重組人干擾素1b對呼吸道合胞病毒感染小鼠淋巴細胞亞群的影響

重組人干擾素1b對呼吸道合胞病毒感染小鼠淋巴細胞亞群的影響

呼吸道感染（gsv）是世界上嬰兒和老年人最常見的呼吸道感染之一，也是氣管哮喘的重要原因。干擾素與炎琥寧、喜炎平雖已用于RSV感染的治療,包括霧化吸入及肌注給藥,但尚缺乏嚴格的對照研究的實驗資料及依據(jù)。本研究比較重組人干擾素α1b與炎琥寧、喜炎平均有抗RSV及調節(jié)T淋巴細胞亞群作用,其中重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入組最為顯著,現(xiàn)報道如下。材料和方法一、gg研究動物中心scxk和rsva亞型ne選取64只清潔級雌性BALB/c小鼠,體重18~22g,購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心(合格證號SCXK(軍)2007-007);RSVA亞型Long株由首都兒科研究所提供;Hep2細胞由本實驗室保存。二、抗小鼠cd3、cd8單克隆抗體重組人干擾素α1b注射液(商品名:運德素,北京三元基因工程有限公司產品,50μg:1ml/支,批號:20120823);炎琥寧(哈藥集團三精加濱藥業(yè)有限公司產品,批號:201108132);喜炎平(江西青峰藥業(yè)有限公司產品,批號:20120704);PerC-P/Cy5標記抗小鼠CD3單克隆抗體、PE標記抗小鼠CD4單克隆抗體、EITC標記抗小鼠CD8單克隆抗體及同型對照、紅細胞裂解液均購自BD公司。霧化器為德國百瑞有限公司生產。三、重組人干擾輔助下的rsv感染小鼠肺組織超微結構檢測方法在各條件下的應用1.細胞培養(yǎng)、RSV懸液制備及病毒滴度測定:按照本實驗室已往報道的方法。2.RSV感染小鼠模型建立及分組:將64只BALB/c小鼠隨機分為8組,分別為陰性對照組、RSV感染陽性組、重組人干擾素α1b(12.5μg/kg)腹腔注射組、重組人干擾素α1b(12.5μg)霧化吸入組、重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入組、利巴韋林123.3mg/kg腹腔注射組、喜炎平61.65mg/kg腹腔注射組、炎琥寧61.65mg/kg腹腔注射組。除陰性對照組外,其余7組小鼠均給予1%戊巴比妥鈉腹腔注射(3ml/kg),待小鼠麻醉后經小鼠鼻腔滴入,RSV懸液(病毒滴度TCID50=10-4.6)100μl,連續(xù)2d。第3天觀察小鼠情況顯示小鼠煩躁不安,呼吸急促,精神萎靡,類似咳嗽、打噴嚏癥狀,表明RSV感染小鼠模型建立成功。3.藥物干預措施:用0.9%氯化鈉稀釋1支50μg/ml的重組人干擾素α1b注射液至25μg/3ml與12.5μg/3ml,分別加入簡易霧化器,將對應組小鼠放入5L透明玻璃圓瓶中,保持空氣通暢,連接霧化器進行霧化吸入,15min/次,2次/d,連續(xù)5d,其余腹腔注射組,按重組人干擾素α1b12.33μg/kg、利巴韋林123.3mg/kg、喜炎平61.65mg/kg、炎琥寧61.65mg/kg連續(xù)腹腔注射5d,各組藥物均按應用劑量稀釋至0.2ml生理鹽水中。4.標本采集和檢測:在藥物干預的第6天對各組小鼠進行摘眼球取血,抗凝處理后送至本校基礎醫(yī)學部免疫學教研室,采用美國FACSCalibur流式胞儀檢測外周血的CD3+CD4+與CD3+CD8+水平,并計算CD3+CD4+/CD3+CD8+。摘眼球取血后,脫頸處死小鼠,無菌剖取小鼠左肺,切取支氣管周1mm3肺組織,分別進行固定、脫水、浸透、包埋、定位、修塊、超薄切片和染色等步驟,透射電鏡觀察小鼠肺組織超微結構改變。余肺組織浸入10%福爾馬林溶液充分固定24h后,送至西京醫(yī)院病理科,制成HE染色切片后,光鏡下觀察小鼠肺組織病理學改變,無菌剖取小鼠右肺,熒光定量RT-PCR法檢測小鼠肺組織RSV載量。四、數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布應用SPSS16.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性者,多組間比較采用One-WayANOVA法,組間兩兩比較采用LSD法;數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布者,多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗,組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗;以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結果一、不同途徑感染rsv的小鼠肺組織病理組織學檢測光鏡下(圖1)可見陰性對照組小鼠肺組織小支氣管、細支氣管腔內無分泌物及炎性細胞滲出;肺泡壁薄,厚度均勻;未見毛細血管充盈擴張,未見炎性細胞浸潤;肺泡腔內干凈,無異常物質。RSV感染陽性組小鼠肺組織小支氣管、細支氣管腔內大量分泌物及炎性細胞滲出;肺泡壁明顯增厚,厚度不均,滿視野可見大量炎性細胞浸潤;肺泡毛細血管明顯擴張充血,肺泡腔內可見粉紅色水腫液生成。其余各組小鼠肺組織相比于RSV感染陽性組小鼠肺組織病理學炎性損傷均有不同程度減輕,其中重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入組效果最為明顯,可見小支氣管、細支氣管腔內分泌物及炎性細胞滲出較少,未見毛細血管充盈擴張;利巴韋林腹腔注射組炎性損傷明顯,可見肺泡壁明顯增厚,厚度不均,可見大量炎性細胞浸潤;肺泡毛細血管明顯擴張充血,肺泡腔內可見粉紅色水腫液生成。二、不同藥物干預組感染陽性小鼠肺組織病理變化及臨床病理反應透射電鏡(圖2)下觀察陰性對照組小鼠肺組織可見,肺泡隔寬度適中,無充血、水腫,肺泡腔大小正常,腔內無異物。RSV感染陽性組可見典型肺實變表現(xiàn),肺泡隔顯著增厚,充血表現(xiàn)明顯,肺泡腔顯著縮小,腔內可見壞死、脫落的碎片,可見大量水腫液。其余各組小鼠肺組織均有不同程度的炎性改變,肺泡隔明顯增厚,肺組織充血,可見凋亡細胞及細胞碎片,其中重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入組較其他藥物干預組炎性損傷程度減輕,可見肺泡隔略增厚,肺泡腔大小基本正常;細胞凋亡現(xiàn)象不明顯。三、兩組小鼠肺組織rsv載量檢測結果比較如表1所示,RSV感染陽性組小鼠肺組織RSV載量檢測結果最高,與其他各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。按重組人干擾素α1b腹腔注射組、利巴韋林腹腔注射組、重組人干擾素α1b(12.5μg)霧化吸入組、炎琥寧腹腔注射組、喜炎平腹腔注射組、重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入順序比較,小鼠肺組織RSV載量檢測結果依次減低,除喜炎平、炎琥寧兩組比較差異無統(tǒng)計學意義外,其他各藥物干預組間比較均有統(tǒng)計學意義(F=62.8,P<0.05)。四、各組小鼠外周血cd3+cd3+cd8+水平比較本研究結果顯示(表2),與RSV感染陽性組比較,其余各組小鼠外周血CD3+CD8+水平均升高,CD3+CD4+與CD3+CD4/CD3+CD8+水平均降低,各藥物干預組與RSV感染陽性組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入組與其余各組比較,小鼠外周血CD3+CD8+水平升高,CD3+CD4+與CD3+CD4/CD3+CD8+水平降低,其余各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。喜炎平腹腔注射組、炎琥寧腹腔注射組CD3+CD8+水平高于其他3組(P<0.05),但兩組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。重組人干擾素腹腔注射組、重組人干擾素α1b(12.5μg)霧化吸入組CD3+CD8+水平高于利巴韋林腹腔注射組(P<0.05),但兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。重組人干擾素α1b(12.5μg)霧化吸入組、喜炎平腹腔注射組、炎琥寧腹腔注射組CD3+CD4/CD3+CD8+水平低于重組人干擾素腹腔注射組及利巴韋林腹腔注射組(P<0.05),但3組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。重組人干擾b對rsv感染小鼠的規(guī)劃與檢測結果影響RSV是嬰幼兒下呼吸道感染的重要病原,其主要病變累及毛細支氣管,亦可累及支氣管和肺泡而致RSV肺炎。本研究采用小鼠經鼻滴RSV法建立感染小鼠模型,這是本實驗室已引用多年的技術,經過光鏡、透射電鏡下觀察小鼠肺組織病理學改變;熒光定量PCR法檢測小鼠肺組織RSV載量,證實給小鼠經鼻內滴入適當負荷量RSV可以建立RSV下呼吸道感染模型,為研究抗RSV打下了基礎。各組藥物劑量均按臨床小兒RSV感染藥物治療標準劑量換算所得?？紤]人與小鼠的劑量換算系數(shù)為12.33,即用于人的藥物劑量分別為重組人干擾素α1b(1μg/kg)肌肉注射、喜炎平(5mg/kg)腹腔注射和炎琥寧(5mg/kg)腹腔注射。T淋巴細胞是細胞免疫的主要效應細胞,CD4+T細胞和CD8+T細胞在抗病毒感染中分別是重要的殺傷效應細胞和免疫調節(jié)細胞:細胞毒性T細胞可通過排粒作用釋放穿孔素和顆粒酶等細胞毒性物質,溶解靶細胞,同時還可通過釋放細胞因子誘導細胞凋亡;調節(jié)性T被認為能抑制T細胞及B細胞功能,起到細胞免疫的負調節(jié)作用。RSV感染可導致T淋巴細胞亞群異常,對支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展有重要影響,而目前尚無特效藥物。重組人干擾素α1b與炎琥寧、喜炎平已用于RSV感染治療,可促進臨床癥狀和體征恢復,縮短病程。但尚缺乏嚴格的對照研究的實驗資料及依據(jù)。從本實驗結果可以看出,重組人干擾素α1b與炎琥寧、喜炎平干預治療后,小鼠肺組織炎性損傷有不同程度恢復,RSV載量顯著下降;重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入對RSV感染小鼠在免疫調節(jié)、肺組織病理學改變、肺組織病毒載量測定均較其他藥物有明顯效果。重組人干擾素α1b(12.5μg)霧化吸入組與重組人干擾素α1b腹腔注射組在肺組織病理學改變上兩組差異并不明顯,但優(yōu)于喜炎平腹腔注射組、炎琥寧腹腔注射組;炎琥寧抗RSV感染作用優(yōu)于喜炎平,這可能與其中藥成分的濃度有關。與RSV感染陽性組比較,重組人干擾素α1b與炎琥寧、喜炎平干預各組小鼠外周血CD3+CD8+水平升高,CD3+CD4+與CD3+CD4+/CD3+CD8+水平降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);其中重組人干擾素α1b25.0μg霧化吸入組,調節(jié)T淋巴細胞亞群作用顯著,喜炎平、炎琥寧腹腔注射組次之,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),喜炎平與炎琥寧兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究結果還顯示上述各組藥物的抗RSV及調節(jié)T淋巴細胞亞群作用均強于利巴韋林腹腔注射。另外,重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入及重組人干擾素α1b(12.5μg)霧化吸入干預采取給藥時間與方法均相同,但在干預RSV