結核桿菌耐熱多肽抗原的純化及鑒定

結核桿菌耐熱多肽抗原的純化及鑒定

現(xiàn)在，卡介苗的接種已成為一個計劃免疫的項目，但淋巴結也是世界上發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。弄清機體抗結核桿菌(Mtb)感染的免疫機制和從Mtb分離有效的免疫保護因子,仍是當前亟待解決的前沿課題。最近發(fā)現(xiàn),γδ+T細胞在抗Mtb感染中具有重要的作用,Mtb急性感染人體后,可導致外周血γδ+T細胞的數(shù)量明顯增多,而慢性活動性結核病患者的遷延不愈則與其數(shù)量顯著降低密切相關。另外,γδ+T細胞缺陷型小鼠感染Mtb后,生存時間明顯縮短。因此,增強機體γδ+T細胞的數(shù)量及其活性,可能有利于結核病的治療。Boom等報道,結核桿菌H37Ra株經熱處理后,菌體釋放的胞漿多肽抗原(Mtb-Ag)可強效激活γδ+T細胞,并且發(fā)揮此效應的是其中相對分子質量(Mr)介于10000～14000的多肽組分(Mtb-LW-Ag),但具體是哪個多肽發(fā)揮效應尚不清楚。本室最近曾系列研究了此Mtb-Ag,發(fā)現(xiàn)其不僅可使人γδ+T細胞顯著擴增,而且激活的γδ+T細胞較LAK細胞和CD3AK細胞具有更強的殺腫瘤活性及更寬的抗瘤譜。若從Mtb-Ag中分離純化出這種能激活γδ+T細胞的活性多肽并克隆其基因,其在疫苗研制和抗腫瘤生物治療中必然具有重要價值。因此,我們建立了簡便、高效的快速蛋白液相色譜(FPLC)二步法,純化了Mtb-Ag中的MtbLW-Ag成分,并對其提取條件進行了優(yōu)化處理。另外,還對Mtb-LW-Ag及其純化的多肽刺激γδ+T細胞的效應進行了分析,以確定發(fā)揮此激活效應的多肽。為進一步進行活性多肽的氨基酸測序奠定基礎。1材料和方法1.1儀器和儀器生物制品檢定所北京菌種保藏中心。快速蛋白液相色譜儀為美國AKTA公司產品。分子篩型HiPrep16/60SephacrylS-100柱(No:17-1165-01)和離子交換型MonoQHR5/5柱(No:17-0546-01),均購于瑞典Pharmacia公司。超濾杯為美國Amicon公司產品。TU-1800型全自動紫外可見分光光度計,為北京普析通用儀器有限公司產品?？笴D69-FITC和抗CD3-FITC購于美國Ancell公司。抗γδTCR-PE購于美國BectonDickinson公司。流式細胞儀FACSCalibur為美國BectonDickinson公司產品。rhIL-2由山東省醫(yī)科院基礎所田志剛教授惠贈。1.2方法1.2.1離心菌體的制備參照文獻進行。將H37Ra菌株接種于蘇通液體培養(yǎng)基,于37℃培養(yǎng)1個月,以3000r/min離心30min。收集菌體,依次用生理鹽水洗滌3次和蒸餾水洗滌1次,按沉淀菌體的體積加入2倍蒸餾水混勻,于120℃高壓蒸汽滅菌處理30min。取上清液經0.22μm微孔濾膜過濾,置-70℃保存。1.2.2洗脫溶劑測定方法S-100柱經含有0.15mol/LNaCl的20mmol/LTris-HCl(pH8.0)緩沖液平衡,加Mtb-Ag0.5mL于柱中,流速為1mL/min。以紫外檢測器自動測定洗脫液的A280值,收集含Mr低的多肽的各洗脫峰。另外,以電泳純的牛血清白蛋白和溶菌酶混合液,按上述條件上樣洗脫,以確定標準蛋白洗脫峰的位置。1.2.3洗脫溶劑的制備將含有Mr低的多肽的各洗脫峰,經超濾杯超濾濃縮,截取Mr為10000以上的多肽。將濃縮的各洗脫峰每次上樣0.5mL,流速為1mL/min。先用20mmol/LTris-HCl(pH8.0)洗滌緩沖液洗滌MonoQ柱,然后用含有0.5mol/LNaCl的20mmol/LTris-HCl(pH8.0)洗脫緩沖液,按鹽濃度進行線性梯度洗脫,以紫外檢測器自動測定洗脫液的A280值,并收集洗脫的各個純化多肽。另外,將平衡緩沖液的鹽濃度分別調整為0mol/L和0.01mol/LNaCl,洗脫緩沖液的鹽濃度分別調整為0.5mol/L和0.8mol/LNaCl,Tris-HCl緩沖液的pH值分別為pH7.5和pH8.0兩種,分別組合后進行洗脫以確定最佳的分離效果。1.2.4mtb-agb/mrhil-2/ms的制備方法取肝素抗凝的健康志愿者外周血分離PBMC,用含50mL/LFCS和50mL/L人自體血漿的RPMI1640培養(yǎng)液調細胞濃度為1×109/L,按每孔1mL加入24孔培養(yǎng)板中。再分別加入Mtb-Ag5μg/孔,Mr低的多肽峰B、C、D均為0.1μg/孔,同時各孔加入rhIL-250U。每3～4d各孔補加rhIL-250U,根據(jù)細胞的生長情況分孔擴大培養(yǎng)。于培養(yǎng)24h和第15天收獲細胞并計數(shù)。同時,分別加入純化的B-Ⅲ多肽與C-主肽(均為0.1μg/孔),于培養(yǎng)的第15天收獲細胞并計數(shù)。1.2.5各組pbmc結果將培養(yǎng)的PBMC用含有50mL/LFCS和1g/LNaN3的冷PBS緩沖液按1500r/min離心5min,共洗滌2次。調整細胞密度為1×109/L,取各組PBMC100μL,分別加入抗CD69-FITC5μL、抗CD3-FITC7μL或抗γδ-PE5μL,置冰浴上避光30min。經冷PBS洗滌2次后,加入含10g/L多聚甲醛的PBS固定細胞,然后上流式細胞儀檢測,并使用WinMDI軟件分析γδ+T細胞的表型。1.2.6測定濃度為多孔濃度采用紫外分光光度計測定A280和A260的值,計算公式為:多肽濃度(g/L);1.54×A280-0.74×A260。2結果2.1mtb-ag的洗脫峰標準蛋白混合液經FPLCS-100柱層析后,分別在洗脫體積為74.82mL和102.37mL處,出現(xiàn)牛血清白蛋白和溶菌酶的洗脫峰(資料未顯示)。Mtb-Ag經S-100柱層析后,獲得1個洗脫峰為41.13mL的大分子蛋白峰A、3個含Mr低的多肽的峰,即洗脫峰為97.51mL的峰B、洗脫峰為101.92mL的峰C和1個洗脫峰為109.93mL的峰D。4個洗脫峰的蛋白含量,分別占Mtb-Ag總蛋白的40.55%、16.64%、25.12%和16.63%(圖1)。2.2洗脫峰c經柱層析后多肽共聚體的結構3個Mr低的多肽峰分別經Amicon超濾杯濃縮后,再經FPLCMonoQ柱層析純化。結果從洗脫峰B分離出6個多肽主峰(依次為B-Ⅰ～Ⅵ),其多肽含量依次占上樣多肽量的55.99%、5.89%、12.10%、5.21%、3.71%和7.25%。洗脫峰C經柱層析后,只出現(xiàn)1個明顯的主峰(C主肽),其含量占上樣多肽量的89.45%。洗脫峰D經柱層析后,獲得8個多肽主峰(依次為D-Ⅰ～Ⅷ),其多肽含量依次占上樣多肽量的14.82%、9.18%、8.48%、8.11%、3.27%、5.02%、7.46%和8.85%。同時,本研究還對MonoQ柱分離多肽的條件進行了優(yōu)化處理,發(fā)現(xiàn)以將20mmol/LTris-HCl(pH8.0)洗滌緩沖液和0.5mol/LNaCl-20mmol/LTris-HCl(pH8.0)洗脫緩沖液相組合時,對多肽的分離效果最佳(圖2)。2.3+t細胞激活PBMC經抗原刺激24h,rhIL-2刺激組CD69+γδ+T細胞占總γδ+T細胞的比率為16.08%。Mtb-Ag和多肽峰C組均可顯著誘導γδ+T細胞活化并表達CD69,其CD69+γδ+T細胞占總γδ+T細胞的比率分別為69.66%和45.61%。雖然多肽峰D組的CD69+γδ+T細胞占總γδ+T細胞的比率達到35.53%,但其占總PBMC的比率明顯低于Mtb-Ag和多肽峰C組;多肽峰B組無明顯誘導γδ+T細胞表達CD69的活性,其CD69+γδ+T細胞占總γδ+T細胞的比率僅為12.72%。另外,對αβ+T細胞表達CD69情況進行分析,并與rhIL-2組相比較,只有Mtb-Ag組的CD69+αβ+T細胞的陽性率明顯升高,充分表明促進γδ+T細胞活化的的確是一些M,低的多肽(圖3)。PBMC經抗原刺激培養(yǎng)15d時,對其表型分析表明,rhIL-2刺激組中γδ+T細胞占CD3+T細胞的3.35%,多肽峰B、C、C-主肽、B-Ⅲ肽及Mtb-Ag均可顯著誘導γδ+T細胞增殖,增殖率分別為10.05%、21.80%、11.27%、22.97%和72.83%;而多肽峰D誘導γδ+T細胞增殖的作用則不明顯,其γδ+T細胞的比率僅為5.45%。因此,B-Ⅲ多肽和C-主肽可能是Mtb-Ag發(fā)揮激活γδ+T細胞效應的多肽(圖4)。對Mr低的多肽峰及其純化多肽刺激組的γδ+T細胞增殖數(shù)量的分析表明Mtb-Ag刺激PBMC的前6d內,細胞增殖緩慢,隨后細胞增殖加快,于14d時達峰,然后緩慢下降。各r低的多肽峰及B-Ⅲ多肽與C-主肽刺激PBMC的前10d內,M細胞增殖均很緩慢,隨后細胞增殖旺盛,于14d達峰,其后增殖呈現(xiàn)下降趨勢。rhIL-2組中的細胞于培養(yǎng)2d后,增殖加快,但9d后細胞增殖緩慢。對細胞總數(shù)的分析表明,培養(yǎng)至15d時,Mtb-Ag組中的細胞可增殖36.7倍,Mr低的多肽峰B、C、D及B-Ⅲ多肽與C-主肽組中的細胞增殖倍數(shù)均低于Mtb-Ag組,分別為5.15倍、8.7倍、0.96倍、7.84倍和6.72倍,而rhIL-2組則僅為0.7倍。3mtb-ag和多肽峰c、b-+t細胞的誘導表達作用FPLC是利用高壓輸液條件進行蛋白質快速純化的新型柱層析系統(tǒng),具有分離速度快、分辨率高、可進行大規(guī)模制備級純化等優(yōu)點,因此在生物工程領域中應用最為廣泛。我們首次利用FPLC二步純化法純化Mtb-Ag,并對分離條件進行優(yōu)化,獲得了多個純化的多肽。Boom等采用FPLC分子篩層析柱,對Mtb-Ag初步純化后,再用制備性等電聚焦電泳(IFE)對其中的Mr低的多肽組分進一步純化,結果僅獲得7種多肽。由于等電聚焦電泳儀價格昂貴,同時凝膠電泳后兩性電解質混入多肽樣品中難以去除,以及凝膠中殘余的過硫酸胺可能氧化封閉多肽的N端氨基酸殘基,從而可造成對活性多肽測序的困難。本研究建立的純化方法與IFE相比較,可完全克服IFE的不足,且所獲多肽仍保持了Mtb-Ag的活性。經對分離的各種Mr低的多肽峰及其純化的B-Ⅲ多肽及C-主肽進行活性分析表明,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)24h時的多肽峰C激活γδ+T細胞的效應與Mtb-Ag組相似,而多肽峰B和D的作用則不明顯。培養(yǎng)15d時的多肽峰B、C均可顯著激活γδ+細胞增殖,但其效應低于Mtb-Ag組,而多肽峰D組則作用不明顯。對上述多肽峰經MonoQ柱純化后所獲的多肽進行活性測定表明,只有B-Ⅲ肽和C-主肽可顯著促進γδ+T細胞增殖。近年發(fā)現(xiàn),CD69是T細胞活化后早期表達的信號分子,具有促進IL-2及其受體的基因表達和細胞增殖的活性,與本研究中Mtb-Ag和多肽峰C可顯著促進γδ+T細胞增殖并高表達CD69的結果相一致。由于B-Ⅲ多肽的含量僅占多肽峰B的12.1%,這可能與峰B刺激γδ+T細胞表達的CD69較低有關。本研究室曾發(fā)現(xiàn),Mtb-Ag對PBMC內的CD4+αβ+T細胞也有一定的激活效應,并表明與Mtb-Ag中存在的大分子活性蛋白有關。何維等利用細胞隔離滲透性共培養(yǎng)體系,發(fā)現(xiàn)超聲提取的Mtb胞漿抗原不僅可激活靜止的CD4+αB+T細胞或γδ+T細胞,而且此激活的CD4+αβ+T細胞(或γδ+T細胞)通過分泌IL-2或IFN-γ再促進靜止γδ+T細胞(或CD4+αβ+T細胞)增殖。