2024屆高考生物一輪總復習第十四單元基因工程及生物技術的安全性與倫理問題第2講重點研究“基因工程操作中限制酶的選擇和PCR技術”教師用書

PAGE第2講重點研究“基因工程操作中限制酶的選擇和PCR技術”基因工程操作中目的基因的獲取和基因表達載體的構建都離不開限制性內切核酸酶，只有選取合適的限制酶才能準確切取目的基因，因此限制酶的選取是基因工程操作的重點也是難點，近年來較難的高考試題大都圍繞限制酶的選取進行考查。PCR技術既可以用于獲取目的基因，又可以用于目的基因的檢測與鑒定，是基因工程中重要技術之一，其應用較強，因此對PCR技術的考查也成為命題的熱點。1．(2021·全國乙卷)用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內切核酸酶的切割位點如圖所示。回答下列問題：(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段之間形成的化學鍵是____________。(3)DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征，如質粒DNA分子上有復制原點，可以保證質粒在受體細胞中能________；質粒DNA分子上有____________________，便于外源DNA插入；質粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞，方法是____________________________________________________________________________________________________________________________。(4)表達載體含有啟動子，啟動子是指___________________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coliDNA連接酶來源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來，而T4DNA連接酶來源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)既可以用E.coliDNA連接酶連接，又可以用T4DNA連接酶連接，而限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)只能用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶將兩個DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。(3)質粒是小型環(huán)狀的DNA分子，常作為基因表達的載體。質粒上含有復制原點，能保證質粒在受體細胞中自我復制；質粒DNA分子上有一個至多個限制酶的酶切位點，便于目的基因的導入；質粒上的標記基因是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，具體做法是用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細胞，能夠存活的即為含有質粒載體的宿主細胞。(4)啟動子是一段特殊序列結構的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得需要的蛋白質。答案：(1)EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ(2)磷酸二酯鍵(3)自我復制一個至多個限制酶切割位點用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細胞，能夠存活的即為含有質粒載體的宿主細胞(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶識別及結合的部位，能驅動轉錄過程2．(2022·山東高考)某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機理，需構建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質結合，但不影響P或P△的功能。(1)為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是______________________________________________。為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。(2)PCR擴增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導入細胞后，融合基因轉錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因對應的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問題的原因是__________________________________________________________________________________________________________________________。修改擴增P基因時使用的帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是__________________________________。(3)融合蛋白表達成功后，將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照圖乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質，分離出與介質結合的物質并用UBC抗體檢測，檢測結果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③組結果的差異推測，藥物A的作用是____________________________；由②④組或③⑤組的差異推測，P△中缺失的特定序列的作用是__________________________________________________。(4)根據(jù)以上結果推測，藥物A治療該病的機理是______________________________________________________________________________。解析：(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，因此設計擴增P基因的引物需要滿足的條件是能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對，并且是短單鏈核酸。DNA聚合酶延伸時，是將脫氧核苷酸添加到引物的3′端，為了不破壞目的基因，該限制酶識別序列應添加在引物的5′端。(2)融合基因轉錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因對應的氨基酸序列與P不同，說明P基因翻譯時出錯。由圖可以看出，P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRⅠ識別序列的最后兩個堿基編碼一個氨基酸，導致mRNA的密碼子被錯位讀取。解決該問題的修改方案是在引物中的EcoRⅠ識別序列3′端添加一個堿基，使EcoRⅠ識別序列不影響P基因的正常翻譯。(3)①組僅添加UBC；②組添加UBC和FLAG-P；③組添加UBC、FLAG-P和藥物A；④組添加UBC和FLAG-P△；⑤組添加UBC、FLAG-P△和藥物A。按題中所述處理后，①組沒出現(xiàn)雜交帶，②③組出現(xiàn)雜交帶，③組雜交帶更加明顯，說明藥物A的作用是增強FLAG-P與UBC的結合。②④組或③⑤組的差異在于②③組含有FLAG-P，出現(xiàn)雜交帶，④⑤組含有FLAG-P△，沒出現(xiàn)雜交帶，據(jù)此推測P△中缺失的特定序列的作用是參與P與UBC的結合。(4)根據(jù)(3)的分析推測，藥物A通過增強P與UBC結合促進P降解，達到治療該病的目的。答案：(1)能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對、短單鏈核酸5′端(2)P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRⅠ識別序列的最后兩個堿基編碼一個氨基酸，導致mRNA的密碼子被錯位讀取在引物中的EcoRⅠ識別序列3′端添加一個堿基(3)增強FLAG-P與UBC的結合參與P與UBC的結合(4)藥物A通過增強P與UBC結合促進P降解知能集成(一)探討基因工程操作中限制酶的選擇方法1．根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類(1)應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。(2)不能選擇切點位于目的基因和標記基因內部的限制酶，如圖甲、乙不能選擇SmaⅠ。(3)為避免目的基因和質粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切點)。2．根據(jù)質粒的特點確定限制酶的種類3．根據(jù)Ti質粒的T-DNA片段選擇限制酶圖中甲、乙、丁Ti質粒均不宜選取，而丙Ti質粒宜選取(設切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：[典例]玉米是重要的糧食作物，其葉片細胞中的P蛋白是一種水通道蛋白，由P基因編碼，在植物生長發(fā)育過程中對水分的吸收具有重要的調節(jié)功能?？蒲腥藛T成功培育出超量表達P蛋白轉基因玉米，所用DNA片段和Ti質粒的酶切位點如圖所示。請回答下列問題：(1)強啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，能被________________識別并結合，驅動基因的持續(xù)轉錄。為使P基因在玉米植株中超量表達，應優(yōu)先選用____________________酶組合，將Ti質粒切開后構建重組表達載體。T-DNA在該實驗中的作用是____________________________________________________________________________________________________。(2)將農桿菌浸泡過的玉米愈傷組織去菌后進行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入______進行篩選，此物質屬于氨基糖苷類抗生素，它能抑制蛋白質在葉綠體和線粒體中合成，使植物的光合作用和________受到干擾，從而引起植物細胞死亡。(3)愈傷組織是一種相對沒有分化的________團，經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)可以分散成胚性單細胞，在適宜的培養(yǎng)基中，這種單細胞可以發(fā)育成__________，再繼續(xù)發(fā)育成轉基因玉米株系。[解析](1)啟動子是RNA聚合酶識別并結合的位點，能驅動基因的轉錄。為使P基因在玉米植株中超量表達，則需要強啟動子，因此應優(yōu)先選用BamHⅠ和SacⅠ酶組合，將Ti質粒切開后構建重組表達載體。農桿菌中Ti質粒上的T-DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上，因此T-DNA在該實驗中的作用是將強啟動子和P基因帶入玉米細胞并整合到玉米細胞染色體DNA上。(2)由圖可知，標記基因是G418抗性基因，因此將農桿菌浸泡過的玉米愈傷組織去菌后進行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入G418進行篩選，此物質屬于氨基糖苷類抗生素，它能抑制蛋白質在葉綠體和線粒體中合成，其中葉綠體是光合作用的場所，線粒體是細胞有氧呼吸的主要場所，因此其可使植物的光合作用和呼吸作用(能量代謝)受到干擾，從而引起植物細胞死亡。(3)愈傷組織是一種相對沒有分化的薄壁細胞團，經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)可以分散成胚性單細胞，在適宜的培養(yǎng)基中，這種單細胞可以發(fā)育成胚狀體，再繼續(xù)發(fā)育成轉基因玉米株系。[答案](1)RNA聚合酶BamHⅠ和SacⅠ將強啟動子和P基因帶入玉米細胞并整合到玉米細胞染色體DNA上(2)G418呼吸作用(能量代謝)(3)薄壁細胞胚狀體[針對訓練]1．為了獲得抗蚜蟲棉花新品種，研究人員將雪花蓮凝集素基因(GNA)和尾穗莧凝集素基因(ACA)與載體(pBI121)結合，然后導入棉花細胞。下列操作與實驗目的不符的是()A．用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA-ACA融合基因B．與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉錄方向正確C．將棉花細胞接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上可篩選出轉基因細胞D．用PCR技術可檢測GNA和ACA基因是否導入棉花細胞中解析：選C由圖可知：GNA、ACA都含有限制酶BsaBⅠ的酶切位點，故用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA-ACA融合基因，A正確；圖中質粒與GNA-ACA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位點，與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉錄方向正確，B正確；由于重組質粒含有卡那霉素的抗性基因，故將棉花細胞接種在含卡那霉素的培養(yǎng)基上可篩選出轉基因細胞，C錯誤；PCR技術可用于基因探針的制備，可用來檢測目的基因是否導入受體細胞，D正確。2．將小菜蛾細胞的羧酸酯酶基因(CarE)導入水稻細胞，培育抗農藥水稻新品種，過程如圖所示。下列敘述錯誤的是()A．必須將含CarE基因的質粒導入水稻的受精卵B．構建重組質粒時，應選用PstⅠ和SmaⅠ分別切割質粒和含CarE基因的DNAC．Tetr的作用是鑒別和篩選含CarE基因的細胞D．通過檢測表達產(chǎn)物來判斷CarE基因在水稻細胞中是否發(fā)揮功能作用解析：選A不一定要將含CarE基因的質粒導入水稻的受精卵，但是導入受精卵效果要好，A錯誤；Tetr是標記基因，是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，C正確。知能集成(二)PCR技術中引物的相關問題分析1．PCR技術和DNA復制的比較項目PCR技術DNA復制場所體外(PCR擴增儀中)細胞內(主要是細胞核內)解旋方式DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化酶耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶溫度條件在較高溫度下進行需控制溫度細胞內溫和條件合成對象DNA片段DNA分子相同點均需要模板(DNA雙鏈)、原料(四種脫氧核苷酸)、能量2.與引物相關的問題歸納概括(1)PCR技術需要引物的原因。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA的復制需要引物。當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，因此DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。(2)PCR擴增中需要引物數(shù)目的計算規(guī)律。若一個DNA分子在PCR中經(jīng)過n輪循環(huán)，理論上需要消耗引物數(shù)為2n＋1－2，第n輪循環(huán)需要消耗的引物數(shù)為2n個。[典例]IKK激酶參與動物體內免疫細胞的分化。臨床上發(fā)現(xiàn)某重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)患兒IKK基因編碼區(qū)第1183位堿基T突變?yōu)镃，導致IKK上第395位酪氨酸被組氨酸代替。為研究該患兒發(fā)病機制，研究人員利用純合野生鼠應用大引物PCR定點誘變技術培育出SCID模型小鼠(純合)，主要過程如圖1、2。分析回答：(1)在PCR反應體系中，除加入引物、IKK基因、緩沖液、Mg2＋等外，還需加入________________________________________________________________________等。(2)在圖1獲取突變基因過程中，需要以下3種引物：引物A5′-CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3′(下劃線字母為突變堿基)引物B5′-TAAGCTTCGAACATCCTA-3′(下劃線部分為限制酶HindⅢ識別序列)引物C5′-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3′(下劃線部分為限制酶SacⅠ識別序列)則PCR1中使用的引物有______________，PCR2中使用的引物有__________和圖中大引物的________(填“①”或“②”)鏈。(3)PCR的反應程序為：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃50s,30個循環(huán)。在循環(huán)之前的94℃3min處理為預變性；循環(huán)中72℃處理的目的是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)據(jù)圖2分析代孕母鼠對移入子宮的胚胎基本不發(fā)生免疫反應，這為________________________提供了可能。(5)研究人員經(jīng)鑒定、篩選獲得一只轉基因雜合鼠F0，并確認突變基因已經(jīng)穩(wěn)定同源替代IKK基因，請你設計完成獲得SCID模型鼠的實驗步驟：①雜交親本：______________，雜交得F1；②F1雌雄鼠隨機交配得F2；③提取F2每只小鼠的基因組DNA，采用分子生物學方法，利用IKK基因探針和突變基因探針進行篩選，則____________________________________________________為模型鼠。[解析](1)在PCR反應體系中，除加入引物、IKK基因、緩沖液、Mg2＋等外，還需加入耐高溫DNA聚合酶、4種脫氧核苷酸等。(2)在PCR1中，獲取的是大引物，大引物中含有突變基因，所以應含有引物A，在基因的右端有限制酶HindⅢ識別的序列，所以要用到引物B；在PCR2中，有一個引物結合到了基因的左端，在它從5′到3′的序列的開始部位應含有限制酶SacⅠ識別的序列，所以要用到引物C；而另外的一個引物就是大引物中的一條鏈，它應該結合到基因的右端，且從5′到3′端的序列中開始部位應含有HindⅢ識別的序列，從圖中看，它是大引物的②鏈。(3)在PCR循環(huán)之前的94℃3min處理為預變性，使DNA雙鏈解開；循環(huán)中72℃處理的目的是使TaqDNA聚合酶從引物起始通過堿基互補配對進行互補鏈合成。(4)代孕母鼠對移入子宮的胚胎基本不發(fā)生免疫反應，這為胚胎在受體內存活提供了可能。(5)①研究人員經(jīng)鑒定、篩選獲得一只轉基因雜合鼠F0，并確認突變基因已經(jīng)穩(wěn)定同源替代IKK基因，若要獲得SCID模型鼠，可讓F0與野生鼠雜交得F1；②F1雌雄鼠隨機交配得F2；③模型鼠中應含有突變基因，但不含IKK基因，故提取F2每只小鼠的基因組DNA，利用IKK基因探針和突變基因探針進行篩選，若IKK基因探針檢測未出現(xiàn)雜交帶，突變基因探針檢測出現(xiàn)雜交帶的則為模型鼠。[答案](1)TaqDNA聚合酶(或熱穩(wěn)定DNA聚合酶)、4種脫氧核苷酸(2)引物A和引物B引物C②(3)使TaqDNA聚合酶從引物起始進行互補鏈合成(4)胚胎在受體內存活(5)①F0×野生鼠③IKK基因探針檢測未出現(xiàn)雜交帶，突變基因探針檢測出現(xiàn)雜交帶[針對訓練]1．農桿菌Ti質粒上的T-DNA可以轉移并隨機插入被侵染植物的染色體DNA中。研究者將圖中被侵染植物的DNA片段連接成環(huán)，并以此環(huán)為模板進行PCR，擴增出T-DNA插入位置兩側的未知序列，以此可確定T-DNA插入的具體位置。下列說法錯誤的是()注：子鏈從引物的3′端開始延伸。A．PCR擴增依據(jù)的是DNA分子雙鏈復制的原理B．進行PCR擴增需要耐高溫的DNA聚合酶C．利用圖中的引物②③組合可擴增出兩側的未知序列D．通過與受體細胞的基因組序列比對，可確定T-DNA的插入位置解析：選CPCR擴增依據(jù)的是DNA分子雙鏈復制的原理，是體外擴增DNA的一種方式，A正確；PCR中變性過程需要在高溫條件下進行，故進行PCR擴增需要耐高溫的DNA聚合酶，B正確；由于DNA的兩條鏈反向平行，且子鏈從引物的3′端開始延伸，故利用圖中的引物①④組合可擴增出兩側的未知序列，C錯誤；通過與受體細胞的基因組序列比對，可確定T-DNA的插入位置，D正確。2．中國某科研團隊研制的重組流感疫苗制備流程如圖1所示。回答下列問題：(1)基因工程的核心步驟是____________________，被用作載體的Ad5應具有的特點有____________________________________________等。(2)對流感重點地區(qū)輸入的人員進行核酸檢測需要用到用含放射性同位素的__________做探針，進行血清抗體檢測的方法是________________雜交。(3)為探究疫苗的注射劑量對志愿者產(chǎn)生的免疫效果，需要給不同組志愿者分別注射____________的疫苗，一段時間后采集血樣檢測相應抗體的水平。(4)流感病毒的檢測最常見的方法是熒光定量RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈式反應)，RT-PCR的具體過程如圖2所示。①過程Ⅰ和Ⅱ都需要加入緩沖液、原料、酶和引物等，其中加入的酶分別是________________________________________________________________________。②RT-PCR過程通過對________的控制影響酶的活性和DNA分子結構，從而使得整個反應過程有序地進行。③過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環(huán)擴增，理論上需要引物B為____________個。解析：(1)基因工程的核心步驟是基因表達載體的構建；作為基因工程的載體需要具備的條件有：能自我復制、有一個或多個切割位點、有標記基因位點、對受體細胞無害等。(2)探針是指放射性同位素或熒光分子標記的目的基因；進行血清抗體檢測的方法是抗原—抗體雜交。(3)探究疫苗的注射劑量對志愿者產(chǎn)生的免疫效果時，自變量是疫苗的劑量，因此需要給不同組志愿者分別注射不同劑量的疫苗，一段時間后采集血樣檢測相應抗體的水平。(4)①Ⅰ為逆轉錄過程，該過程需要逆轉錄酶的催化；Ⅱ為PCR技術擴增過程，該過程需要耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。②RT-PCR過程通過對溫度的控制影響酶的活性和DNA分子結構，從而使得整個反應過程有序地進行。③過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環(huán)的擴增，由于起點是單鏈DNA，經(jīng)過依次循環(huán)形成一個雙鏈DNA分子，每個雙鏈DNA分子都需要一個引物B，因此經(jīng)過n次循環(huán)形成2n－1個子代DNA分子，也需要2n－1個引物B。答案：(1)基因表達載體的構建有一個或多個切割位點、有標記基因位點、對受體細胞無害(2)目的基因抗原—抗體(3)不同劑量(4)①逆轉錄酶、耐高溫的DNA聚合酶②溫度③2n－1[課時驗收評價]1．為增強玉米抗旱性，研究者構建含有某微生物抗旱基因E的重組質粒，用農桿菌轉化法轉入玉米幼胚組織細胞中，獲得抗旱的轉基因玉米。下列相關敘述不正確的是()A．提取該微生物mRNA逆轉錄為cDNA，通過PCR可獲得大量目的基因B．將重組質粒置于經(jīng)CaCl2處理的農桿菌懸液中，可以獲得轉化的農桿菌C．用農桿菌轉化法將E基因轉入玉米幼胚組織細胞需要嚴格進行無菌操作D．用E蛋白的抗體進行抗原—抗體雜交，可在個體水平檢測轉基因玉米的抗旱性狀解析：選D用E蛋白的抗體進行抗原—抗體雜交，可在分子水平檢測轉基因玉米的抗旱性狀，D錯誤。2．如圖是三種限制酶的脫氧核苷酸識別序列和切割位點示意圖(↓表示切點)。下列相關分析錯誤的是()A．這三種限制酶切割出的DNA片段末端都是黏性末端B．不同限制酶切割DNA所得的黏性末端可能相同C．能被限制酶3切割的DNA也能被限制酶1切割D．同一個DNA經(jīng)限制酶1和限制酶3分別切割后所得片段數(shù)一定相等解析：選D能被限制酶3切割的DNA也能被限制酶1切割，但能被限制酶1切割的DNA不一定能被限制酶3切割，故同一個DNA經(jīng)限制酶1和限制酶3分別切割后所得片段數(shù)不一定相等，C正確，D錯誤。3．圖甲、乙中標注了相關限制酶的酶切位點。下列關于培育轉基因大腸桿菌的敘述錯誤的是()A．若通過PCR獲取該目的基因，應該選用引物甲和引物丙B．圖中質粒和目的基因構建表達載體，應選用BclⅠ和HindⅢ剪切C．若將基因表達載體導入受體細胞中，可選用Ca2＋處理法D．在受體細胞中，氨芐青霉素抗性基因和目的基因可同時表達解析：選D通過PCR獲取目的基因時，兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結合，并沿相反的方向合成子鏈，故選用引物甲和引物丙，A正確；由甲圖可知，選用BamHⅠ會破壞兩種抗性基因，結合乙圖可確定應選擇BclⅠ和HindⅢ剪切，B正確；將目的基因導入大腸桿菌常采用Ca2＋處理法，C正確；構建重組質粒時目的基因插入氨芐青霉素抗性基因中，故氨芐青霉素抗性基因被破壞不能表達，D錯誤。4．限制酶的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割和功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的識別序列及切割位點分別為↓GATC、G↓AATTC、C↓GATCC。含某目的基因的DNA片段如圖所示，若利用質粒A(含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點各1個)構建基因表達載體，為克服目的基因和質粒A的自身環(huán)化以及目的基因與質粒的任意連接等。下列對限制酶的選擇，正確的是()A．用限制酶EcoRⅠ或BamHⅠ處理含某目的基因的DNA和質粒AB．用限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ處理含某目的基因的DNA和質粒AC．用限制酶Sau3AⅠ和EcoRⅠ處理含某目的基因的DNA和質粒AD．用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ處理含某目的基因的DNA和質粒A解析：選D用限制酶Sau3AⅠ切割目的基因會破壞目的基因，質粒含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點，獲取目的基因也可以用限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ進行切割，但為了防止目的基因或質粒自身環(huán)化，需要使用不同種限制酶進行切割，則可以使用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ切割質粒和目的基因。5．植株在干旱、低溫等逆境中，脫水素(具有一定抗干旱脅迫和耐冷凍能力的蛋白質)被誘導表達，脫水素基因編碼區(qū)共含678個堿基對。科學家利用如圖所示PBⅠ121質粒，以及XbaⅠ和SacⅠ兩種限制酶，運用農桿菌轉化法，將脫水素基因導入草莓試管苗葉片細胞，再經(jīng)植物組織培養(yǎng)獲得脫水素基因過量表達的轉基因草莓植株。下列相關敘述錯誤的是()A．重組質粒利用SacⅠ和HindⅢ切割后能得到1500bp片段，則表明目的基因正確插入質粒B．組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基需添加卡那霉素和新霉素以便篩選轉基因植株C．可以利用PCR技術鑒定目的基因是否整合到草莓染色體的DNA上D．轉基因草莓植株批量生產(chǎn)前需進行抗干旱、耐冷凍實驗解析：選B根據(jù)分析可知，由于重組質粒上移除1900bp而補充了脫水素基因的678個堿基對，加上未移除的822bp，所以用SacⅠ和HindⅢ切割重組質粒后，可得到822＋678＝1500bp的新片段，據(jù)此可確定目的基因正確插入了質粒，A正確；題中提供的限制酶切割位點對卡那霉素抗性基因沒有影響，所以無論是否插入了目的基因，卡那霉素抗性基因都可以表達，起不到篩選轉基因植株的作用，B錯誤；PCR技術是進行DNA擴增的技術，需要一段引物來進行擴增，依照脫水素基因的核苷酸序列設計一段引物，若能進行擴增，說明轉入目的基因成功，C正確；植株批量生產(chǎn)前，需要在個體水平上進行抗干旱、耐冷凍實驗，以確保轉基因植物中的脫水素基因表達出了蛋白質并發(fā)揮了作用，使植物表現(xiàn)為抗干旱、耐冷凍，D正確。6．研究表明，服用α-干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。人參是一種名貴藥材，具有較好的滋補作用。如圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細胞的流程，①～④表示相關的操作。若限制酶EcoRⅠ識別，BamHⅠ識別。下列說法錯誤的是()A．步驟①中，利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據(jù)是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列B．在過程③中T-DNA整合到受體細胞的染色體DNA上C．科研人員在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列，目的是方便后續(xù)的剪切和連接D．過程④中，科研人員最終未能檢測出干擾素基因，其原因可能是干擾素基因未能導入人參愈傷組織細胞解析：選B步驟①中，利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據(jù)是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列，A正確；過程③是將重組質粒導入根瘤農桿菌，而在侵染人參愈傷組織細胞時，T-DNA整合到受體細胞的染色體DNA上，B錯誤；由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ兩種限制酶切割目的基因和質粒，因此在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列，以便后續(xù)的剪切和連接，C正確；干擾素基因未能導入人參愈傷組織細胞或導入人參愈傷組織細胞的干擾素基因未能轉錄，均會導致不能檢測出干擾素基因，D正確。7．(2023·中山調研)人類胰島素基因位于第11號染色體上，長度為8416bp，人類胰島素的氨基酸序列已知?；卮鹣铝邢嚓P問題。(1)上圖是利用PCR技術獲取人胰島素基因的方法，除了此方法外，還可以利用的方法是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)利用PCR技術獲取人胰島素基因，在緩沖液中除了要添加模板和引物外，還需要添加的物質有________________________________________________________________________。(3)經(jīng)過________輪循環(huán)可以得到所需的目的基因，一個DNA分子經(jīng)過5輪循環(huán)，需要引物A________個，從PCR的過程和DNA分子的特點，試著寫出設計引物需要注意的問題：________________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出2點即可)。(4)利用SDS-凝膠電泳分離不同DNA分子，遷移速度與________________________________________________________________________等有關。(5)利用圖示方法獲取的目的基因，直接構建基因表達載體后導入大腸桿菌，________(填“能”或“不能”)表達出人胰島素，理由是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)(2)解析略。(3)題圖中引物A和引物B在DNA片段內部，根據(jù)PCR的過程和DNA分子半保留復制的特點可知，前兩輪循環(huán)產(chǎn)生的4個DNA分子的兩條鏈均不等長，第三輪循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子存在等長的兩條核苷酸鏈，即目的基因。其過程圖如下：第一輪：第二輪：由①得到的DNA分子如下：由②得到的DNA分子如下：第三輪：由①可得由②可得從理論上推測，一個DNA分子經(jīng)n次循環(huán)合成的DNA分子為2n個，脫氧核苷酸鏈數(shù)為2n＋1，新合成的脫氧核苷酸鏈數(shù)為2n＋1－2，而每合成一條脫氧核苷酸鏈需要一個引物，所以共需要消耗2n＋1－2個引物，即25＋1－2＝62(個)，其中引物A為31個。設計引物時需要注意以下幾點：引物自身及引物之間不能有互補序列，以防止自身或相互連接；引物長度適當?shù)取?4)(5)解析略。答案：(1)從基因文庫獲取或人工合成(2)四種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶(3)331引物自身不能有互補序列；引物之間不能有互補序列(4)凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象(5)不能因為此方法獲得的目的基因中含有內含子，大腸桿菌無法正常識別內含子，而對內含子部分轉錄的mRNA進行翻譯，導致合成的蛋白質出現(xiàn)錯誤階段驗收評價(六)生物技術與工程一、選擇題(本題共16小題，共40分。第1～12小題，每小題2分；第13～16小題，每小題4分。每題只有一個正確選項)l1．下列關于滅菌和消毒的說法，錯誤的是()A．滅菌可殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子B．消毒不能殺死微生物的營養(yǎng)細胞和一部分芽孢C．紫外線消毒常用于培養(yǎng)環(huán)境的空氣消毒和一般物品的表面消毒D．干熱滅菌法適用于玻璃器皿(如吸管、培養(yǎng)皿等)、金屬用具等的滅菌解析：選B滅菌可殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而消毒是指用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部的一部分微生物的過程，可以殺死微生物的營養(yǎng)細胞和一部分芽孢，A正確，B錯誤；對于培養(yǎng)環(huán)境的空氣消毒和一般物品的表面消毒可以采用紫外線消毒法，其原因是紫外線能夠使雜菌的蛋白質變性，使雜菌的DNA結構遭到破壞，從而失去活性，C正確；耐高溫的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培養(yǎng)皿等)和金屬用具等，可以采用干熱滅菌法滅菌，D正確。2．黃酒是世界上古老的酒類之一，源于中國，以糯米、黍米、粟為原料，一般酒精含量為14%～20%，酒的品質取決于菌種。下圖表示釀制黃酒的一種工藝流程。下列有關敘述正確的是()A．菌種a能產(chǎn)生淀粉酶，淀粉作為菌種a的碳源和氮源B．菌種b增殖過程中，產(chǎn)生的酒精分子數(shù)等于CO2分子數(shù)C．菌種b產(chǎn)生的酒精的跨膜運輸不需要載體蛋白協(xié)助D．工藝c表示滅菌，目的與“蒸煮”相同解析：選C根據(jù)酶的專一性，淀粉酶分解、利用的是原料中的淀粉，淀粉為菌種a提供碳源，而不能作為氮源物質，A錯誤；菌種b在有氧呼吸和無氧呼吸過程中均會增殖，只是增殖速率不同，而只有無氧呼吸產(chǎn)生的酒精分子數(shù)等于CO2分子數(shù)，B錯誤；菌種b在細胞質基質中經(jīng)無氧呼吸(酒精發(fā)酵)產(chǎn)生酒精，以自由擴散的方式運輸?shù)郊毎?，不需要載體蛋白協(xié)助，C正確；工藝c為消毒，“蒸煮”有利于糖化，同時也會殺死大多數(shù)微生物，D錯誤。3．固態(tài)發(fā)酵釀酒流程一般包括選糧、浸泡、蒸煮、攤涼、下曲、堆積發(fā)酵、入窖發(fā)酵等步驟，其發(fā)酵基質中幾乎不含有可流動的水分。下列相關敘述錯誤的是()A．攤涼后再下曲，主要是為了防止高溫導致酒曲中的微生物死亡B．入窖發(fā)酵時如密封不嚴，可能會導致乳酸菌大量繁殖影響酒質C．固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵相比其基質含氧量更高，利于微生物的繁殖D．固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵比產(chǎn)生的廢水較少，更利于環(huán)保解析：選B攤涼后再下曲，主要是為了防止高溫導致酒曲中的微生物死亡，避免發(fā)酵失敗，A正確；入窖發(fā)酵時如密封不嚴，不會導致乳酸菌大量繁殖，因為乳酸菌是厭氧微生物，B錯誤；固態(tài)發(fā)酵中基質與氣體的接觸面積大，供氧充足，因此固體發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵相比其基質含氧量更高，因而有利于微生物通過有氧呼吸獲取大量的能量，進而有利于其大量繁殖，C正確；固態(tài)發(fā)酵的基質中幾乎不含有可流動的水分，因此固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵相比產(chǎn)生的廢水較少，更有利于環(huán)保，D正確。4．研究者從被柴油污染的土壤中獲取了3種柴油降解菌進行研究，結果見下表。下列敘述不正確的是()菌株柴油濃度/%1245Y190.960.853.541.0Y292.8－－－Y370.142.5－－注：“－”表示菌株不能生長。A．為獲得降解菌，應用以柴油為唯一碳源的培養(yǎng)基B．所用培養(yǎng)基和土壤樣液均需進行嚴格滅菌C．可采用稀釋涂布平板法獲得降解菌的單菌落D．Y1對高濃度柴油的耐受性更強解析：選B要獲得能降解柴油的菌種，需以柴油為唯一的碳源制備的培養(yǎng)基才有篩選作用，A正確；所用培養(yǎng)基需進行嚴格滅菌，以防止雜菌污染，若土壤樣液滅菌，則會連所需菌種一起殺死，B錯誤；可采用稀釋涂布平板法或平板劃線法獲得降解菌的單菌落，C正確；由表格可知，Y1對高濃度柴油的耐受性更強，D正確。5．我國科學家從北極分離、鑒定出了一種耐冷細菌，過程如下：①接種在人造海水中，在15℃振蕩培養(yǎng)3小時；②梯度稀釋后將樣品涂布在TYS培養(yǎng)基中(0.5%胰蛋白胨、0.1%酵母提取物、1.5%瓊脂)，15℃培養(yǎng)7天；③挑取生長的菌落，進行劃線，15℃培養(yǎng)后選擇不同形態(tài)的菌落進行進一步的培養(yǎng)、鑒定和保藏。下列說法不正確的是()A．人造海水、儀器等在使用前需要進行滅菌處理B．TYS培養(yǎng)基是含有機碳源、氮源的固體培養(yǎng)基C．涂布后再次劃線培養(yǎng)的目的是進一步純化所得菌種D．分析所有菌落，能還原采樣點所有微生物的種類與含量解析：選D人造海水、儀器等在使用前需要進行滅菌處理，否則會有雜菌污染，A正確；TYS培養(yǎng)基中有0.5%胰蛋白胨、0.1%酵母提取物、1.5%瓊脂，因此TYS培養(yǎng)基是含有機碳源、氮源的固體培養(yǎng)基，B正確；涂布后再次劃線培養(yǎng)的目的是進一步純化所得菌種，C正確；由于培養(yǎng)條件限制，有一些菌種無法培養(yǎng)出，因此不能還原采樣點所有微生物的種類與含量，D錯誤。6．科學家利用番茄和馬鈴薯的葉肉細胞原生質體進行融合，培育出了“番茄－馬鈴薯”。但它并沒有像科學家預想的那樣，地上結番茄、地下結馬鈴薯。下列說法錯誤的是()A．該培育過程克服了遠緣雜交不親和的障礙B．人工誘導原生質體融合的方法有離心法、電融合法及PEG融合法等C．生物體內基因的表達不是孤立的，番茄－馬鈴薯的遺傳物質可能相互干擾D．原生質體融合得到的雜種細胞直接經(jīng)再分化即能形成雜種植株解析：選D植物體細胞雜交可以將2個不同物種的細胞雜合在一起，克服了遠緣雜交不親和的障礙，A正確；人工誘導原生質體融合的方法有物理法和化學法兩大類，物理法包括離心法、電融合法等，化學法包括聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋-高pH融合法等，B正確；番茄－馬鈴薯雜種植株含有兩種親本的遺傳物質，但生物基因的表達不是孤立的，它們之間是相互調控、相互影響的，C正確；原生質體融合得到的雜種細胞，需經(jīng)脫分化和再分化才能形成雜種植株，D錯誤。7．Rag基因缺失小鼠不能產(chǎn)生成熟的淋巴細胞?？蒲腥藛T通過誘導Rag基因缺失小鼠的體細胞獲得誘導多能干細胞(iPS細胞)，然后將Rag基因導入iPS細胞并誘導使其分化為造血干細胞，再移植到Rag基因缺失小鼠體內進行治療。下列分析錯誤的是()A．誘導獲得iPS細胞時需要在體細胞中表達一些關鍵基因B．培養(yǎng)iPS細胞時需提供95%空氣和5%CO2的混合氣體環(huán)境C．利用顯微注射技術可以將Rag基因直接注入到iPS細胞D．利用iPS細胞進行治療存在導致小鼠發(fā)生腫瘤的風險解析：選C誘導獲得iPS細胞時是脫分化的過程，根本原因也是基因的選擇性表達，需要在體細胞中表達一些關鍵基因，A正確；培養(yǎng)iPS細胞時需提供95%空氣(提供氧氣，有助于細胞呼吸)和5%CO2(有助于維持培養(yǎng)液的pH)的混合氣體環(huán)境，B正確；直接注射基因容易導致基因丟失，一般需要將Rag基因和載體連接形成重組DNA分子再顯微注射到iPS細胞，C錯誤；iPS細胞為多能干細胞，可以誘導其進行不同方向的分化，利用iPS細胞并誘導使其分化為造血干細胞，造血干細胞分裂旺盛，存在導致小鼠發(fā)生腫瘤的風險，D正確。8．黃曲霉毒素在保存不當?shù)拿棺兗Z油食品中含量較高，具有很強的致癌性。研究表明黃曲霉毒素能引起細胞中粗面內質網(wǎng)上的核糖體不斷脫落?？蒲腥藛T用黃曲霉毒素偶聯(lián)抗原制備出單克隆抗體以檢測食品中黃曲霉毒素的含量。下列敘述錯誤的是()A．當人誤食黃曲霉毒素后，腸腺細胞可能發(fā)生消化酶的合成分泌減少B．可用電融合法、PEG法或滅活的病毒誘導B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的融合C．細胞融合體現(xiàn)了細胞膜的流動性，雜交瘤細胞體外增殖體現(xiàn)了細胞的全能性D．單克隆抗體用于檢測食品中黃曲霉毒素的原理是抗原—抗體雜交解析：選C消化酶屬于分泌蛋白，需粗面內質網(wǎng)的核糖體參與合成，根據(jù)題干信息“研究表明黃曲霉毒素能引起細胞中粗面內質網(wǎng)上的核糖體不斷脫落”，會影響消化酶(分泌蛋白)的合成和分泌，A正確；誘導動物細胞融合的常用方法有PEG融合法、電融合法和滅活病毒誘導法等，可用以上方法誘導B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的融合，獲得雜交瘤細胞，B正確；動、植物細胞融合都能體現(xiàn)細胞膜的流動性，雜交瘤細胞體外增殖不能體現(xiàn)細胞的全能性，C錯誤；抗體與抗原結合具有特異性，單克隆抗體是化學性質單一、特異性強的抗體，能與黃曲霉毒素特異性結合，其原理是抗原—抗體雜交，D正確。9．“生物導彈”主要由兩部分組成，一是“瞄準裝置”，二是殺傷性“彈頭”。下列敘述錯誤的是()A．“脾臟中的細胞”是從經(jīng)免疫處理的實驗動物獲取的B淋巴細胞B．圖中的雜交瘤細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)會出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象C．單克隆抗體的靶向作用使③過程具有高度特異性D．構成“彈頭”的抗癌藥物沒有選擇殺傷癌細胞的功能解析：選B制備單克隆抗體時，先給實驗動物注射特定抗原使之發(fā)生免疫反應，之后從實驗動物脾臟中獲取已經(jīng)免疫的B淋巴細胞，故“脾臟中的細胞”是從經(jīng)免疫處理的實驗動物獲取的B淋巴細胞，A正確；最終獲得的雜交瘤細胞能夠無限增殖，在體外培養(yǎng)過程中不會出現(xiàn)接觸抑制的現(xiàn)象，B錯誤；過程③中由于單克隆抗體具有高度特異性，使其靶向作用非常準確，C正確；構成“彈頭”的化學藥物、細胞毒素等物質沒有選擇殺傷癌細胞的功能，而單克隆抗體能將這種殺傷功能定位，D正確。10．將人抗體基因插入噬菌體DNA，然后讓該噬菌體感染大腸桿菌，表達的抗體可能和病毒蛋白以融合蛋白的形式，附著在噬菌體表面，也可能通過大腸桿菌分泌出去。下列敘述錯誤的是()A．可從人的B細胞中獲取總RNA，通過逆轉錄、PCR技術擴增出抗體基因B．為防止抗體被降解，在實驗中應選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細胞C．在把抗體基因導入受體細胞過程中，必須用Ca2＋處理大腸桿菌D．通過該方法生產(chǎn)的抗體具有靈敏度高、特異性強的特點解析：選C人體中B細胞的種類繁多，為獲得相應的抗體基因，可提取人體B細胞中的總RNA，通過逆轉錄獲得目的基因，再通過PCR技術擴增，最后篩選出目的基因，A正確；對于大腸桿菌來說，目的基因表達的抗體屬于外來蛋白質，會被蛋白酶分解，因此應選擇蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細胞，B正確；由題意可知，以噬菌體DNA為載體，插入抗體基因形成重組噬菌體，利用噬菌體的特性感染大腸桿菌，將抗體基因運進受體細胞中，不需要用Ca2＋處理大腸桿菌，C錯誤；利用該方法生產(chǎn)的抗體種類單一、純度高，因而具有靈敏度高、特異性強的特點，D正確。11．堿裂解法是一種應用廣泛的制備質粒DNA的方法，其基本原理是基于大分子DNA與質粒DNA變性與復性的差異而達到分離目的，流程如下。下列說法錯誤的是()eq\x(\a\al(菌體,獲取))→eq\x(\a\al(加入強堿,pH＝12.6溶液))→eq\x(\a\al(加入緩沖液調,pH至中性))→eq\x(\a\al(離心、,沉淀等))A．質粒屬于小型環(huán)狀雙鏈DNAB．離心、沉淀后應棄上清液取沉淀物C．加入強堿處理的目的是使DNA氫鍵斷裂，為后續(xù)步驟作準備D．加入緩沖液處理的結果是只有質粒DNA能夠正常復性解析：選B質粒是一種裸露的、結構簡單、具有自我復制能力的小型雙鏈環(huán)狀DNA分子，A正確；變性的質粒DNA可恢復原來的構型，保存在溶液中，而大分子DNA不能復性而形成纏連的網(wǎng)狀結構，通過離心質粒DNA留在上清液中，B錯誤，D正確；在pH為12.6的堿性條件下，大分子DNA和質粒DNA的氫鍵斷裂，為后續(xù)作準備，C正確。12．在試管嬰兒的培育過程中，培養(yǎng)有兩種選擇，可選擇不同時期的胚胎進行移植。第一種是精卵細胞結合后在體外培養(yǎng)3天，成為卵裂期胚胎；第二種是讓卵裂期胚胎繼續(xù)發(fā)育2天，直到第5天發(fā)育成為囊胚。不是所有的卵裂期胚胎都能繼續(xù)發(fā)育，有些會停止分裂，即培育失敗。下列敘述中正確的是()A．從卵巢中分離出的卵細胞可以直接與獲能的精子完成受精作用B．在卵裂時期，胚胎的總體積并不會增加但細胞的數(shù)量不斷增加C．體外受精后5天對胚胎的質量進行檢查，以確定胚胎是否具有發(fā)育為囊胚的能力D．培養(yǎng)3天的胚胎比培養(yǎng)5天的胚胎全能性強，胚胎移植后更容易發(fā)育成完整個體解析：選B從卵巢中分離的卵細胞因發(fā)育程度不同，不能直接與獲能精子完成受精作用，需要對卵細胞進行培養(yǎng)至MⅡ期，A錯誤；卵裂時期是在透明帶內進行的分裂，所以卵裂過程細胞總數(shù)在增加，胚胎總體積并不增加，B正確；體外受精后5天，胚胎已經(jīng)發(fā)育為囊胚或已經(jīng)停止分裂，因此應該是體外受精后3天對胚胎的質量進行檢查，以確定是否具有發(fā)育為囊胚的能力，C錯誤；體外受精后培養(yǎng)3天的胚胎為卵裂期胚胎，體外受精后培養(yǎng)5天的胚胎為囊胚期胚胎，因為不是所有卵裂期胚胎都能繼續(xù)發(fā)育，故胚胎移植后囊胚期胚胎更容易發(fā)育成完整個體，D錯誤。13．在體細胞克隆猴培育過程中，為調節(jié)相關基因的表達，提高胚胎的發(fā)育率和妊娠率，研究人員將組蛋白去甲基化酶(Kdm4d)的mRNA注入了重構胚，同時用組蛋白脫乙酰酶抑制劑(TSA)處理，具體培育流程如下圖所示。下列說法正確的是()A．去核時使用的差速離心、紫外線長時間照射和化學物質處理等方法都沒有穿透卵母細胞的透明帶B．卵母細胞在去核環(huán)節(jié)實際操作中被去除的不是核膜包被的細胞核，而是紡錘體－染色體復合物C．組蛋白甲基化和乙?；谋碛^遺傳修飾都不利于重構胚的分裂和發(fā)育D．為得到遺傳背景相同的克隆猴用于科研，可用機械方法將早期胚胎隨機切割成2份或4份后再進行胚胎移植解析：選B核移植技術中普遍使用的去核方法是顯微操作法，也可以采用梯度離心、紫外線短時間照射、化學物質處理等，A錯誤；將卵母細胞培養(yǎng)到MⅡ期后進行去核操作，此時卵母細胞中的“核”其實是紡錘體－染色體復合物，去核事實上是去除卵母細胞的紡錘體－染色體復合物，B正確；將組蛋白去甲基化酶(Kdm4d)的mRNA注入重構胚，同時用組蛋白脫乙酰酶抑制劑處理重構胚，這樣可降低組蛋白的甲基化水平，提高組蛋白的乙?；?，從而改變組蛋白的表觀遺傳修飾來調控基因表達，C錯誤；為得到遺傳背景相同的克隆猴用于科研，可用機械方法將早期胚胎均勻切割成2份或4份后再進行胚胎移植，D錯誤。14.農桿菌特有的T-DNA能夠提高其對宿主細胞的轉化，進而使宿主長出冠癭瘤。如圖為T-DNA上的部分結構，有關分析錯誤的是()A．T-DNA是Ti質粒上特有的序列，在基因工程中廣泛應用B．T-DNA整合到宿主細胞基因組DNA上可能會導致基因突變C．T-DNA結構的完整性是誘導宿主植株產(chǎn)生冠癭瘤的重要條件D．農桿菌通過改變植物激素的種類與比例誘導細胞的分化方向解析：選AT-DNA是農桿菌特有的序列，該序列可存在于農桿菌所有DNA中，不是Ti質粒所特有的，A錯誤；基因突變是指DNA分子中堿基對的增添、替換或缺失而引起基因堿基序列的改變，故T-DNA整合到宿主細胞基因組DNA上可能會導致基因突變，B正確；基因的結構決定功能，基因要表達功能應保證其具有完整性，故T-DNA結構的完整性是誘導宿主植株產(chǎn)生冠癭瘤的重要條件，C正確；據(jù)圖可知，重組質粒上有生長素合成基因和細胞分裂素合成基因，可通過改變植物激素的種類與比例誘導細胞的分化方向，D正確。15．如圖是一種靶向基因敲除技術即TALEN技術。該技術的敲除工具是由DNA識別域TALE和非特異性內切核酸酶FoKI兩個部分組成的蛋白質。TALE的二連氨基酸(字母N、I、G、H、D分別代表一種氨基酸)與四種堿基(A、G、C、T)有恒定的對應關系。FoKI是一種形成二聚體后具有內切核酸酶活性的蛋白單體。下列相關敘述錯誤的是()A．單獨使用FoKI對基因的切割敲除具有隨機性B．TALE蛋白的合成通常涉及PCR技術和蛋白質工程C．二連氨基酸能與四種含氮堿基發(fā)生恒定的堿基互補配對D．TALE蛋白左右臂的二連氨基酸序列的設計依據(jù)靶基因堿基序列解析：選CFoKI是非特異性內切核酸酶，單獨使用FoKI對基因的切割敲除具有隨機性，A正確；TALE蛋白的合成通常涉及PCR技術和蛋白質工程，B正確；氨基酸內沒有堿基，不能與四種含氮堿基發(fā)生恒定的堿基互補配對，只是存在恒定的對應關系，C錯誤；由于TALE的二連氨基酸與四種堿基有恒定的對應關系，TALE蛋白左右臂的二連氨基酸序列的設計依據(jù)靶基因堿基序列，D正確。16．為確定W基因在染色體上的位置，研究人員進行了操作：①破裂細胞后將染色體固定在玻片上，去除mRNA及染色體上的蛋白質，拍攝染色體得到顯微照片1；②制備32P標記的W基因探針(單鏈DNA)；③將玻片上的染色體DNA變性為單鏈后，置于含W基因放射性探針的雜交溶液中溫育一段時間；④洗脫玻片上未雜交的放射性探針，對玻片進行放射性自顯影處理得到照片2；⑤將照片1和照片2疊加，確定W基因所在染色體及位置。下列分析錯誤的是()A．可用A－32P～P～P制備W基因的放射性探針B．W基因探針的堿基序列與W基因中某條單鏈的部分堿基序列相同或互補C．去除染色體上的蛋白質并將DNA變性為單鏈有利于DNA與探針完成雜交D．若不去除mRNA，對實驗結果會產(chǎn)生干擾解析：選AW基因探針為單鏈DNA，可用dA－32P～P～P制備W基因的放射性探針，A錯誤；W基因所在的DNA是堿基互補的兩條鏈，W基因探針能與W基因中的一條單鏈進行堿基互補配對，因此W基因探針的堿基序列與W基因中某條單鏈的部分堿基序列相同或互補，B正確；染色體主要是由蛋白質和DNA組成的，同時DNA是雙鏈結構，而探針是單鏈DNA，因此去除染色體上的蛋白質并將DNA變性為單鏈有利于DNA與探針完成雜交，C正確；DNA可與mRNA發(fā)生部分的堿基互補配對，因此若不去除mRNA，會對實驗結果產(chǎn)生干擾，D正確。二、非選擇題(本題共5小題，共60分)17．(10分)我們生活中已經(jīng)離不開傳統(tǒng)發(fā)酵技術制作的食品，酸奶、果酒、果醋、霉豆腐、泡菜等極大地滿足了人們對飲食多元化發(fā)展的需求。(1)釀制果酒開始時要先通氣，其目的是________________________________。若要進一步檢測所得果酒中活體酵母菌的密度，可采用________________法，但此方法最終計算得出的菌體數(shù)往往比實際數(shù)目低。(2)食用醋的乙酸濃度通常在5%～8%，白酒的酒精濃度在38%～60%，一般情況下先有酒再有醋，但醋的價格往往比白酒低，試結合釀造工藝分析可能的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________(寫出一點即可)。(3)現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)霉豆腐要嚴格控制無菌環(huán)境，對豆腐滅菌宜采用______________法。從微生物培養(yǎng)的角度看，豆腐是________培養(yǎng)基，豆腐為主要菌種毛霉生長繁殖提供______________等營養(yǎng)物質。解析：(1)釀制果酒開始時要先通氣，使酵母菌進行有氧呼吸進而大量繁殖，增加菌體數(shù)量，可減少發(fā)酵時間；若要進一步檢測所得果酒中活體酵母菌的密度，可采用稀釋涂布平板法，由于可能兩個或多個酵母菌共同形成一個菌落，其最終計算得出的菌體數(shù)往往比實際數(shù)目低。(2)食用醋的乙酸濃度通常在5%～8%，白酒的酒精濃度在38%～60%，一般情況下先有酒再有醋，但醋的價格往往比白酒低，根據(jù)二者的釀造工藝分析，其可能的原因是酒比醋需要的發(fā)酵產(chǎn)物量大；無色透明和有品質保證的酒要通過蒸餾得到，而乙酸不用蒸餾得到等。(3)豆腐相當于毛霉生長的培養(yǎng)基，所以滅菌的方法是高壓蒸汽滅菌法；從物理性質上看，豆腐是固體培養(yǎng)基；培養(yǎng)基的成分一般包含水、無機鹽、碳源、氮源等，故豆腐為主要菌種毛霉生長繁殖提供水、無機鹽、碳源、氮源等營養(yǎng)物質。答案：(1)讓酵母菌進行有氧呼吸從而大量繁殖稀釋涂布平板(2)酒比醋需要的發(fā)酵產(chǎn)物量大；無色透明和有品質保證的酒要通過蒸餾得到，而乙酸不用蒸餾得到(寫出一點即可)(3)高壓蒸汽滅菌固體水、無機鹽、碳源、氮源18．(11分)某實驗室利用保加利亞乳桿菌和乳脂鏈球菌(均屬于乳酸菌)，采用固定化技術(將游離微生物固定在一定空間內)對單菌種發(fā)酵和雙菌種發(fā)酵進行了研究。實驗步驟如下，回答下列問題：表1pH對固定化發(fā)酵的影響pH6.56.05.55.04.5乳酸產(chǎn)量/g－4.957.814.70－表2單菌種與雙菌種固定化發(fā)酵菌種保加利亞乳桿菌乳脂鏈球菌雙菌種乳酸產(chǎn)量/g7.687.838.90表3雙菌種固定化方式對發(fā)酵的影響固定化方式分別固定，1∶1混合1∶1混合之后固定乳酸產(chǎn)量/g8.927.65注：以上表內數(shù)據(jù)為100mL發(fā)酵液每小時的產(chǎn)酸量，發(fā)酵時間為3h。(1)乳酸菌屬于厭氧微生物，因此發(fā)酵時需要提供______條件；發(fā)酵所用的鮮牛奶中不能含有抗生素，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)篩選乳酸菌高產(chǎn)菌株時可在固體培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，培養(yǎng)一段時間后，選取菌落周圍__________________________，即為高產(chǎn)菌株。(3)將固定化細胞顆粒裝入滅菌的反應器中，并加入滅菌牛奶，開始發(fā)酵。據(jù)表1中數(shù)據(jù)分析，一段時間后，乳酸產(chǎn)生的速度減慢的原因可能是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)據(jù)表2、表3中數(shù)據(jù)分析，對產(chǎn)酸最有利的發(fā)酵方式是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)乳酸菌屬于厭氧微生物，因此發(fā)酵時需要提供無氧條件；由于抗生素會抑制乳酸菌的活性，導致發(fā)酵失敗，因此發(fā)酵所用的鮮牛奶中不能含有抗生素。(2)篩選乳酸菌高產(chǎn)菌株時可在固體培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，培養(yǎng)一段時間后，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸可以將碳酸鈣分解形成透明圈，選取菌落周圍透明圈與菌落直徑比例大的，即為高產(chǎn)菌株。(3)將固定化細胞顆粒裝入滅菌的反應器中，并加入滅菌牛奶，開始發(fā)酵。據(jù)表1中數(shù)據(jù)分析，發(fā)酵一段時間后，發(fā)酵液pH下降，乳酸菌活性受到抑制，乳酸產(chǎn)生的速度減慢。(4)據(jù)表2、表3中數(shù)據(jù)分析，采用雙菌種，先分別固定再1∶1混合發(fā)酵是對產(chǎn)酸最有利的發(fā)酵方式。答案：(1)無氧抗生素會抑制乳酸菌的活性，導致發(fā)酵失敗(2)透明圈與菌落直徑比例大的(3)發(fā)酵一段時間后，發(fā)酵液pH下降，乳酸菌活性受到抑制(4)采用雙菌種，先分別固定再1∶1混合發(fā)酵19．(12分)人誤食被金黃色葡萄球菌污染的食物后，可能出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等癥狀。研究者嘗試用蜻蜓腸道共生菌的代謝產(chǎn)物開發(fā)新型抑菌藥物，部分實驗步驟如圖所示，圖中數(shù)字編號代表實驗步驟。(1)培養(yǎng)蜻蜓腸道共生菌的培養(yǎng)基配方如表所示。據(jù)表中信息和所學知識判斷，馬鈴薯為共生菌生長提供的營養(yǎng)成分包括________。馬鈴薯葡萄糖瓊脂水200.0g20.0g20.0g1000mLA.碳源 B．氮源C．無機鹽 D．生長因子(2)為避免雜菌污染，圖中實驗操作應采用的正確方法是________。A.步驟①用自來水浸泡蜻蜓B．步驟②在超凈工作臺上操作C．步驟③加入蒸餾水研磨蜻蜓腸道D．實驗器材需要高壓滅菌(3)研究者分離出蜻蜓腸道菌株A，提取其代謝產(chǎn)物并用丙酮定容制成“藥液”。欲比較“藥液”與慶大霉素(用無菌水配制的抗生素溶液)對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，請把下列實驗主要步驟填寫完整(所有實驗均在無菌環(huán)境操作)。實驗主要步驟：①將_______________________________________________________________均勻涂布在圖中所示的平板培養(yǎng)基上；②用無菌鑷子將分別浸過A、B、C液和無菌水的圓紙片瀝干后均勻置于上述培養(yǎng)基表面。A、B、C液分別為____________________________________________________________；③在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一段時間后，檢測“因變量”的方法是________________________________________________________________________；④為使實驗結果更準確的做法是_________________________________________。解析：(1)馬鈴薯中含有糖類、蛋白質、少量脂肪和礦物質等，如題表所示的培養(yǎng)基中，馬鈴薯可為共生菌生長提供碳源、氮源、無機鹽、生長因子。(2)自來水中有雜菌，步驟①應該用無菌水浸泡蜻蜓，A錯誤；超凈工作臺是一種提供局部無塵無菌工作環(huán)境的空氣凈化設備，為防止雜菌污染，步驟②在超凈工作臺上操作，B正確；步驟③加入無菌水研磨蜻蜓腸道，C錯誤；為防止雜菌污染，實驗器材需要高壓滅菌，D正確。(3)欲比較“藥液”與慶大霉素(用無菌水配制的抗生素溶液)對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，則實驗的自變量為抑菌液的種類，因變量為抑菌效果，具體的實驗步驟為①將稀釋的金黃色葡萄球菌“菌液”均勻涂布在題圖中所示的平板培養(yǎng)基上；②用無菌鑷子將分別浸過丙酮溶液、相同濃度的“藥液”和慶大霉素以及無菌水的圓紙片瀝干后均勻置于上述培養(yǎng)基表面；③因變量為抑菌效果，金黃色葡萄球菌若受到抑菌液的抑制，則圓紙片周圍會出現(xiàn)清晰區(qū)，因此可用直尺測量每個圓紙片周圍清晰區(qū)的寬度，并記錄，從而檢測因變量；④為使實驗結果更準確，應遵循實驗的平行重復原則，重復上述實驗步驟多次，并對各組測量的數(shù)據(jù)求平均值。答案：(1)ABCD(2)BD(3)①稀釋的金黃色葡萄球菌“菌液”②丙酮溶液、相同濃度的“藥液”和慶大霉素③用直尺測量每個圓紙片周圍清晰區(qū)的寬度，并記錄④重復上述實驗步驟多次，并對各組測量的數(shù)據(jù)求平均值20．(13分)已知某病毒的S抗原基因編碼的S蛋白是感染人體細胞的主要抗原，研究人員利用S蛋白制備單克隆抗體，其制備流程如下圖：(1)該病毒中含有RNA、蛋白質、脂質等多種物質，進行①過程時，利用的是這些物質在____________________________方面存在的差異性進行RNA的提取。②過程所需酶是________________。檢測④過程是否獲得成功的方法是________________。(2)⑤⑥利用基因工程技術制備了可以無限增殖的細胞，⑥常采用________________法。細胞Y的特點是________________________________________________________________________。為確保細胞Y在無菌的環(huán)境中培養(yǎng)，除了對培養(yǎng)液和培養(yǎng)用具進行滅菌處理外，還需在培養(yǎng)液中加入一定量的________________。在體外進行懸浮培養(yǎng)時需要用____________法來收集Y細胞，再進行分瓶培養(yǎng)。(3)我國某科研團隊成功開發(fā)了一種以人復制缺陷腺病毒為載體的重組病毒基因疫苗。制備該基因疫苗過程中常利用________技術擴增S抗原基因，為了便于S抗原基因與腺病毒載體連接，需要在引物的5′端加上________________位點。解析：(1)RNA、蛋白質、脂質等多種物質在物理性質和化學性質上存在差異，可以利用這種差異提取RNA。②過程為在RNA的指導下合成DNA的過程，因此，該過程為逆轉錄，該過程需要在逆轉錄酶的催化下完成。④過程為獲得病毒S蛋白的過程，要檢測是否成功獲得S蛋白，需要用抗原—抗體雜交的方法。(2)⑥過程為將帶有無限增殖調控基因的質粒導入細胞X的過程，常用的方法為顯微注射技術，細胞X為漿細胞，經(jīng)過⑥過程的X細胞若成功導入了無限增殖調控基因，則細胞X將無限增殖。結合圖中信息可知，細胞Y應該能夠無限增殖并且能夠合成并分泌與S蛋白發(fā)生特異性結合的抗體?？股啬芤种萍毦纳L，所以為確保細胞Y在無菌的環(huán)境中培養(yǎng)，除了對培養(yǎng)液和培養(yǎng)用具進行滅菌處理外，還需在培養(yǎng)液中加入一定量的抗生素。在體外進行懸浮培養(yǎng)時需要用離心法來收集Y細胞，再進行分瓶培養(yǎng)。(3)已知病毒的S抗原基因編碼的S蛋白在感染人體細胞的過程中起到關鍵作用。制備腺病毒載體病毒疫苗時，首先需要在逆轉錄酶的作用下，以病毒的遺傳物質RNA為模板經(jīng)過逆轉錄得到S抗原基因。利用PCR技術擴增S抗原基因，為了便于S抗原基因與腺病毒載體連接，需要在引物的5′端加上限制酶切割位點。答案：(1)物理性質和化學性質逆轉錄酶抗原－抗體雜交技術(2)顯微注射既能快速大量繁殖又能產(chǎn)生特異性抗體抗生素離心(3)PCR限制酶切割21．(14分)棉鈴蟲和蚜蟲是常見的植物害蟲，Cry1A基因的表達產(chǎn)物對棉鈴蟲等鱗翅目昆蟲有較強的毒性，GNA基因的表達產(chǎn)物對蚜蟲等刺吸式口器的昆蟲有較強的毒性?？蒲腥藛T將Cry1A基因與GNA基因連接在一起，構建了雙抗蟲基因的重組表達載體，并轉入煙草細胞，獲得了具有雙抗性的轉基因煙草，其部分過程如圖1所示，請分析并回答以下問題：注：Klenow能將黏性末端轉變?yōu)槠侥┒耍粓D中不同限制酶切出的黏性末端均不同。(1)過程③將Cry1A基因與GNA基因相連，可選用______________(填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)。(2)過程④應該選用______________(填圖中限制酶)切割植物表達載體，以便和目的基因相連，形成重組表達載體。(3)將重組表達載體轉入農桿菌之前，一般先用________處理農桿菌，使其成為____________細胞。(4)讓農桿菌侵染煙草葉片前，需要通過實驗篩選農桿菌：將培養(yǎng)農桿菌的培養(yǎng)基倒平板后均分為A、B兩組，在A組培養(yǎng)基中涂布一定量的鏈霉素，在B組培養(yǎng)基中涂布等量的卡那霉素和鏈霉素。往A組培養(yǎng)基中接種適量農桿菌，待長出菌落后，用影印法接種到B組培養(yǎng)基上，實驗結果如圖2，其中________(填圖中對應的數(shù)字)菌落對應的農桿菌可能是符合要求的，即含有____________________的農桿菌。(5)通過植物組織培養(yǎng)技術培養(yǎng)農桿菌侵染的煙草葉片，獲得煙草幼苗，此技術依據(jù)的原理是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。欲從個體水平檢測這些植株是否成功導入目的基因，方法是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)過程①和②分別用不同的限制酶切割Cry1A基因與GNA基因，形成的黏性末端是不同的，故兩個基因無法直接相連，經(jīng)Klenow處理后，兩個基因片段一端的黏性末端變?yōu)槠侥┒?。E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端，T4DNA連接酶可以連接黏性末端，也可以連接平末端，故過程③將Cry1A基因與GNA基因相連，應選用T4DNA連接酶。(2)通過過程③得到的雙抗蟲基因(Cry1A基因＋GNA基因)兩側分別是EcoRⅠ和HindⅢ切出的黏性末端，故過程④應該選用EcoRⅠ和HindⅢ切割植物表達載體，形成和目的基因相同的黏性末端，以便讓植物表達載體與目的基因相連，形成重組表達載體。(3)將重組表達載體轉入農桿菌之前，一般先用Ca2＋處理農桿菌，使其成為感受態(tài)細胞，以利于重組表達載體進入農桿菌。(4)讓農桿菌侵染煙草葉片前，需要通過實驗篩選農桿菌，獲得含有重組表達載體的農桿菌。由于HindⅢ的切割位點在抗卡那霉素基因內部，故含有重組表達載體的農桿菌可以在含有鏈霉素的培養(yǎng)基上生長，不能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長。據(jù)此分析可知，A組中1、3對應的菌株為含有重組表達載體的農桿菌，2、4、5對應的菌株為含有植物表達載體的農桿菌。(5)植物組織培養(yǎng)技術依據(jù)的原理是植物細胞具有全能性。從個體水平檢測目的基因是否成功導入受體細胞，可將適量的棉鈴蟲和蚜蟲接種到轉基因植株上，觀察其是否具有抗蟲特性。答案：(1)T4DNA連接酶(2)EcoRⅠ和HindⅢ(3)Ca2＋感受態(tài)(4)1、3重組表達載體(5)植物細胞的全能性將適量的棉鈴蟲和蚜蟲接種