymerase,DDRP）（一）原核生物（coli）RNA聚合酶

1、有4種(5個(gè))亞基α、β、β’、σ核心酶(coreenzyme)催化轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)全酶(holoenzyme)活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起始需要

b

b

bTATAATATATTATTGACAAACTGT+20-55

原核生物ＲＮＡ聚合酶全酶及其在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合ＤＮＡ雙鏈已經(jīng)打開(kāi)σ因子尚未脫落（二）真核生物的RNA聚合酶三、啟動(dòng)子5

3

3

5

結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列RNA-polDNA模板上與RNA聚合酶及其他蛋白因子結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的部位，稱為啟動(dòng)子(promoter)。RNA聚合酶保護(hù)法目錄開(kāi)始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205

3

3

5

原核生物啟動(dòng)子保守序列RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(recognitionsite)5

5

RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因3

3

轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)多為嘌呤，常見(jiàn)的序列CAT,A為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)TATA盒CAAT盒GC盒

增強(qiáng)子

順式作用元件

結(jié)構(gòu)基因-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始真核生物啟動(dòng)子保守序列轉(zhuǎn)錄過(guò)程TheProcessofTranscription

第二節(jié)一、轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個(gè)問(wèn)題：RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域（啟動(dòng)子）

。DNA雙鏈解開(kāi)，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板，合成第一個(gè)磷酸二酯鍵。（一）原核生物的轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始不需引物！RNA-pol的移動(dòng)TTGACAAACTGTTATAATATATTARNA-pol-40-35-30-25-20-15-10-51+5+10+15+20+25啟動(dòng)子保守序列開(kāi)始轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)2.DNA雙鏈打開(kāi)，形成開(kāi)放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(opentranscriptioncomplex)；DNA分子接近-10區(qū)域的部分雙螺旋解開(kāi)后轉(zhuǎn)錄開(kāi)始。

DNA雙鏈解開(kāi)的范圍只在17bp左右，這比復(fù)制中形成的復(fù)制叉小得多。1.

RNA聚合酶全酶(2)識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子，形成閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體（closedtranscriptioncomple）；3.在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成第一個(gè)磷酸二酯鍵：RNApol(

2

)-DNA-pppGpN-OH3

轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:

因子清除5

-pppG-OH+NTP

5

-pppGpN

-OH3

+ppi轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程：第一個(gè)磷酸二酯鍵生成后，轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的構(gòu)象發(fā)生改變，σ亞基從轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物上脫落，核心酶繼續(xù)結(jié)合于DNA模板上，酶沿DNA鏈前移，進(jìn)入延長(zhǎng)階段。E.coli的轉(zhuǎn)錄起始和延長(zhǎng)（二）真核生物的轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化RNA-pol不能直接結(jié)合模板，需與轉(zhuǎn)錄因子(TF)結(jié)合后才能結(jié)合模板。起始過(guò)程比原核生物復(fù)雜。真核生物中不同的RNApol需要不同的基本轉(zhuǎn)錄因子（TF）配合完成轉(zhuǎn)錄的起始和延長(zhǎng)。相對(duì)應(yīng)于RNApolI、RNApolII、RNApolIII，這些TF分別稱為TFI、TFII、TFIII。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)TATA盒CAAT盒GC盒

增強(qiáng)子順式作用元件(cis-actingelement)轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段AATAAA切離加尾轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)修飾點(diǎn)外顯子翻譯起始點(diǎn)內(nèi)含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚體真核生物閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成步驟

①由TFIID中的TBP識(shí)別TATA盒，并在TAFs的協(xié)助下結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)，然后TFIIB與TBP結(jié)合，同時(shí)TFIIB也能與DNA結(jié)合，TFIIA可以穩(wěn)定與DNA結(jié)合的TFIIB-TBP復(fù)合體；②TFIIB-TBP復(fù)合體與RNApolII-TFIIF復(fù)合體結(jié)合，此舉可降低RNApolII與DNA的非特異部位的結(jié)合，協(xié)助RNApolII靶向結(jié)合啟動(dòng)子；③TFIIE和TFIIH加入，形成閉合復(fù)合體，裝配完成。真核RNA聚合酶Ⅱ與通用轉(zhuǎn)錄因子的作用過(guò)程二、轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)σ亞基脫落，核心酶構(gòu)象改變反應(yīng)式:

RNA聚合酶NTP+(NMP)n(NMP)n+1+PPi模板為A，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相應(yīng)為U大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄泡局部結(jié)構(gòu)示意轉(zhuǎn)錄空泡(transcriptionbubble)：RNA-pol（核心酶）

····DNA

····RNA5

3

DNA原核生物轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體RNARNA聚合酶真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程與原核生物大致相似。有核膜相隔，沒(méi)有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。

依賴Rho(ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止（一）原核生物的轉(zhuǎn)錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來(lái)不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來(lái)。分類三、轉(zhuǎn)錄的終止1、依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止ρ因子：RNA上控制轉(zhuǎn)錄終止的蛋白質(zhì)，有ATPase活性和解螺旋酶活性。過(guò)程：(1)ρ因子與RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合

(2)

向RNA3’端滑動(dòng)

(3)RNA聚合酶變構(gòu)停止轉(zhuǎn)錄

(4)DNA:RNA雜化雙鏈拆離

(5)

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物釋放polymerasepolymerase1.依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止ρ3′5′RNAρ5′3′+ATPDNA依賴Rho終止轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物3′末端含有豐富的C（紅色標(biāo)出部分），或者有規(guī)律地出現(xiàn)C堿基。Rho可以結(jié)合此區(qū)段發(fā)揮ATP酶和解螺旋酶的作用。原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄終止因子ρ，是由六個(gè)亞基構(gòu)成的蛋白質(zhì)，分子量46kD。（1）具有結(jié)合RNA的能力（2）有ATP酶和解螺旋酶的活性。當(dāng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3′末端含有豐富的C（或有規(guī)律地出現(xiàn)）時(shí)，就會(huì)與ρ結(jié)合使二者都發(fā)生構(gòu)象的變化，從而使RNA聚合酶停頓。解螺旋酶活性使DNA-RNA雜化鏈分開(kāi)釋放RNA產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄終止。2、不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止特點(diǎn)：①DNA模板靠近終止處連續(xù)A序列，連續(xù)A序列前方富含GC互補(bǔ)區(qū)②轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA終止區(qū)形成發(fā)夾樣或鼓槌狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3’端連續(xù)U區(qū)5′pppG53

35RNA-pol莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理●

發(fā)夾結(jié)構(gòu)改變RNA聚合酶構(gòu)象，使酶停止移動(dòng)；●DNA、RNA各自形成自身雙鏈?zhǔn)闺s交體不穩(wěn)定而分離；●

3′端一連串U，U=A配對(duì)最不穩(wěn)定，易從模板上脫落。轉(zhuǎn)錄與復(fù)制相同點(diǎn)模板都為DNA都需依賴DNA的聚合酶都形成磷酸二酯鍵方向都為5’→3’都遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則轉(zhuǎn)錄與復(fù)制不同點(diǎn)復(fù)制轉(zhuǎn)錄原料dNTP（N=AGCT)NTP(N=AGCU)模板兩條鏈全長(zhǎng)復(fù)制模板鏈轉(zhuǎn)錄(不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄)酶DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物子代雙鏈DNAmRNAtRNArRNA引物RNA引物不需引物堿基配對(duì)A=T；C≡GA=U；T=A；C≡G真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工Post-transcriptionalModification第三節(jié)

一、mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工RNA-polⅡ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，前體為核內(nèi)不均一RNA（hnRNA）。1、mRNA前體5

端帽子的形成5

端帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppGp—)帽子結(jié)構(gòu)5pppG…5GpppGp…pppGppi鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶5

m7GpppGp…甲基轉(zhuǎn)移酶SAM帽子結(jié)構(gòu)的生成5ppG…磷酸酶Pi加入polyA切去3’端過(guò)剩堿基（核酸外切酶）2、mRNA前體3

端加上polyA尾巴(polyAtail)功能：增加mRNA的穩(wěn)定性，mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)，是核糖體的識(shí)別信號(hào)，調(diào)控基因表達(dá)。應(yīng)用：反轉(zhuǎn)錄、分離純化mRNA在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的分子量往往比在胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)的成熟mRNA大幾倍，甚至數(shù)十倍。核酸序列分析證明，mRNA來(lái)自hnRNA，而hnRNA和DNA模板鏈可以完全配對(duì)去除初級(jí)轉(zhuǎn)錄物上的內(nèi)含子，把外顯子連接為成熟RNA的過(guò)程稱為mRNA剪接（mRNAsplicing）。3、mRNA前體的拼接外顯子內(nèi)含子DNAmRNA轉(zhuǎn)錄形成套索RNA，外顯子靠近剪接體去除套索RNA，外顯子連接成熟mRNA真核生物的結(jié)構(gòu)基因由若干編碼區(qū)（外顯子）和非編碼區(qū)（內(nèi)含子）互相隔開(kāi)又連續(xù)鑲嵌而成，為一個(gè)由連續(xù)氨基酸組成的蛋白質(zhì)編碼。斷裂基因(splitegene)CABD編碼區(qū)A、B、C、D非編碼區(qū)外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)

外顯子：在斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。內(nèi)含子：隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過(guò)程中被除去的核酸序列。雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖DNAmRNA雞卵清蛋白基因hnRNA首、尾修飾hnRNA剪接成熟的mRNA雞卵清蛋白基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾內(nèi)含子形成套索RNA被剪除

剪接首先涉及套索RNA（lariatRNA）的形成，即內(nèi)含子區(qū)段彎曲，使相鄰的兩個(gè)外顯子互相靠近而利于剪接。此后，還發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子近3′端的嘌呤甲基化，例如3mG是形成套索所必需的。內(nèi)含子在剪接接口處剪除大多數(shù)內(nèi)含子都以GU為5

端的起始，而其末端則為AG-OH-3

。5

GU……AG-OH-3

稱為剪接接口（splicingjunction）或邊界序列。剪接后，GU或AG不一定被剪除。

剪接過(guò)程需兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)

前體mRNA分子有剪切和剪接兩種模式前體mRNA分子的加工除上述剪接外，還有一種剪切（cleavage）模式。剪切指的是剪去某些內(nèi)含子后，在上游的外顯子3

-端直接進(jìn)行多聚腺苷酸化，不進(jìn)行相鄰?fù)怙@子之間的連接反應(yīng)。剪接是指剪切后又將相鄰的外顯子片段連接起來(lái)，然后進(jìn)行多聚腺苷酸化。前體mRNA分子可發(fā)生可變剪接

許多前體mRNA分子經(jīng)過(guò)加工只產(chǎn)生一種成熟的mRNA，翻譯成相應(yīng)的一種多肽；有些則可剪切或（和）剪接加工成結(jié)構(gòu)有所不同的mRNA，這一現(xiàn)象稱為可變剪接（alternati