應(yīng)用球囊封堵法建立閉胸式豬心肌梗死模型

應(yīng)用球囊封堵法建立閉胸式豬心肌梗死模型

0球囊封閉心肌梗死模型動脈粥樣硬化是研究缺血性心肌病的重要工具。急性心肌梗死模型的建立方法主要有電刺激法、藥物法及冠狀動脈阻斷法,其中冠狀動脈阻斷法可分為開胸結(jié)扎冠狀動脈法和閉胸式冠狀動脈堵塞法。開胸結(jié)扎在體或體外心臟的不同部位的冠狀動脈法建立心肌梗死模型一直沿用多年,該種方法創(chuàng)傷大、對心肺功能影響大,動物死亡率高。隨著冠狀動脈粥樣硬化性心臟病介入技術(shù)的成熟和普及,這一技術(shù)進步為心肌梗死動物模型的建立提供了新的途徑。閉胸式心肌梗死模型目前常用的介入方法有冠脈內(nèi)注入凝膠、海綿等栓塞冠狀動脈以及球囊封堵冠狀動脈。前者由于所形成的栓子會隨血液流動,造成梗死范圍不一致,影響模型評估。而球囊封堵冠狀動脈則通過球囊的放氣-充氣,較易控制封堵的血管位置及缺血的時間,利于觀察心肌的再灌注損傷。國外在20世紀90年代開始應(yīng)用介入方法球囊封堵冠狀動脈建立心肌梗死模型,此模型可減少實驗動物的創(chuàng)傷,并能最大程度地模擬臨床實際情況,但術(shù)中室顫及血栓形成等因素限制了制作心肌梗死動物模型的成功率。目前國內(nèi)外對球囊封堵冠脈建立心肌梗死模型研究報道尚不多見。本文主要探討提高球囊封堵法建立豬閉胸式心肌梗死模型成功率的方法。1材料和方法主要試劑、材料和機器心肌梗死范圍TTC染色:實驗結(jié)束3d后用30g/L戊巴比妥鈉麻醉動物。開胸取心臟后用生理鹽水沖洗。先大體觀察病變的形態(tài)顏色及梗死范圍,然后沿摘除心臟的心肌基底部短軸方向連續(xù)切成4.0~5.0mm的薄片,放入含有1%的TTC的PBS(pH=7.4)溶液,37℃中孵育20min后,在體積分數(shù)10%甲醛液固定24h。據(jù)文獻報道行TTC染色,確定心肌梗死范圍。TTC染色示壞死區(qū)(灰白色)和非壞死區(qū)(深紅色)。掃描后用圖像分析軟件計算心肌梗死體積和左室體積,用梗死體積占左室體積的百分比表示并計算心肌梗死面積。蘇木精-伊紅染色:實驗結(jié)束3d后,快速、準確切取心肌梗死區(qū)和非缺血區(qū)組織(不超過1cm大小),置入體積分數(shù)10%甲醛固定液中,固定后行組織修整、洗滌、乙醇逐級脫水,二甲苯置換出組織塊中的乙醇,石蠟包埋,切片機切成4μm的薄片,蘇木精-伊紅染色,封固,光鏡觀察。2結(jié)果2.1動物的數(shù)量分析2.3心電圖的發(fā)展過程2.4缺血壓再灌注和活檢再灌注2h,缺血再灌注和缺血后處理組的肌鈣蛋白Ⅰ較缺血前基礎(chǔ)值明顯增高(P<0.05);再灌注24h,缺血再灌注和缺血后處理組的肌酸激酶同工酶及肌鈣蛋白Ⅰ仍較缺血前基礎(chǔ)值明顯增高(P<0.05)。組間比較,再灌注24h缺血后處理組的肌酸激酶同工酶及肌鈣蛋白Ⅰ均較缺血再灌注組明顯降低(P<0.05)。見表1。2.5磚紅色譜分析大體標本示心肌梗死區(qū)顏色變白,心肌梗死部位分別位于心尖、左心室前壁、前間隔部。TTC染色后正常心肌呈磚紅色,梗死區(qū)心肌顏色暗淡,呈灰白色,見圖2。蘇木精-伊紅染色后,正常心肌成束平行排列,胞漿內(nèi)看到橫紋,胞核呈橢園形,位于細胞中央,見圖3a。梗死區(qū)心肌的正常結(jié)構(gòu)破壞,胞漿濃縮,染色加深,橫紋消失,核濃縮、溶解、碎裂,梗死區(qū)內(nèi)有較多的紅細胞,梗死區(qū)周圍有較多肉芽組織增生及大量炎性細胞的浸潤,見圖3b。3球囊封閉建立豬閉頭式心肌梗死模型的可行性在心血管病研究的領(lǐng)域中,動物模型被廣泛用于心肌梗死的發(fā)病機制和治療研究中,穩(wěn)定和更接近臨床發(fā)生心肌梗死的動物模型對于研究心肌梗死的科學(xué)意義重大。傳統(tǒng)的心肌梗死模型通過開胸結(jié)扎冠狀動脈完成,手術(shù)時需開胸和打開心包,該方法破壞胸腔的正常解剖結(jié)構(gòu),對心肺功能影響大;同時手術(shù)造成損傷和炎癥對動物的創(chuàng)傷大,不利于術(shù)后恢復(fù)。而利用介入方法行球囊封堵冠狀動脈建立豬閉胸式心肌梗死模型,避免了上述情況的發(fā)生,并可最大程度地模擬臨床心肌梗死發(fā)生。因該方法有影像學(xué)的支持,使球囊封堵冠狀動脈的位置相對固定,從而使心肌梗死的面積相對穩(wěn)定;同時實驗中可通過控制球囊的放氣-充氣,實現(xiàn)對心肌缺血和再灌注時間的準確控制。在用于心肌梗死研究的動物模型中,豬的心臟解剖結(jié)構(gòu)、血管分布和心臟/體質(zhì)量比與人的心臟相似,尤其是冠狀動脈系統(tǒng)的側(cè)支交叉分布均較少,且不易建立側(cè)支循環(huán),故成為建立心肌梗死模型的良好選擇對象。實驗結(jié)果顯示,堵閉左前降支遠端后,心電圖V1~3導(dǎo)聯(lián)上ST段抬高,有病理性Q波形成;心肌酶譜的演變過程與人體心肌梗死的過程也基本一致;病理檢查示心肌梗死主要位于左室前壁、心尖和前間隔。以上均足以證明豬可作為研究冠心病的較好的動物模型。球囊封堵冠脈建立豬閉胸式心肌梗死模型對實驗動物機體的生理狀態(tài)干擾降到最小,是研究心肌梗死理想的實驗動物模型。為提高建模成功率以下幾點是必須注意的:(1)防治心律失常。由于豬的冠脈側(cè)支循環(huán)少,心肌、心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)對缺血耐受性差,缺血性和再灌注性心律失常的發(fā)生率很高,最常見的死因是心室纖顫,心律失常的防治是降低動物死亡率的關(guān)鍵。據(jù)作者的體會,在冠狀動脈封堵后和再灌注期常發(fā)生室性心律失常。為防治心律失常,提高建模的成功率,首先應(yīng)注意嚴密觀察心電圖變化及監(jiān)測血壓,預(yù)防性使用利多卡因滴,一旦出現(xiàn)頻發(fā)室早或短陣室速,使用胺碘酮,必要時行電除顫。(2)防治血栓形成。因豬的血液黏稠度大,在建模的過程因血流狀態(tài)的改變血液極易凝聚,形成血栓,從而擴大心肌梗死范圍,增加實驗動物的死亡率。使用肝素可減少血栓形成的發(fā)生率,增加建模的成功率。本實驗中使用首劑肝素8000U注射,每隔1h追加注射肝素2000U,均未發(fā)生血栓及出血。(3)缺血后處理。缺血后處理是近年發(fā)現(xiàn)的與缺血預(yù)處理有同樣效果的心肌保護措施,因缺血后處理可在缺血后進行,且干預(yù)方法簡便,只需在實施經(jīng)皮冠狀動脈介入的過程中進行幾次簡短的開通、夾閉操作就可發(fā)揮其心肌保護作用,這使得缺血后處理成為一個具有廣闊臨床應(yīng)用前景的治療措施。目前僅在小樣本的臨床實驗和鼠、兔、犬等體型較小的動物上發(fā)現(xiàn)缺血后處理心肌保護作用,而在體型較大且冠狀動脈分布最接近人類的實驗動物——豬尚無定論,且多用開胸式模型或體外心臟研究豬心肌缺血后處理的保護作用,而使用球囊封堵建立閉胸式心肌梗死模型的研究不多見。本實驗在實施球囊封堵后行缺血后處理,即通過控制球囊的充氣和放氣予8次反復(fù)短暫的缺血再灌注操作,該組的5只動物全部建模成功。而缺血再灌注組有4只動物建模成功,有1只動物死于再灌注期發(fā)生的頑固性室顫。豬的心肌對缺血較為敏感,在建模的過程中極易發(fā)生心律失常。有研究表明,缺血后處理可減少體外鼠心再灌注心律失常的發(fā)生,這與其抗缺血損傷的內(nèi)源性心肌損傷的作用有關(guān),但具體的機制目前尚不清楚。因本實驗所采用實驗動物的特殊性,模型數(shù)量有限,故缺血后處理是否可提高球囊封堵冠狀動脈建立豬閉胸式心肌梗死模型的成功率及相關(guān)的機制,尚有待于進一步研究。本實驗顯示,術(shù)中使用利多卡因及肝素防治心律失常及血栓形成是球囊堵閉冠狀動脈豬建立閉胸式心肌梗死模型有效方法,運用缺血后處理可能是提高建模成功率的因素之一。這種心肌梗死模型接近機體的病理生理狀態(tài)、創(chuàng)傷小,是研究心肌梗死理想的動物實驗?zāi)Ｐ?。設(shè)計隨機對照動物實驗,病理觀察。時間和地點于2008-07/2009-08在昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科及昆明醫(yī)學(xué)院病理教研室完成。動物實驗室機關(guān)15只8~11月齡健康滇南小耳豬,雌雄不拘,體質(zhì)量20~30kg,由昆明醫(yī)學(xué)院動物實驗室提供。實驗過程中對動物處置符合科學(xué)技術(shù)部2006年《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的要求。麻醉和術(shù)前準備麻醉狀態(tài)的保證選擇小型豬,空腹6h以上,30g/L戊巴比妥鈉20~30mg/kg耳緣靜脈麻醉后將豬仰臥固定在手術(shù)臺。術(shù)中據(jù)肢體運動情況每20~30min重復(fù)靜脈注射戊巴比妥鈉2~5mg/kg維持麻醉。使豬保持麻醉狀態(tài),并注意豬的生命體征。行有創(chuàng)動脈血壓監(jiān)測。持續(xù)心電監(jiān)測,并描記12導(dǎo)心電圖變化。主動脈造影及再灌注右腹股溝區(qū)皮膚以碘伏消毒后鋪無菌單,20g/L利多卡因局部麻醉后于腹股溝韌帶行股動脈穿刺,置入6F動脈鞘,靜脈注入肝素8000U,后每隔1h追加注射肝素2000U。實驗豬隨機數(shù)字表法分為3組:假手術(shù)組、缺血再灌注組、缺血后處理組,每組5只。以5F310L左冠狀動脈造影導(dǎo)管分別行左、右冠狀動脈造影,觀察豬冠狀動脈分布情況。造影后置入2.0mm或2.5mm的球囊至左前降支第一對角支的遠端。假手術(shù)組只放置球囊至左前降支,不封堵冠狀動脈;缺血再灌注組303.975~405.300kPa打開球囊堵閉左前降支60min;缺血后處理組行球囊充氣堵閉左前降支60min后,球囊放氣30s,充氣30s(循環(huán)8次)。冠脈封堵后和再灌注期應(yīng)密切注意監(jiān)測心電圖及動脈壓力變化,預(yù)防性使用利多卡因(1.0~2.0mg/kg)靜滴,減少惡性心律失常的發(fā)生率。一旦出現(xiàn)頻發(fā)室早或短陣室速,使用胺碘酮75~150mg靜脈推注,必要時行電除顫。建模成功撤除球囊形成再灌注,拔除動脈鞘管并壓迫止血。肌注青霉素400萬單位,在豬清醒之前送回動物中心。手術(shù)后約1h豬蘇醒。第2天即可進食。單獨飼養(yǎng)以保持清潔。成功的死胡同模型標志冠狀動脈造影示球囊遠端血流中斷,心電圖表現(xiàn)為V1~V3導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段抬高,T波高聳融合。心肌酶同工酶活性測定分別于缺血前,術(shù)后24h前腔靜脈取血,使用BECKMANCOULTERACCESS2儀器,微粒子化學(xué)發(fā)光法測定血清心肌酶:肌酸激酶同工酶及肌鈣蛋白Ⅰ。主要觀察指標行冠脈造影、心電圖及心肌酶評價心肌梗死模型的建立情況。在實驗結(jié)束后行TTC染色及病理學(xué)檢查驗證心肌梗死。心肌梗死模型的建立實驗設(shè)計為第一、二作者,實施為第一、三、四、五、六作者,評估為全部作者,采用盲法評估,均受過系統(tǒng)培訓(xùn)。左前降支堵閉3~5minV1~V3導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段抬高,T波高聳融合。隨著堵閉時間的延長,ST段逐漸升高。撤除球囊心肌再灌注后,ST段回落,見圖1。來自本文課題的更多信息--實驗設(shè)計與文章構(gòu)思:心肌梗死動物模型的建立是研究人心肌梗死的重要工具。建立方法有冠狀動脈結(jié)扎法、鉗夾法、栓塞法、球囊阻塞法、銅絲支架致血栓形成、液氮冷凍、電凝灼傷法等。文章采用豬和球囊阻塞法成功制作了心肌梗死模型,基本模仿了人心肌梗死的發(fā)生過程,創(chuàng)傷小、方法簡單、成功率高。在建模過程中,使用利多卡因及肝素防治心律失常及血栓形成是建模成功的有效方