uplc法測(cè)定姜和炮姜中姜酚的含量

uplc法測(cè)定姜和炮姜中姜酚的含量

生姜是姜科植物的一種生姜（魏岱。）是多年生草本植物。姜是常用的祭品。兩者都是中醫(yī)臨床用途廣泛的中藥。二者功效有較大差別,干姜味大辛大熱,主溫中回陽(yáng),炮姜用于溫中散寒溫經(jīng)止血。前人一直有“……干姜能走能守,炮姜守而不走”之說(shuō)?，F(xiàn)代研究表明姜酚(gingerol)是干姜中的辣味物質(zhì),也是干姜的主要生物活性成分,其種類有十多種,其中含量較高的為6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚,姜酚的化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定,在炮制中也會(huì)有些損失,了解姜酚類成分在炮制過(guò)程中的變化,對(duì)于認(rèn)識(shí)其藥性變化、了解其炮制前后的質(zhì)量變化具有重要的意義。本文在文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上,采用超高效液相色譜(UPLC)法,建立了同時(shí)、快速測(cè)定6、8、10-姜酚的測(cè)定條件,比較了干姜炮制前后的含量變化并對(duì)二者的質(zhì)量進(jìn)行了提高研究,結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)建立的方法快捷、簡(jiǎn)便、靈敏度高,準(zhǔn)確性好,為干姜、炮姜的質(zhì)量提高和炮制工藝的合理選擇提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1化合物及試劑WatersAcquityH-ClassUPLC超高效液相色譜儀,包括四元梯度泵、恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器以及Empower2工作站;KQ3200DB型超聲洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司);0.2μm微孔濾膜(上海陸納生物科技有限公司);乙腈為色譜純(TEDIA,USA);屈臣氏蒸餾水;乙醇等試劑均為分析純。含量測(cè)定用姜酚對(duì)照品批號(hào)分別為:6-姜酚(23513-146),8-姜酚(23513-088),10-姜酚(23513-157);由鼎瑞化工(上海)有限公司,經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光譜鑒定其結(jié)構(gòu);按本方法色譜條件,歸一化法測(cè)得它們的純度分別為98.79%,98.81%,99.13%。干姜藥材分別購(gòu)于安徽合肥市的醫(yī)院及零售藥店,經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房李立華副主任藥師鑒定均為姜科植物姜Zingiberofficinalies(Willd.)Rose.的干燥根莖;炮姜由干姜按照《中國(guó)藥典》2010版(附錄ⅡD)項(xiàng)下燙法要求炮制得到。2方法和結(jié)果2.1砂細(xì)砂的制備按照《中國(guó)藥典》2010版(附錄ⅡD)項(xiàng)下燙法要求,將已洗好的10倍藥材量的細(xì)砂置入鐵鍋內(nèi),武火加熱至微變色,炒至靈活狀態(tài),再加入大小、厚度接近的干姜片,不斷翻動(dòng),炒至鼓起,表面棕褐色,急出鍋,篩去砂、晾涼備用。2.2-姜酚溶液的配制精密稱取6-姜酚1.58mg、8-姜酚1.44mg、10-姜酚1.08mg,精密稱取,分別置于2mL量瓶中,加甲醇溶解并至刻度,搖勻,再分別精密吸取1.0、0.20、0.25mL定容至10mL,即得。2.3供試品溶液制備分別取干、炮姜粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.25g,精密稱定,分別置具篩錐形瓶中,干姜精密加入75%甲醇20mL,超聲(100W,40Hz)40min,炮姜精密加入50%甲醇20mL,超聲(100W,40Hz)30min,放冷,稱量,分別加75%、50%甲醇補(bǔ)足,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液作為供試品溶液。2.4酸水溶液比例流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸水溶液,梯度洗脫(乙腈–0.1%醋酸水溶液比例分別為0～1min,55:45;1～6min,65:35;6～7min,70:30;7～10min,90:10),流速0.25mL/min,柱溫30℃進(jìn)樣量2.0μL,檢測(cè)波長(zhǎng)280納米。2.5線性回歸分析分別精密吸取6、8、10-姜酚的對(duì)照品溶液1.0,2.0,3.0,4.00,5.0μL,分別進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,以各色譜峰面積分值(Y)對(duì)其濃度(X)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果如表1。結(jié)果表明6-姜酚在79.0～395.0μg/mL;8-姜酚在14.4～72.0;10-姜酚13.5～67.5;范圍內(nèi),與峰面積均成良好的線性關(guān)系。2.6儀器精密度試驗(yàn)吸取對(duì)照品溶液2.0μL,連續(xù)進(jìn)樣5次,6,8,10-姜酚峰面積的RSD(n=5)分別為0.27%,0.31%,0.90%,表明儀器精密度良好。2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液,在0～12h內(nèi)每隔2h進(jìn)樣一次,計(jì)算6,8,10-姜酚峰面積的RSD,結(jié)果分別為0.38%,1.90%,2.08%,表明供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。2.8樣品中姜酚含量測(cè)定分別取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液各2μL,注入超高效液相色譜儀,記錄色譜圖(見圖1),以峰面積計(jì)算樣品中6、8、10-姜酚的含量,見表2。2.9回收率的測(cè)定精密量取已測(cè)知含量的干姜藥材(山東2)樣品約0.1g共6份,分別置10mL量瓶中,加入各對(duì)照品溶液適量,按2.2項(xiàng)下處理溶液,用甲醇稀釋定容,過(guò)0.2μm的微孔濾膜,取2.0μL續(xù)濾液注人液相色譜儀,測(cè)定,計(jì)算各成分回收率,結(jié)果見表3。3不同來(lái)源地用藥前后化學(xué)成分的比較研究中藥的藥效是通過(guò)其所含化學(xué)成分群的綜合作用而發(fā)揮的,因此建立中藥評(píng)價(jià)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)考慮盡量多地選取含量測(cè)定對(duì)象,從而反映出其整體成分的情況。多組分多指標(biāo)含量測(cè)定,對(duì)于全面控制藥材的質(zhì)量比單一成分測(cè)定更具科學(xué)性?！吨袊?guó)藥典》2010版Ⅰ部干姜項(xiàng)下規(guī)定干姜和炮姜藥材以6-姜酚含量分別不得少于0.050%,和0.30%,標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)較低。同時(shí)測(cè)定3種姜酚類成分的含量,對(duì)與控制姜的質(zhì)量更具合理性。中藥經(jīng)過(guò)炮制前后,所含的化學(xué)成分會(huì)在“質(zhì)”、“量”兩方面產(chǎn)生不同程度的改變,因而藥性、功效、臨床療效發(fā)生隨之而改變,這也是中醫(yī)臨床選擇不同炮制品入藥的依據(jù)。此外,炮制前后化學(xué)成分含量的變化是中藥炮制研究的重要內(nèi)容之一,其研究結(jié)果不但能闡明炮制原理,而且能指導(dǎo)炮制工藝的設(shè)計(jì)、改進(jìn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定。UPLC法與普通的HPLC比較具有分析時(shí)間快、靈敏度高等特點(diǎn),在中藥成分分析中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。以往采用高效液相色譜進(jìn)行干姜藥材3種成分分析,完成l次進(jìn)樣分析就需要40min以上,而本研究采用UPLC方法,在8min內(nèi)即可完成1次進(jìn)樣,可同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定3種姜酚類成分的測(cè)定量。與HPLC相比,UPLC的分離效果和分析效率均有大幅度提高,本方法簡(jiǎn)單易行,需時(shí)較短,對(duì)于快速測(cè)定姜藥材中多種姜酚類成分含量具有很好的可操作性。實(shí)驗(yàn)共考察了不同來(lái)源地4批干姜藥材中3種姜酚的檢測(cè),并對(duì)炮制前后含量進(jìn)行了比較。從測(cè)定結(jié)果可以看出,不同來(lái)源地干姜中3種姜酚含量差異明顯,炮姜在炮制過(guò)程中3種姜酚的含量均有不同程度的降低提示姜酚類成分在炮制中含量的降低