生物分子達(dá)拉的研究進(jìn)展

生物分子達(dá)拉的研究進(jìn)展

1納米尺度和自動(dòng)性生物分子達(dá)是將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為力學(xué)能的生物分子。這些大分子廣泛存在于細(xì)胞內(nèi),它們是蛋白質(zhì),也可以是DNA,常處在納米尺度,因此也稱納米機(jī)器。生物分子馬達(dá)能主動(dòng)地從環(huán)境中俘獲“能量分子”ATP,借助熱漲落來消耗ATP水解所釋放出的化學(xué)能,進(jìn)而改變自己的構(gòu)象。一旦與軌道結(jié)合,馬達(dá)通過構(gòu)象變換產(chǎn)生與軌道間的相對運(yùn)動(dòng),因此,它們具備“自動(dòng)性”(motility)。生物分子馬達(dá)按材料屬性可分為兩大族,分別是蛋白馬達(dá)和DNA馬達(dá)。1.1轉(zhuǎn)動(dòng)馬達(dá)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白馬達(dá)按運(yùn)動(dòng)形式又可分為線動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)兩大類。線動(dòng)馬達(dá)常常與特定軌道結(jié)合在一起,利用ATP水解釋放出的化學(xué)能產(chǎn)生與軌道的相對運(yùn)動(dòng),其作用機(jī)制與人造發(fā)動(dòng)機(jī)類似。這類馬達(dá)主要有肌球蛋白(myosin)、驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin)和動(dòng)力蛋白(dynein)等;轉(zhuǎn)動(dòng)馬達(dá)則類似于人造電機(jī),也由“轉(zhuǎn)子”和“定子”兩部分組成。這類馬達(dá)包括鞭毛馬達(dá)(flagellar)和ATP合成酶(ATPsynthase)等。它們往往是可逆的。其中ATP合成酶既是“電動(dòng)機(jī)”又是“發(fā)電機(jī)”。某些蛋白馬達(dá)的性質(zhì)及其與人造機(jī)器的比較列于表1。線動(dòng)馬達(dá)又可分為持續(xù)(processive)和非持續(xù)(nonprocessive)馬達(dá)。所謂“持續(xù)馬達(dá)”是指那些能沿軌道作長距離連續(xù)推進(jìn)而不脫軌的馬達(dá),其“占空比”(dutyratio)接近100%,在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立擔(dān)當(dāng)各種任務(wù)。而“非持續(xù)馬達(dá)”的“占空比”低于2%,它們往往聚團(tuán),以集體形式參與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),肌肉收縮即為該現(xiàn)象的體現(xiàn)形式之一。1.2dna分子馬達(dá)運(yùn)轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)DNA作為生命遺傳物質(zhì),其生化性質(zhì)和生物學(xué)意義已為人們所熟知。然而作為一種納米尺度的材料,DNA以其自身的可編程性、結(jié)構(gòu)的多樣性和變化的可控性等諸多優(yōu)點(diǎn)成為納米科學(xué)、生物科學(xué)和材料科學(xué)交匯點(diǎn)的一顆明星。DNA分子馬達(dá)運(yùn)轉(zhuǎn)的基礎(chǔ)是DNA不同構(gòu)象間的可控轉(zhuǎn)化,這種轉(zhuǎn)化的控制條件可以是多種多樣的。目前已經(jīng)設(shè)計(jì)的DNA馬達(dá)按控制條件可分為兩大類:一類是環(huán)境刺激響應(yīng)的馬達(dá),這類分子的構(gòu)象取決于溶液的環(huán)境條件,如溫度、pH值或某種離子的濃度等,因此,通過變溫或加入酸、堿、鹽等方法改變?nèi)芤旱沫h(huán)境條件,即可驅(qū)動(dòng)馬達(dá)的運(yùn)轉(zhuǎn);第二類是基于鏈交換反應(yīng)的馬達(dá),即利用DNA雙鏈互補(bǔ)配對的性質(zhì),將特異性的DNA鏈作為燃料來驅(qū)動(dòng)DNA分子的構(gòu)象變化。2為什么我們要研究生物分子的馬可達(dá)馬？2.1生物分子馬達(dá)生物分子馬達(dá)幾乎參與了所有的生命活動(dòng),例如,細(xì)胞分裂,“中心法則”的執(zhí)行,生物能量“貨幣”ATP的合成,肌肉收縮,胞漿移動(dòng),胞膜穿梭,細(xì)胞極化,信號傳導(dǎo),病毒包裝和細(xì)菌的光、化學(xué)趨化等。每一個(gè)生物過程猶如一個(gè)復(fù)雜的工廠作業(yè)流程,由各種機(jī)器協(xié)同完成。這類機(jī)器包括DNA解旋酶、DNA復(fù)制酶、mRNA轉(zhuǎn)錄酶、核糖體和病毒包裝馬達(dá)等。其“產(chǎn)品”也多種多樣,例如,信號分子的激活及抑制,大分子的構(gòu)象變化,某些分子的空間位移等。對于生物分子馬達(dá)的研究類似于將整套設(shè)備分拆成各個(gè)功能不同的部件,就是在單分子水平上認(rèn)識生物體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)規(guī)律。只有認(rèn)識了各馬達(dá)的功能,我們才有可能用系統(tǒng)生物學(xué)的方法將各分子的相互作用網(wǎng)絡(luò)還原到生命過程,從而進(jìn)一步揭示生物作用網(wǎng)絡(luò)的醫(yī)學(xué)和生物學(xué)意義。2.2生物分子馬達(dá)人造機(jī)器要實(shí)現(xiàn)化學(xué)能與力學(xué)能的轉(zhuǎn)化,必須借助中間介質(zhì)如熱或電,即能量轉(zhuǎn)化是間接的,這就決定了人造機(jī)器的能量轉(zhuǎn)化效率是不理想的。生物分子馬達(dá)則不同,它們能將化學(xué)反應(yīng)所釋放的化學(xué)鍵能通過自身的構(gòu)象變化直接轉(zhuǎn)換成力學(xué)能。其轉(zhuǎn)換效率非常驚人,例如驅(qū)動(dòng)蛋白達(dá)60%,而ATP合成酶接近100%。因此,在機(jī)器的能量轉(zhuǎn)化效率方面,生物分子馬達(dá)給我們帶來很多啟示,這也是為什么它們的力學(xué)化學(xué)耦合(mechanochemicalcoupling)機(jī)制令科學(xué)家著迷的原因。2.3種構(gòu)象的選擇DNA不僅可以構(gòu)建超分子結(jié)構(gòu)或引導(dǎo)其他分子的富集與組裝,還可以實(shí)現(xiàn)納米尺度下的運(yùn)動(dòng)。DNA有形成氫鍵的能力,又有著多種構(gòu)象的選擇,它可以折疊或雜交形成雙鏈、三鏈、四鏈的結(jié)構(gòu)。通過適當(dāng)?shù)男蛄性O(shè)計(jì)和條件控制,我們可以操縱DNA的構(gòu)象變化,即在納米尺度實(shí)現(xiàn)可控運(yùn)動(dòng)。因此,DNA可以被設(shè)計(jì)成各式各樣的分子機(jī)器,這些機(jī)器可以完成分子做功、能量轉(zhuǎn)換、分子控釋等工作,并有望將各種馬達(dá)集合成功能更強(qiáng)大的分子機(jī)器或微型工廠,從而在能源、環(huán)保、醫(yī)療乃至更為廣泛的領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)其神奇的應(yīng)用。2.4對兩態(tài)熱的計(jì)量研究在傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)中,一旦我們知道系統(tǒng)的始態(tài)和終態(tài)能量及連接兩態(tài)的路徑,便可確定系統(tǒng)對外作的功。事實(shí)上,兩態(tài)的能量及系統(tǒng)與環(huán)境在路徑上的交換熱在玻爾茲曼統(tǒng)計(jì)上均有kBT漲落,只是在宏觀統(tǒng)計(jì)中,這個(gè)量級的漲落被忽略了。如果系統(tǒng)很小,這樣的漲落則不能被忽略。這類微觀系統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)問題是納米科學(xué)當(dāng)前所面臨的研究障礙。生物分子馬達(dá)正是這樣的微觀系統(tǒng),它為物理學(xué)家解決該問題提供了一個(gè)理想的研究平臺。3生物分子馬蹄研究的重要進(jìn)展3.1驅(qū)動(dòng)蛋白和atp的合成蛋白馬達(dá)的歷史可以追溯到對肌肉收縮的研究。1846年,Kuhne及其同事首次將肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白細(xì)絲(actinfilament)的復(fù)合物從肌肉組織中解剖出來;1941年,Straub和Szent-Gyorgyi分別將肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白從復(fù)合物中成功分離;1963年,Gibbons識別了驅(qū)動(dòng)精子和纖毛拍動(dòng)的動(dòng)力蛋白;1985年,Brady和Vale等純化了沿微管(microtubule)輸運(yùn)細(xì)胞器的驅(qū)動(dòng)蛋白。此后,蛋白馬達(dá)的研究步伐有了進(jìn)一步的加速,尤其是最近二十年,在基因工程的幫助下,科學(xué)家們又發(fā)現(xiàn)了大量蛋白馬達(dá)。通過馬達(dá)域(motordomain)氨基酸序列的比對,大部分蛋白馬達(dá)已被歸類到上述三大家族。在ATP合成方面,1929年,Lohmann發(fā)現(xiàn)了ATP;1939—1941年間,Lipmann證明ATP是細(xì)胞的能量載體并獲1953年Nobel獎(jiǎng);1948年,Todd用化學(xué)方法合成ATP并因此獲得1957年Nobel獎(jiǎng);1940—1950年代,科學(xué)家觀察到在細(xì)胞呼吸或光合作用期間,線粒體或葉綠體內(nèi)的ATP濃度會顯著上升;1960年,Racker成功地從線粒體膜上分離出ATP合成酶,該酶由兩部分組成,分別被命名為Fo和F1,從此,該馬達(dá)被稱為“FoF1”ATP合成酶。3.2細(xì)胞骨架與atp合成隨著X射線衍射及核磁共振(NMR)技術(shù)的發(fā)展,科學(xué)家相繼獲得了某些主要蛋白馬達(dá)的結(jié)構(gòu),為進(jìn)一步研究蛋白馬達(dá)的功能打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。1950年代以來,Huxley專注于肌肉結(jié)構(gòu)的研究,并首次提出了肌肉收縮的細(xì)絲滑移模型;1993年和1996年,Rayment和Kull分別解出了肌球蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白的原子結(jié)構(gòu);細(xì)絲和微管的結(jié)構(gòu)也相繼于1990—1998年間由Holmes,Kabsch,Lowe和Nogales等獲得。另一方面,細(xì)胞骨架在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中所扮演的角色也不斷被揭示出來。1989—1997年間,Cortese和Fygenson等證實(shí)了單純靠細(xì)絲或微管的聚合或解聚也能發(fā)力和產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)。基于有關(guān)ATP合成及細(xì)胞呼吸之間的關(guān)聯(lián)研究,Mitchell于1961年提出了“化學(xué)滲透假說”(chemiosmotichypothesis)并獲1978年Nobel獎(jiǎng);1973年,Boyer等首次提出了ATP合成的“結(jié)合變換機(jī)制”(bindingchangemechanism);1994年,Walker通過晶體結(jié)構(gòu)證實(shí)了該機(jī)制的正確性,與Boyer分享1997年Nobel獎(jiǎng)。1990年以來,一種精巧的質(zhì)子梯度鉗(ΔpHclamp)技術(shù)得到發(fā)展。Graber,Rumberg和Strotmann小組等先后測量了ATP合成酶的整個(gè)酶動(dòng)力學(xué),并發(fā)現(xiàn)ADP和磷酸根Pi的米氏常數(shù)同時(shí)隨跨膜質(zhì)子梯度的上升而下降;2007年,舒咬根等提出了力學(xué)化學(xué)緊耦合模型,并解析了該馬達(dá)的酶動(dòng)力學(xué)。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,該模型排除了ADP和Pi有序結(jié)合的可能性,獲得了該可逆馬達(dá)的“相圖”(見圖3)。3.3熒光單分子檢測1990年代以前,對細(xì)胞內(nèi)生物大分子的化學(xué)性質(zhì)的研究均通過系綜測量進(jìn)行,其結(jié)果反映的是大量分子的平均行為,而人類對其物理性質(zhì)的認(rèn)識僅停留在測序分類和晶體結(jié)構(gòu)之類的靜態(tài)層面上。我們對于生物分子馬達(dá)的興趣點(diǎn)是它們的“自動(dòng)性”,即它們是如何啟動(dòng)、運(yùn)動(dòng)和發(fā)力,以何種方式沿軌道運(yùn)動(dòng),每個(gè)運(yùn)動(dòng)周期消耗多少燃料,效率如何等,要回答這些問題,必須借助1980年代發(fā)展起來的單分子操縱(manipulation)和實(shí)時(shí)視見(visualizing)技術(shù),例如原子力顯微鏡(AFM)、光鑷(opticaltweezers)、流場拖曳(hydrodynamicdrag)、磁鉗(magnetictweezers)、玻纖微管(glassmicropiptte)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、及熒光單分子檢測(fluorescencesingle-moleculedetection)等。這些技術(shù)既可探測0.1—100nm的位移,又可對單個(gè)馬達(dá)施加0.1—104pN的外力(見圖4)。1989年,Howard等首次測量了單個(gè)驅(qū)動(dòng)蛋白驅(qū)動(dòng)的微管運(yùn)動(dòng);1993—1994年間,Block,Spudich和Yanagida三個(gè)小組先后測得驅(qū)動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白的步長和發(fā)力大小;1997年,Block和Gelles兩小組同時(shí)測得驅(qū)動(dòng)蛋白每步進(jìn)8nm消耗一個(gè)ATP,證明了驅(qū)動(dòng)蛋白的力學(xué)與化學(xué)之間是緊耦合的;1999年,Block小組發(fā)展出力鉗(forceclamp)技術(shù),并測量了外力對驅(qū)動(dòng)蛋白酶動(dòng)力學(xué)的影響;2002—2004年間,先后有5個(gè)小組(Gelles,Block,Higuchi,Vale和Howard)證實(shí)驅(qū)動(dòng)蛋白-1沿微管是步行的(hand-over-hand);1997年,Kinosita小組實(shí)時(shí)視見了F1在ATP溶液中自發(fā)轉(zhuǎn)動(dòng)(也稱“自動(dòng)”);1998年,他們又發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)動(dòng)是“步進(jìn)”的;2005年,樂加昌小組測量了質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢作用下Fo產(chǎn)生的扭矩。這些單分子實(shí)驗(yàn)得出了生物分子實(shí)時(shí)的行為與性質(zhì)。在分子機(jī)器方面,1998年,Block小組測量了單個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)力和轉(zhuǎn)錄速率;2000年,Bustamante和Bensimon兩個(gè)小組分別用光鑷和磁鑷測量了單鏈DNA張力對復(fù)制速率的影響,獲得了相似的結(jié)論,即復(fù)制速率隨張力的上升而指數(shù)衰減。但在某個(gè)張力點(diǎn),復(fù)制速率會出現(xiàn)一個(gè)峰值。前者還發(fā)現(xiàn)當(dāng)張力大于34pN時(shí),T7DNA復(fù)制酶會反向外切。2006年,舒咬根等的酶動(dòng)力學(xué)研究顯示,新生鏈的親核攻擊(nucleophilicattack)才是復(fù)制酶的限速步驟。3.4dna分子機(jī)器1999年,Seeman利用DNA的B—Z異構(gòu)互變首次組裝出一個(gè)離子調(diào)控開關(guān),此后,大量的DNA分子機(jī)器不斷被設(shè)計(jì)出來。我們在此介紹兩個(gè)有代表性的DNA馬達(dá),即2003年劉東生等利用i-motif結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的pH值調(diào)控生物分子馬達(dá)(圖5),和2004年Yin等人利用三種DNA酶以及DNA設(shè)計(jì)的定向運(yùn)動(dòng)分子機(jī)器(圖6)。4發(fā)展的高校學(xué)術(shù)研究盡管生物分子馬達(dá)的研究已經(jīng)持續(xù)了150多年,但突破性進(jìn)展出現(xiàn)在最近二十年。這些成就既得益于單分子操縱和實(shí)時(shí)視見技術(shù)的發(fā)展,更要?dú)w功于物理學(xué)家、生化學(xué)家、醫(yī)學(xué)家及計(jì)算學(xué)家等的聯(lián)合交叉研究。隨著單分子技術(shù)的不斷提高和理論研究的持續(xù)深入,在可以預(yù)見的將來,我們認(rèn)為下述領(lǐng)域?qū)兴黄?4.1硫醚的力學(xué)性質(zhì)在馬達(dá)單分子實(shí)驗(yàn)中,馬達(dá)不斷向環(huán)境耗散能量,本身也處在非平衡態(tài)。在這樣的微觀系統(tǒng)中,馬達(dá)始、終態(tài)的能量及其與環(huán)境的交換熱在玻爾茲曼統(tǒng)計(jì)上均有kBT(4pN·nm)漲落,這個(gè)量級的漲落對于分子馬達(dá)的熱力學(xué)行為是不能忽略的。因此,如何從單分子實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)中“去偽存真”,從而真正揭示分子馬達(dá)運(yùn)動(dòng)的內(nèi)在規(guī)律是物理學(xué)家面臨的一個(gè)非常迫切的問題。4.2非持續(xù)馬達(dá)的動(dòng)力學(xué)特性非持續(xù)馬達(dá)如myosinII,由于占空比很低,其布朗運(yùn)動(dòng)占主導(dǎo)?，F(xiàn)有的單分子技術(shù)還不能精確測量單個(gè)非持續(xù)馬達(dá)的步長和發(fā)力大小。非持續(xù)馬達(dá)在細(xì)胞內(nèi)是集體行動(dòng)的,在動(dòng)力學(xué)方面體現(xiàn)出的是集團(tuán)性質(zhì),Julicher和舒咬根等已在理論上研究了集體馬達(dá)的運(yùn)動(dòng)學(xué)和化學(xué)動(dòng)力學(xué),揭示了集體馬達(dá)系統(tǒng)的一些獨(dú)特性質(zhì)。如果能在體外重建這樣的系統(tǒng),或直接從肌肉組織中分離肌節(jié),我們就能用單分子技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,并進(jìn)一步深入鈣離子的調(diào)控研究。4.3fps的認(rèn)識有關(guān)ATP合成的研究已經(jīng)產(chǎn)生了5位Nobel獎(jiǎng)得主,其重要性不言而喻。但我們對ATP合成機(jī)制的了解還非常膚淺,其中對F1的理解還停留在唯象層面,對Fo的認(rèn)識則仍處在卡通階段。如何獲得Fo的結(jié)構(gòu)圖像,F1的3個(gè)催化位點(diǎn)之間如何通信,“定子”上的化學(xué)循環(huán)與“轉(zhuǎn)子”的步進(jìn)式轉(zhuǎn)動(dòng)之間如何實(shí)現(xiàn)高效的力學(xué)化學(xué)耦合,是3個(gè)位點(diǎn)都要結(jié)合核苷才能使F1轉(zhuǎn)速最大,還是只要2個(gè)位點(diǎn)結(jié)合就足夠了等問題極具挑戰(zhàn)性。4.4納米質(zhì)量的重要性盡管DNA馬達(dá)在體內(nèi)尚未被發(fā)現(xiàn),但作為一種易操縱的納米材料,理應(yīng)對納米科學(xué)有所貢獻(xiàn)。如何把握住DNA各方面的優(yōu)勢,利用其性質(zhì)構(gòu)建出更精巧、靈敏且高效的分子馬達(dá)是當(dāng)前該領(lǐng)域科研工作的重中之重。4.5kchesin-1和k現(xiàn)行小鏈n-Kinesin-1(圖1)是目前已知的自然界45億年來演化出的最小的分子馬達(dá)。它是由2條重鏈組合成的二聚體。Kinesin-1的頭部(也稱馬達(dá)域)由氨基酸鏈的N端構(gòu)成,有2個(gè)位點(diǎn)分別與核苷和微管結(jié)合;2條重鏈粘合的部分稱為驅(qū)干,它與頭部之間的柔性短鏈(13個(gè)氨基酸)稱為頸部(necklinker);2個(gè)C端和2條輕鏈組成尾巴,負(fù)責(zé)裝載“貨物”(cargo)。Kinesin-1是持續(xù)馬達(dá),它能沿微管連續(xù)行走數(shù)微米而不脫軌,這就意味著至少有一頭結(jié)合在微管上,即兩頭的ATP水解循環(huán)是相互協(xié)調(diào)的。盡管Keinsin-1的研究已經(jīng)給我們展示了豐富的結(jié)構(gòu)和生化信息,但我們依然面臨一系列問題。2006年10月在Asilomar召開的第10屆生物物理研討會“MolecularMotors:PointCounterpoint”上提出了以下問題。4.5.1持續(xù)“自動(dòng)”機(jī)制(1)在步行機(jī)制中,馬達(dá)域之間如何實(shí)現(xiàn)通信以協(xié)調(diào)各自的ATP水解循環(huán);(2)是否存在有別于步行的持續(xù)“自動(dòng)”(motility)機(jī)制;(3)單頭持續(xù)馬達(dá)如何與軌道保持聯(lián)系;(4)雙頭馬達(dá)的兩頭是否完全等價(jià);(5)雙頭馬達(dá)的非對稱步行機(jī)制有哪些功能上的優(yōu)點(diǎn);(6)馬達(dá)如何產(chǎn)生柔性以避開路徑上的障礙;(7)由各種馬達(dá)組成的分子機(jī)器,如解旋酶、聚合酶和核糖體如何沿軌道移動(dòng);4.5.2不同能量的轉(zhuǎn)化(8)在ATP水解周期中,伴隨發(fā)力和產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)的是哪個(gè)構(gòu)象變化;(9)催化位點(diǎn)微小的構(gòu)象變化如何被某些結(jié)構(gòu)(如杠桿)放大到馬達(dá)的質(zhì)心位移;(10)在ATP水解循環(huán)中,各態(tài)如何調(diào)節(jié)(某些情況下為遠(yuǎn)距離調(diào)節(jié))馬達(dá)與核苷及軌道間的親和力;(11)軌道如何影響馬達(dá)與核苷的親和力及ATP水解速率,又如何平衡各個(gè)化學(xué)反應(yīng)態(tài);(12)我們?nèi)绾尾拍塬@得一個(gè)馬達(dá)與軌道結(jié)合在一起的高分辨結(jié)構(gòu)圖;(13)除了軌道和激活因子外,肌動(dòng)蛋白和微管還能擔(dān)當(dāng)什么角色;(14)在一個(gè)充滿混沌而又漲落著“完美風(fēng)暴”(perfectstorm)的粘稠的細(xì)胞環(huán)境中,馬達(dá)如何實(shí)現(xiàn)能量的高效轉(zhuǎn)換;(15)生物分子馬達(dá)是否像布朗棘輪那樣從熱漲落獲取能量,熱漲落是否扮演其他角色;(16)蛋白的能量儲存在哪里;(17)怎樣的運(yùn)動(dòng)調(diào)整機(jī)制(kinetictuning)優(yōu)化著馬達(dá)在胞內(nèi)的角色;(18)外力或不同的負(fù)載如何影響ATP水解循