利用烏梅制備低聚肽鐵配合物的穩(wěn)定性研究

利用烏梅制備低聚肽鐵配合物的穩(wěn)定性研究

鐵是人體所必需的元素之一。嚴(yán)重缺水是中國常見的養(yǎng)分不足。主要通過服用補鐵劑來預(yù)防和治療。然而，傳統(tǒng)的機補鐵劑吸收率很低，存在不同程度的胃腸道刺激和金屬銹味。多肽鐵配合物是一種新型的生物態(tài)鐵,可直接被腸黏膜細(xì)胞吸收,吸收率遠(yuǎn)較無機鐵高,并且天然安全,無消化道刺激,是理想的補鐵劑。因此,通過酶解等手段從食物蛋白中獲得生物活性短肽與鐵配合,開發(fā)新型補鐵產(chǎn)品,更符合現(xiàn)代消費者的需求。目前關(guān)于肽鐵配合物的研究有一些報道,如豬血蛋白肽鐵配合物、大豆肽鐵配合物、米蛋白肽鐵配合物等,但有關(guān)烏雞低聚肽鐵配合物的研究鮮有報道。烏雞又名烏骨雞(GallusgallusdomesticusBrisson),是傳統(tǒng)的補氣養(yǎng)血食材。烏雞低聚肽是以烏雞蛋白為原料,經(jīng)過酶解后獲得的小分子肽物質(zhì)。本實驗室前期研究結(jié)果表明,烏雞低聚肽具有多種生理活性,并且具有吸收快、耗能低、易于被人體消化和吸收等特點。以此為基礎(chǔ),利用烏雞低聚肽制備肽鐵配合物,能夠多方面強化烏雞補鐵的功效。但烏雞低聚肽鐵配合物作為食品原料,加工條件是否影響其穩(wěn)定性目前尚不明確。因此,本文以烏雞為原料制備烏雞低聚肽鐵配合物,以分子量分布和鐵含量為指標(biāo),研究溫度、pH值和蛋白酶消化對烏雞低聚肽鐵配合物穩(wěn)定性的影響,以期為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料和機器1.1.1藥物、試劑及儀器烏雞,市售;抗壞血酸、氯化亞鐵、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵銨、抗壞血酸、鄰菲羅啉,北京化學(xué)試劑公司,分析純;Alcalase2.4L、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶,諾維信生物技術(shù)有限公司;三氟乙酸,英國AlfaAesar公司,分析純;乙腈,美國Fisher公司,色譜純。1.1.2濃水浴鍋設(shè)備FE20K型pH計,瑞士梅特勒-托利多公司;YG30噴霧干燥機,無錫市陽光干燥設(shè)備廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,普瑞斯機械有限公司;SHZ-3循環(huán)水多用真空泵,鄭州朋來儀器有限公司;LC-20AD型高效液相色譜儀,日本島津公司。1.2實驗方法1.2.1木馬蛋白酶的制備將烏雞除去內(nèi)臟,用水洗凈后切塊,用絞肉機絞碎,加適量水用勻漿機勻漿。轉(zhuǎn)移到酶解罐中,用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8.5,升溫恒定至60℃后,以每克蛋白質(zhì)3000單位的酶量加入Alcalase2.4L,酶解2h。之后調(diào)節(jié)pH值為7.0,溫度保持60℃,以每克蛋白質(zhì)2500單位的酶量加入木瓜蛋白酶,酶解2h。酶解結(jié)束后,升溫至100℃,保持10min,滅酶。冷卻后6000×g離心15min,取上清液。用截留分子量為2×106u的陶瓷膜過濾,以虹吸方法吸出中間清液,棄去上層油脂。然后用截留分子量為1000u的超濾膜超濾,得到分子量小于1000u的濾過液,將濾過液噴霧干燥,得到烏雞低聚肽干粉。稱取8g烏雞低聚肽干粉,溶解于200mL蒸餾水中。加入2.0g抗壞血酸防止Fe2+被氧化。調(diào)節(jié)pH值為5。加入2.0gFeCl2·4H2O,于50℃下水浴反應(yīng)60min,冷卻至室溫。加入4倍體積的無水乙醇,室溫放置1h。抽濾收集沉淀,干燥后制得海洋膠原低聚肽鐵配合物樣品,置于干燥器中保存。1.2.2紫外過濾器用孔徑0.2μm聚四氟乙烯過濾膜將樣品過濾,利用高效液相色譜儀進(jìn)行凝膠過濾。流動相:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1;進(jìn)樣體積:10μL;流速:0.5mL/min;檢測波長:220nm;柱溫:30℃,利用紫外檢測器檢測,使用GPC軟件處理數(shù)據(jù)。5種肽標(biāo)準(zhǔn)品為:乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子量189)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子量451)、桿菌酶(分子量1450)、抑肽酶(分子量6500)、細(xì)胞色素C(分子量12500),分別配制成0.1%(M/V)溶液,過膜后進(jìn)樣,制作相對分子量校正曲線。1.2.3配合物的吸光度的測定肽鐵配合物經(jīng)過不同溫度、pH值和消化方式處理后,分別取5mL轉(zhuǎn)移至透析袋(分子質(zhì)量8000~14000u)中透析48h后,測定鐵離子含量。將硫酸亞鐵銨配制成10μg/mL鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL,加入10%抗壞血酸溶液2.0mL,鄰菲羅啉溶液3.0mL,用蒸餾水定容至50mL。37℃下反應(yīng)60min后,測定510nm處的吸光度。以鐵的濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后稱取0.05g烏雞低聚肽鐵,加入1mLHCl溶解,配制成0.1%烏雞低聚肽鐵溶液。稱取1mL溶液于50mL容量瓶中,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟測定其吸光度。計算公式為:鐵含量/%=[C×10-3/(m×V1/V0)]×100式中:C,標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品試液相應(yīng)的鐵含量,μg;m,樣品的質(zhì)量,g;V1,測定時所取樣品試液的體積,mL;V0,樣品處理后的定容體積,mL。式中:m1為肽鐵配合物中鐵含量,mg;m0為加入反應(yīng)體系中鐵的總量,mg。式中,W1為肽鐵配合物的總量,mg;W0為烏雞低聚肽與鐵鹽的總質(zhì)量,mg。1.2.4水浴溫度和時間將樣品用蒸餾水配置成濃度為2mg/mL的溶液,分裝至50mL離心管中,置于水浴鍋中,分別在20、40、60、80℃下水浴,2h后冷卻至室溫,分別檢測其分子量分布和鐵含量。1.2.5ph對鐵含量的影響將樣品配置成濃度為2mg/mL的溶液,分裝至50mL離心管中,分別用1mol/LHCl和1mol/LNaOH調(diào)節(jié)各管pH為3、5、7、9,在37℃的水浴鍋中放置2h,冷卻至室溫后分別檢測其分子量分布和鐵含量。1.2.6外部模擬對胃腸胃的消化實驗1.2.6.消化前對照處理將樣品配置成濃度為2mg/mL的溶液,將40mL溶液置于50mL離心管中,用1mol/LHCl調(diào)節(jié)pH為2,在37℃的水浴鍋中預(yù)熱片刻,加入3%(E/S)胃蛋白酶,混勻后迅速取出樣品20mL于另外1支50mL離心管,沸水中滅酶活10min,以此作為樣品消化前對照。取出后,將剩余20mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3h,沸水中滅酶活10min,冷卻至室溫后分別檢測消化前后的樣品的分子量分布和鐵含量。1.2.6.不同ph對樣品消化的影響將樣品配置成濃度為2mg/mL的溶液,將40mL溶液置于50mL離心管中,用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH為6.8,在37℃的水浴鍋中預(yù)熱片刻,加入3%(ES)胰蛋白酶,混勻后迅速取出樣品20mL于另外1支50mL離心管,沸水中滅酶活10min,以此作為樣品消化前對照。取出后,將剩余20mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3h,沸水中滅酶活10min,冷卻至室溫后分別檢測消化前后的樣品的分子量分布和鐵含量。1.2.6.不同的胰蛋白酶樣品及消化前對照按照1.2.6.1的方法進(jìn)行胃蛋白酶消化后,用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH為6.8,在37℃的水浴鍋中預(yù)熱片刻,加入3%(E/S)胰蛋白酶,混勻后迅速取出樣品20mL于另外1支50mL離心管,沸水中滅酶活10min,以此作為樣品消化前對照。取出后,將剩余20mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3h于沸水中滅酶活10min,冷卻至室溫后分別檢測消化前后的樣品的分子量分布和鐵含量。1.2.7統(tǒng)計處理實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理,組間比較采用t檢驗,若P<0.05,兩者有顯著性差異。2結(jié)果與討論2.1配合物的篩選烏雞低聚肽鐵配合物的螯合率為83.92%±0.13%,得率為41.49%±0.14%。與方法相同的同類工藝相比,螯合率與得率相對較高。本研究中心前期研究結(jié)果表明,烏雞低聚肽鐵配合物中的Fe2+與低聚肽中NH2+以及-COO-形成了配位鍵,與烏雞低聚肽相比,物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。因此,烏雞低聚肽鐵配合物是一種新型的肽鐵配合物。2.2鐵配合物的熱穩(wěn)定性烏雞低聚肽鐵配合物分別在20、40、60、80℃水浴2h之后,其分子量分布如表1所示。烏雞低聚肽鐵配合物經(jīng)過不同的溫度處理后,分子量分布基本沒有變化,各個分子量區(qū)間的比例變化不超過2%,分子量小于1000u的總含量均在85%左右。不同溫度處理后,烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量如圖1所示。與對照相比,烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量無顯著性差異(P>0.05),表明烏雞低聚肽鐵配合物經(jīng)過不同溫度處理后,鐵含量無變化,烏雞低聚肽鐵配合物具有較好的熱穩(wěn)定性。這可能由于烏雞低聚肽僅具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的一級結(jié)構(gòu),相對比較穩(wěn)定,因此對溫度作用的耐受能力強一些。包小蘭對大豆肽鈣復(fù)合物的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明大豆肽鈣復(fù)合物對高溫加熱具有較好的穩(wěn)定性,與本文結(jié)果一致。2.3不同ph值對雞低聚肽鐵配合物分子量的影響烏雞低聚肽鐵配合物在pH值分別為3、5、7、9的條件下水浴2h之后,其分子量分布如表2所示。烏雞低聚肽鐵配合物經(jīng)過不同的pH值處理后,分子量分布有一定的變化,但變化不大。由表2可以看出,烏雞低聚肽鐵配合物在性條件和堿性條件下,分子量小于1000u的總含量略有升高,但升高不超過6%?？赡苡捎陔呐c鐵形成的大分子環(huán)狀結(jié)構(gòu)在強酸或強堿的作用下斷裂,形成小分子的結(jié)構(gòu)。烏雞低聚肽鐵配合物在pH7的條件下,分子量小于1000u的總含量升高最少,總含量為86.18%。烏雞低聚肽鐵配合物在不同pH值條件下的鐵含量如圖2所示。與對照相比,不同pH值處理下的烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量均顯著性降低(P<0.05)。從圖2可以看出,在中性條件下,鐵含量降低較少,而在強酸強堿條件下,鐵含量降低較多,但在pH為3~9的范圍內(nèi),烏雞低聚肽鐵配合物仍然有58.4%以上的鐵含量,這表明烏雞低聚肽鐵配合物中肽與鐵的結(jié)合具有一定的穩(wěn)定性。2.4不同消化方式對雞低聚肽鐵配合物的影響烏雞低聚肽鐵配合物分別經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶、先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后,其分子量分布如表3所示。烏雞低聚肽鐵配合物經(jīng)過不同的消化模式處理后,分子質(zhì)量分布有一定的變化,但變化不大。經(jīng)過蛋白酶消化后,烏雞低聚肽鐵配合物的組分中分子量小于1000u的總含量略有升高,但升高不到8%,分子量小于1000u的總含量在85%~93%。與未消化對照組相比,經(jīng)過消化后,大于1000u和500~1000u的組分所占比例略有降低,140~500u和小于140u的組分所占比例略有升高。這表明分子量相對較大的肽段經(jīng)過蛋白酶消化后分解成小分子量的肽段或氨基酸。包小蘭研究了大豆肽鈣復(fù)合物的消化穩(wěn)定性,結(jié)果表明經(jīng)過胃蛋白酶和胰蛋白酶消化作用后,大豆肽鈣復(fù)合物中大分子量組分含量減少,小分子量組分含量增加,但變化不明顯,因此大豆肽鈣復(fù)合物對消化酶的降解具有一定的耐受性。經(jīng)過不同消化方式處理后,烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量如圖3所示。與對照相比,烏雞低聚肽鐵配合物在胃蛋白酶、胰蛋白酶分別消化作用3h后,鐵含量分別為57.1%、50.2%,先經(jīng)過胃蛋白酶消化再經(jīng)過胰蛋白酶消化后,烏雞低聚肽鐵配合物仍然有37.6%的鐵含量。這說明烏雞低聚肽鐵配合物具有一定的耐受胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用。聶瑞艷等考察了羅非魚魚鱗肽鈣復(fù)合物的消化穩(wěn)定性,結(jié)果表明肽鈣復(fù)合物經(jīng)過胃蛋白酶、胰蛋白酶共同作用后,鈣結(jié)合量降低了32%,證明其具有一定的抗消化性。從消化穩(wěn)定性實驗結(jié)果可以看出,烏雞低聚肽鐵配合物的組分中分子量小于1000u的總含量增加不到8%,但其鐵含量降低了62.4%,分子量較小的變化導(dǎo)致鐵含量較大的變化。烏雞低聚肽鐵配合物的酸堿穩(wěn)定性實驗結(jié)果中也表明了這一點,分子量小于1000u的總含量增加不到6%,但鐵含量降低了41.6%。因此,烏雞低聚肽的結(jié)構(gòu)可能是影響烏雞低聚肽鐵配合物中鐵含量的重要因素。3鐵蛋白配合物的理化性質(zhì)本研究以烏雞為原料制備出烏雞低聚肽鐵配合物,并對烏雞低聚肽鐵配合物的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。結(jié)果表明,烏雞低聚肽鐵配合物具有良好的熱穩(wěn)定