金銀花粗粉中綠原酸的提取

金銀花粗粉中綠原酸的提取

c-romy是蜂蜜的重要生理活性物質(zhì)。具有清熱解毒、抗菌、抗癌、升白細(xì)胞、保肝、胰干、抗癌、降血壓、血脂、自由基等功效。此外，它還可以用作天然食品的添加劑。目前以金銀花為原料加工制成的市售產(chǎn)品除復(fù)方制劑外,多為浸膏或粗粉,這些產(chǎn)品均屬于粗提物,其中綠原酸含量較低(20%～30%),因而產(chǎn)品的應(yīng)用范圍窄,附加值不高。另一方面,市場(chǎng)上需要高純度的綠原酸制品,但目前制備工藝還不是十分成熟,有待進(jìn)一步開發(fā)和提高。胡潤(rùn)淮等采用柱層析分離得到純度75.9%的綠原酸產(chǎn)品,但該方法存在柱清洗麻煩和柱污染的缺點(diǎn),工業(yè)化生產(chǎn)較為困難;馬希漢等采用鉛沉法得到純度大于90%的綠原酸產(chǎn)品,此法存在著重金屬鉛的污染問(wèn)題。溶劑萃取法對(duì)綠原酸具有很好的提純效果,且該法容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化,是最值得期待的方法之一。本文以金銀花粗提粉為原料,乙酸乙酯為萃取劑,研究金銀花粗提物的逆流萃取工藝,通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討萃取相比n、萃取級(jí)數(shù)N、萃取的pH對(duì)萃取效果的影響,確定多級(jí)逆流萃取操作的最佳工藝參數(shù),為實(shí)現(xiàn)綠原酸生產(chǎn)的連續(xù)化和規(guī)模化提供依據(jù)。1創(chuàng)造植物勞工有限公司,金銀花粗提粉(綠原酸含量15%左右,UV測(cè)定),購(gòu)于安徽宣城百草植物工貿(mào)有限公司;綠原酸對(duì)照品(綠原酸含量95%,HPLC)購(gòu)于美國(guó)sigma公司;乙酸乙酯(分析純)。2方法美國(guó)Agilent公司8453型紫外可見分光光度計(jì)。2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定采用紫外分光光度法。精密稱取綠原酸對(duì)照品20mg,置200ml棕色容量瓶中,加50%甲醇定容,10℃以下保存,吸取綠原酸對(duì)照品溶液0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0ml于10ml棕色容量瓶中,加50%甲醇至刻度線,搖勻。以50%甲醇為空白,紫外327nm下測(cè)定吸光度。以綠原酸標(biāo)品的濃度為橫坐標(biāo),其相應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo),繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。得到回歸方程:Y=0.03696+0.05366X,r=0.9995?？梢?在5～60μg/ml的范圍內(nèi),綠原酸濃度與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。2.2實(shí)驗(yàn)操作條件模擬逆流萃取操作流程如圖2所示。因?yàn)橐宜嵋阴ヅc水部分互溶,所以事先配好乙酸乙酯和水的兩相平衡溶液,其中水相作為溶劑溶解原料,乙酸乙酯相作為萃取劑。萃取操作條件為:相比n=1∶1～2∶1,萃取時(shí)間5min左右,萃取酸度1.0～3.0,萃取溫度為室溫。圖2中每一個(gè)圓圈代表1次萃取操作。實(shí)驗(yàn)具體操作如下:2.2.1取6個(gè)分液漏斗,分別編號(hào)1,2,3,4,5,6。向1號(hào)分液漏斗中,加入萃取液(原料液)和萃取劑(醋酸乙酯),搖勻,萃取5min后分相。萃取相為一級(jí)逆流萃取產(chǎn)品P1,萃余相移到2號(hào)分液漏斗中。2.2.2向2號(hào)分液漏斗中加入新的萃取劑,萃取5min后分相。萃取相移到4號(hào)分液漏斗中,萃余相移到3號(hào)分液漏斗中。2.2.3在3號(hào)和4號(hào)分液漏斗中分別加入新的萃取劑和萃取液進(jìn)行萃取。3號(hào)分液漏斗分相后的萃取相移到5號(hào)分液漏斗中,萃余相為三級(jí)逆流萃取的萃余相E3。4號(hào)分液漏斗分相后的萃取相為二逆流萃取產(chǎn)品P2,萃余相移到5號(hào)分液漏斗中。2.2.45號(hào)分液漏斗萃取分相后的萃取相移到6號(hào)分液漏斗中,萃余相為二級(jí)逆流萃取的萃余相E2。在6號(hào)分液漏斗中加入新的萃取劑進(jìn)行萃取,分相后萃取相為三級(jí)逆流萃取產(chǎn)品P3,萃余相為一級(jí)逆流萃取的萃余相E1。2.3最佳萃取條件的確定由于萃取的總綠原酸是綠原酸和異綠原酸的混合物,兩者在乙酸乙酯相中的溶解度存在差異,再加上實(shí)際的萃取體系中不僅含有綠原酸和異綠原酸,同時(shí)還存在其他雜質(zhì)的干擾,因此分配系數(shù)需要實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定。因?yàn)椴煌妮腿l件都會(huì)影響分配系數(shù),所以我們選擇最佳萃取條件進(jìn)行測(cè)定。分配系數(shù)m可以用下式來(lái)表示:m=組分要萃取相中的濃度組分在萃余相中的濃度m=組分要萃取相中的濃度組分在萃余相中的濃度因此只要測(cè)定萃取相和萃余相中總綠原酸的濃度就可以得到分配系數(shù)m.20℃時(shí),綠原酸在水中的溶解度為0.59g/100ml,在乙酸乙酯中的溶解度為0.06g/100ml。每次量取30ml原料液按圖2所示的操作流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。萃取操作條件:pH=2.0左右,相比=1.5∶1,萃取時(shí)間為5min左右。測(cè)定每一級(jí)的分配系數(shù),3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。以表1中數(shù)據(jù),作出分配系數(shù)m與級(jí)數(shù)N的關(guān)系見圖3。得出回歸方程:y=1α+bχy=1α+bχ,其中a=-0.82889,b=1.86921,r=0.998。2.4萃取級(jí)數(shù)的收率多級(jí)逆流萃取與微分萃取、錯(cuò)流萃取比較,具有溶劑耗用量少,設(shè)備投資低,易于工業(yè)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。其流程見圖4。圖4中χf為萃取液中CGA的濃度,y0為新鮮醋酸乙酯中CGA的濃度,L為萃取液體積,V為萃取溶劑(醋酸乙酯)體積,y、χ分別為萃取相和萃余相中CGA的濃度。萃取液從左邊第一級(jí)與萃取劑充分接觸傳質(zhì)向右流動(dòng),至第N級(jí)流出為萃余相。乙酸乙酯從右邊第N級(jí)流入,與萃取液逆向流動(dòng),到第一級(jí)流出成為萃取相。若假設(shè)每一級(jí)均達(dá)到萃取平衡,逐級(jí)進(jìn)行物料恒算到第N級(jí)(最后一級(jí)),則有:y1=y0+1n[χf?χf+ny0(1+ε1+ε1ε2+?+ε1ε2?εN?1)1+ε1+ε1ε2+?+ε1ε2?εN]=χfA+ny0Bn(1+A)(1)y1=y0+1n[χf-χf+ny0(1+ε1+ε1ε2+?+ε1ε2?εΝ-1)1+ε1+ε1ε2+?+ε1ε2?εΝ]=χfA+ny0Bn(1+A)(1)式中n=VL??n=VL--相比;εi=min--萃取因子;mi=yiχi??mi=yiχi--分配系數(shù);N--逆流萃取級(jí)數(shù);A=1+ε1+ε1ε2+…+ε1ε2…εN;B=ε1ε2…εN多級(jí)逆流收率ρ為:ρ=Vy1Lχf=χfA+ny0Bχf(1+A)(2)ρ=Vy1Lχf=χfA+ny0Bχf(1+A)(2)若所用新鮮醋酸乙酯相中不含CGA,取y0=0,則(1)、(2)式變?yōu)?y1=χfAn(1+A)(3)ρ=A1+A=1?11+A(4)y1=χfAn(1+A)(3)ρ=A1+A=1-11+A(4)根據(jù)2.3中分配系數(shù)m與萃取級(jí)數(shù)N的關(guān)系式,取相比n=1.5,按照(3)式計(jì)算最終萃取相的濃度y1以及(4)式計(jì)算收率ρ。結(jié)果見表2。級(jí)數(shù)為4時(shí),其A=2.455;級(jí)數(shù)為5時(shí),其A=2.463。級(jí)數(shù)從4級(jí)增加到5級(jí),其A值卻增加0.008。由于萃取因子隨著級(jí)數(shù)的增大而減小,因此以后每增加一級(jí)的A值變化會(huì)更小?？梢姰?dāng)級(jí)數(shù)大于5之后,A值的變化幾乎可以忽略。若取A=2.5,其收率ρ為71.43%。因此可以推斷當(dāng)級(jí)數(shù)大于5之后,在一定范圍變化時(shí),其收率ρ不會(huì)超過(guò)71.43%。3結(jié)果3.1實(shí)驗(yàn)因素和參數(shù)按照?qǐng)D3所示的模擬逆流萃取流程,選擇萃取相比n、萃取級(jí)數(shù)N和萃取pH值作為實(shí)驗(yàn)因素。實(shí)驗(yàn)指標(biāo)選擇CGA的收率和萃取產(chǎn)品總綠原酸的純度。選用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表,實(shí)驗(yàn)因素水平和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。3.2結(jié)果分析3.2.1總綠原酸的純度相比n對(duì)萃取結(jié)果的影響見圖5?？煽闯?隨著相比n由1∶1上升到2∶1,總綠原酸的收率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),從58.3%增加到70.7%。這與一般的萃取規(guī)律是一致的。而總綠原酸的純度在相比為1.5∶1時(shí)最大,相比大于1.5∶1時(shí),總綠原酸的純度反而下降。這可能是由于相比較高時(shí)會(huì)有更多的雜質(zhì)被萃取到有機(jī)相中,導(dǎo)致最終產(chǎn)品總綠原酸純度降低。另外,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)相比為1∶1時(shí),容易會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,分層困難。綜合考慮總綠原酸收率和純度,選擇1.5∶1為最宜萃取相比。3.2.2不同級(jí)數(shù)n對(duì)總綠原酸純度的影響逆流萃取級(jí)數(shù)N對(duì)萃取效果的影響見圖6。逆流萃取三級(jí)以后,總綠原酸的收率從56.99%增加到73.2%,增幅較大,表明萃取級(jí)數(shù)對(duì)總綠原酸收率的影響顯著。但隨著級(jí)數(shù)N的增加,總綠原酸的純度呈下降趨勢(shì)。從單級(jí)萃取到三級(jí)萃取,總綠原酸純度從78.3%下降到75.3%,變化幅度不超過(guò)3%,表明萃取級(jí)數(shù)對(duì)總綠原酸純度的影響不明顯。這可能是由于隨著萃取級(jí)數(shù)增加,使得萃取液中的雜質(zhì)被萃入有機(jī)相的幾率上升,造成產(chǎn)品中總綠原酸的純度有所下降。另外,萃取級(jí)數(shù)增加也造成萃取操作時(shí)間的延長(zhǎng),由于綠原酸易被空氣氧化,因此也會(huì)引起產(chǎn)品純度的下降。兼顧到產(chǎn)品中綠原酸類的收率和純度,宜采用三級(jí)逆流萃取。3.2.3最佳ph值的確定,保證溶液的最佳pH對(duì)萃取效果的影響見圖7?？梢钥闯?pH值在1.0～3.0范圍內(nèi)總綠原酸的收率變化不很明顯。pH為2.0時(shí),產(chǎn)品總綠原酸的純度最高,達(dá)到84.4%。綠原酸是弱酸,在酸性條件下不電離,有利于在有機(jī)相中的溶解而提高萃取效果。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,溶液的最佳pH值可根據(jù)組分的pKa值來(lái)確定,酸性組分提取的pH值一般應(yīng)比其pKa值低1～2個(gè)pH單位。綠原酸的物理常數(shù):pK1(羧酸)=3.59;pK2(第一酚)=8.59,因此酸性條件下有利于綠原酸的萃取。兼顧產(chǎn)品總綠原酸的純度和收率,確定pH=2.0為最佳的萃取酸度。3.2.4最佳操作條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定相比為1.5:1,萃取級(jí)數(shù)為三級(jí),pH為2.0為逆流萃取最佳操作參數(shù)。按照?qǐng)D2所示的操作流程,根據(jù)最佳操作條件,進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到產(chǎn)品的總綠原酸純度為83.46%,總綠原酸收率為70.31%。同時(shí)測(cè)定的y1和收率ρ。結(jié)果見表4。比較表2和表4數(shù)據(jù),可以看出理論計(jì)算的結(jié)果和實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果能夠較好地吻合。4逆流萃取參數(shù)的確定4.1以金銀花粗提粉