豬瘟病毒實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

豬瘟病毒實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

豬疫情是一種急性、熱和高度接觸性傳染病，在全世界廣泛分布。這是獸醫(yī)行業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的重要疫情之一。豬瘟病毒是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的成員。該病毒屬其他重要?jiǎng)游锊≡€包括能夠造成犢牛腹瀉的牛病毒性腹瀉病毒(bovineviraldiarrheavirus,BVDV)和感染羊的邊界病病毒(borderdiseasevirus,BDV),這2種病毒都可以自然感染豬。豬豬瘟瘟病病毒毒全全基因組長(zhǎng)約12kb,編碼一個(gè)大的開(kāi)開(kāi)放放閱閱讀讀框框((ooppeennreadingframe,ORF),基因組2端端具具有有非非編編碼碼區(qū)區(qū)。ORF編碼的多聚蛋白在病毒和細(xì)細(xì)胞胞酶酶的的作作用用下下被分解成為4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C,EErrnnss,,EE11和和EE22))和和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro,p7,NS2,NNSS33,,NNSS44AA,,NNSS44B,NS5A和NS5B)。系統(tǒng)進(jìn)化分分析析表表明明CCSSFFVV可可以分成2個(gè)基因群:基因群I包含含的的主主要要是是弱弱毒毒毒毒株,而基因群II包含的主要是強(qiáng)毒力毒株。非編碼區(qū)基因相對(duì)保守,通常被用來(lái)作為檢測(cè)對(duì)象。豬瘟病毒的診斷方法及疫苗研究是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。多種診斷方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床,如病毒分離、血清學(xué)診斷試驗(yàn)、RT-PCR方法、基因芯片等。但這些方法存在操作復(fù)雜、靈敏度低或成本過(guò)高等問(wèn)題,不適合用于大規(guī)模檢測(cè),尤其是對(duì)病毒進(jìn)行高靈敏度的定量分析。SYBRreal-timePCR方法對(duì)分析病毒組織定位及檢測(cè)病毒含量較低的樣品具有顯著優(yōu)勢(shì),本研究為分析急性感染期豬瘟病毒的組織定位,分析豬瘟病毒感染導(dǎo)致豬急性死亡的致病機(jī)理研究,建立了能夠檢測(cè)豬瘟強(qiáng)毒的SYBRreal-timePCR方法,并以此分析了豬瘟強(qiáng)毒在人工感染豬體內(nèi)的分布。1材料和方法1.1sybrpeq和rna提取試劑盒豬瘟石門(mén)系強(qiáng)毒毒株由本實(shí)驗(yàn)室保存。SYBRPremixExTaq購(gòu)自TAKARA公司,RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司。1.2接種豬景觀(guān)血毒后注射3.從農(nóng)戶(hù)飼養(yǎng)的豬中選擇豬瘟抗原抗體陰性斷奶仔豬,攻毒組和對(duì)照組各5只。以點(diǎn)眼、滴鼻和注射的方法接種豬瘟血毒10mL。對(duì)照組以相同方法注射等量的生理鹽水,攻毒組與對(duì)照組嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)。選擇急性發(fā)病豬(接種后5~7d死亡),采集心、肝、脾、肺、腎、腹股溝淋巴結(jié)、腦、骨髓、扁桃體、回腸、血清和腸內(nèi)容物,-20°C保存以備使用。1.3軟件設(shè)計(jì)及引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank發(fā)表的豬瘟石門(mén)強(qiáng)毒的基因序列,選擇5′UTR相對(duì)保守區(qū)域,利用Primer5軟件設(shè)計(jì)出1對(duì)引物,P1:5′-GCTCCCTGGGTGGTCTAAGT-3′;P2:5′-CCCT-CGTCCACATAGCATCT-3′,長(zhǎng)91bp。擴(kuò)增條件為:55℃退火30s,72℃延伸40s。套式PCR引物序列參考文獻(xiàn),普通PCR為外出引物擴(kuò)增結(jié)果,引物由華大基因合成。1.4陽(yáng)性克隆的制備將豬瘟病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與pMD-18T連接,轉(zhuǎn)化DH5α,挑取陽(yáng)性克隆,經(jīng)酶切鑒定后,送于華大基因測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒經(jīng)質(zhì)粒提取試劑盒提取后,測(cè)定濃度作為制作real-timePCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)品,質(zhì)粒命名為pMD-CSFV-5′UTR。1.5實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)反應(yīng)體系20μL:2×SYBRPremixExTaq10μL,上、下游引物(20μmol/L)各0.5μL,模板DNA1μL,ddH2O補(bǔ)足20μL。使用BIO-RADQ5型熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序采用2步法:94℃預(yù)變性30s,94℃變性15s,60℃退火40s,共反應(yīng)40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)的退火階段收集熒光信號(hào)。1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制連續(xù)10倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,選擇10-9~10-4倍稀釋點(diǎn)進(jìn)行熒光定量PCR,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。用該熒光定量PCR方法對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的3個(gè)稀釋度(10-7、10-6、10-5)進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè),每個(gè)稀釋度組內(nèi)設(shè)3個(gè)樣本,組間重復(fù)3次,統(tǒng)計(jì)組內(nèi)和組間的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。1.7特異性試驗(yàn)1.8熒光定量pcr檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)采集的各組病料,包括心、肝、脾、肺、腎、腹股溝淋巴結(jié)、腦、骨髓、扁桃體、回腸、血清和腸內(nèi)容物提取RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR的檢測(cè)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù),每次熒光定量PCR都設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2結(jié)果2.1引用特異性用引物P1、P2對(duì)病毒cDNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物大小約為91bp,與預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小一致,擴(kuò)增條帶單一、無(wú)非特異擴(kuò)增(圖1)。2.2相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定DNA標(biāo)準(zhǔn)品D260值,按照公式:病毒量(拷貝/mL)=50(g/mL)×D260×6.02×1023(拷貝/mol)/1000×相對(duì)分子質(zhì)量(g/mol)。計(jì)算出pMD-CSFV-5′UTR的拷貝數(shù)是8.7×109拷貝/mL。2.3檢測(cè)下限和效率標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在8.7~8.7×105拷貝范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為R2=0.996,擴(kuò)增效率為107.2%,檢測(cè)下限為8.7拷貝(圖2)。擴(kuò)增曲線(xiàn)呈的S型,溶解峰值單一,Tm=82.3±0.10℃。計(jì)算公式為:y=-3.16x+9.89。2.4特異性試驗(yàn)驗(yàn)Real-timePCR只對(duì)豬瘟病毒有擴(kuò)增曲線(xiàn),其它均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物(圖3)。2.5間標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)測(cè)定組內(nèi)重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)、組間標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)。變異系數(shù)均小于5%(表1),表明標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)具有較高的重復(fù)性,可以檢測(cè)樣品使用。2.6熒光定量pcr與質(zhì)粒模板pcr的對(duì)比比較普通PCR和套式PCR與real-timePCR對(duì)質(zhì)粒模板的擴(kuò)增效率,發(fā)現(xiàn)套式PCR和熒光定量PCR具有相似的靈敏度,比普通PCR的擴(kuò)增效率高出1000倍作用(表2),適合用于研究病毒含量較低的試驗(yàn)材料。2.7csfv在不同病理生理指標(biāo)中的含量對(duì)各種組織和體液樣品檢測(cè)結(jié)果顯示,Real-timePCR擴(kuò)增曲線(xiàn)良好,溶解曲線(xiàn)峰值單一,無(wú)其他雜峰(圖3)。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式,計(jì)算出病料中病毒含量,結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可以看出,扁桃體中CSFV含量最高,脾臟和回腸次之,接著是淋巴結(jié),肝臟、腎、骨髓和腦中CSFV基因的含量較低,心、肺、血清中CSFV基因含量也比較高。對(duì)照組豬未檢出病毒RNA。3豬髓病毒在組織中的分布豬瘟是導(dǎo)致我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)損失的重要疾病之一。目前已經(jīng)有許多研究團(tuán)隊(duì)對(duì)該病毒做出了深入的研究,但時(shí)至今日,仍然未能夠完全揭示豬瘟病毒的致病機(jī)理、變異機(jī)制、地理分布、組織嗜性和排毒情況。為深入研究病毒侵入機(jī)體后的組織定位及與豬急性死亡的關(guān)系,本研究建立了SYBR熒光定量方法,并以此分析了急性感染死亡豬體內(nèi)器官:心、肝、脾、肺、腎、腹股溝淋巴結(jié)、腦、骨髓、扁桃體、回腸、血清和腸內(nèi)容物中的病毒含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒主要集中在扁桃體、脾臟、淋巴結(jié)、回腸內(nèi)。另外研究發(fā)現(xiàn)病毒在血清、腸內(nèi)物中含量也較高,這可能與病毒的排毒有關(guān)。說(shuō)明急性感染期的豬已經(jīng)可以通過(guò)腸道排出物向外排毒。本次研究測(cè)定的組織病毒含量與Ophuis等報(bào)道的結(jié)果相似,但與Liu等報(bào)道的差別較大,這可能與使用的病毒毒株有關(guān)。分析急性感染期豬瘟病毒在組織的分布情況,可以了解病毒在豬體內(nèi)傳播的過(guò)程。從結(jié)果看出扁桃體含病毒量最高,符合病毒從口鼻途徑感染,病毒復(fù)制起始于扁桃體的事實(shí);其次病毒在淋巴結(jié)和脾臟中的含量也較高,證明病毒可以侵襲這些組織,并可以在這些組織中復(fù)制,產(chǎn)生子代病毒粒子,這些組織器官可能是病毒侵入機(jī)體后的優(yōu)先“著陸”位點(diǎn);另外血液中病毒含量也較高,說(shuō)明病毒可以通過(guò)血液向全身傳播。檢測(cè)結(jié)果還顯示:在動(dòng)物的心臟、腦、骨髓、腎和肝臟中都有病毒的存在。這些結(jié)果說(shuō)明急性感染期,豬瘟病毒已經(jīng)廣泛在豬體內(nèi)多種組織器官中分布,這可能是導(dǎo)致豬急性死亡的原因,另外還證明淋巴組織在豬瘟病毒建立感染和病毒增殖中扮演重要較色。用熒光定量PCR方法分析感染豬體內(nèi)病毒分布的研究已經(jīng)有報(bào)道,趙建軍等用Taqman探針?lè)ǚ治隽巳斯じ腥矩i1~14d血液中豬瘟病毒的動(dòng)力學(xué)變化;Jun等用熒光定量PCR方法分析了CSFVSM毒株感染豬后病毒在豬體內(nèi)的分布;國(guó)外學(xué)者也報(bào)道了用熒光定量PCR方法分析豬瘟病毒組織分布的研究進(jìn)展,但是多數(shù)情況下,試驗(yàn)用豬沒(méi)有在急性感染期內(nèi)發(fā)病死亡,因此