聚乙二醇衍生物的化學修飾

聚乙二醇衍生物的化學修飾

聚乙二醇衍生物及其應用化學修養(yǎng)作為提高山羊（包括蛋白質）、核酸和茶多酚等生物分子的臨床和生物學性能的重要手段，得到了越來越多的研究和應用。化學修飾的效果好壞很大程度上取決于化學修飾劑的性能優(yōu)劣。為此,化學修飾劑的合成近年來一直吸引著世界范圍內生物、醫(yī)學和化學工作者的研究興趣。迄今,已經(jīng)有許多種類的修飾劑被相繼合成出來。代表性的修飾劑有乙酰咪唑、鹵代乙酸、N-乙基馬來酰亞胺、碳化二亞胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-鹵代琥珀酰胺、乙二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯/順丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸、聚氨基酸、葡聚糖、環(huán)糊精及其衍生物、聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)及其衍生物等。其中聚乙二醇及其衍生物由于具有下述的優(yōu)良性能而在化學修飾中應用最多。(1)PEG具有兩親性,既可以溶解于水,又可以溶解于絕大多數(shù)的有機溶劑。(2)PEG無毒,免疫原性低,其生物相容性也已經(jīng)通過美國FDA認證。(3)PEG的分子量范圍很寬,從幾百到數(shù)十萬,選擇余地大。(4)PEG可以將它的許多優(yōu)良性質賦予修飾后的生物分子。本文綜述了生物分子化學修飾用聚乙二醇衍生物,主要包括聚乙二醇衍生物的分類,常用聚乙二醇衍生物的合成方法及其性能比較,以及聚乙二醇衍生物在生物醫(yī)學和生物技術領域中的應用等。1二醇聚乙二醇衍生物的分類根據(jù)活化方式、電性、結構和端基等的不同,聚乙二醇衍生物可有不同的分類方法。1.1下功能基遙ph的應用按照活化方式的不同分為同端基遙爪聚乙二醇和異端基遙爪聚乙二醇。將PEG兩端的羥基用不同的基團取代,得到異端基遙爪聚乙二醇,如果兩端的取代基團均為活性基團,則稱為異端雙功能基遙爪聚乙二醇;如果兩個取代基團中一個為不活潑或者惰性基團,另外一個為活潑基團,則稱為異端單功能基遙爪聚乙二醇。由于PEG兩端同時活化不但要消耗較多的活化試劑,而且在化學修飾過程中容易發(fā)生交聯(lián),有些情況下還不得不加入其它化合物來阻止或抑制交聯(lián)反應的發(fā)生,所以同端基遙爪聚乙二醇目前已經(jīng)很少使用。異端雙功能基遙爪聚乙二醇較難合成,并且在用于化學修飾時也會象同端基遙爪聚二醇那樣發(fā)生不期望的交聯(lián)反應,因此,實際應用也較少。相比之下,異端單功能基遙爪聚乙二醇由于容易合成,很少或不發(fā)生交聯(lián)反應而得到了廣泛的應用。1.2etcylusge-peg根據(jù)端基電性的不同,聚乙二醇衍生物可以分為親電和親核兩大類。親電類聚乙二醇衍生物比較常用,種類也很多,如SS—PEG(PEGSuccinimidylSuccinate),SCM-PEG(SuccinimidylesterofcarboxymethylatedPEG),BTC\_PEG(BenzotriazolecarbonateofPEG),SPA-PEG(PEGsuccinimidylpropionate),SBA\_PEG(PEGsuccinimidylbutanoate),PEG2NHS(PEG2succinimide),EPOX\_PEG(PEGglycidylether),CDI\_PEG(PEG-Oxycarbonylimidazole),NPC\_PEG(PEGnitrophenylcarbonate),ALD\_PEG(PEG-aldehyde),NCO\_PEG(PEG-isocyanate)等。親核類聚乙二醇衍生物有聚乙二醇胺類衍生物PEG\_O\_CH2CH2—NH2\,聚乙二醇巰基類衍生物PEG\_O\_CH2CH2\_SH等。1.3peg的活性端基按鏈結構形狀的不同,聚乙二醇衍生物有線形、星形和梳形。線形聚乙二醇衍生物只包含一個聚乙二醇線形結構單元。星形聚乙二醇衍生物中包含若干個呈輻射狀的聚乙二醇結構單元。其結構一般為[X—(CH2CH2O)n]a—Z—[(CH2CH2O)n—OH]b,X可以是胺基、羥基、羧基、醛基、巰基、鹵素和環(huán)氧化物等;Z可以是酰胺、氨基甲酸酯和酯類等;m、n一般為10~2000,a一般為1~5;b一般為1~100。星形的PEG一般只有一個相對活潑性較高的端基,這個活性端基可以在PEG的一端,也可以在Z上。聚乙二醇與馬來酸酐等化合物形成的共聚物具有多個反應位點,呈現(xiàn)梳形結構,因而被稱為梳形聚乙二醇衍生物,結構如圖1所示。ORCH2O(CH2H4O)nCH3CH2CHOCOCOCHn圖1梳形PEG結構2聚乙二醇作為一種常見的合成和性能比較常用的聚乙二醇衍生物如圖2所示。以下分別介紹它們的合成方法,并比較它們在生物分子修飾時的性能。2.1聚氰酰氯上的羥基化合物這類修飾劑包括活化的PEG1[2-(O-methoxypolyethyleneglycol)-4,6-dichloro-s-triazine]和PEG2[2,4-bis(O-methoxypolyethyleneglycol)-6-dichloro-s-triazine]。三聚氰酰氯上的氯原子與MPEG(甲氧基聚乙二醇)上的羥基反應可以得到活化的PEG1和PEG2(分子式如圖2中2和1)。PEG1和PEG2上的游離氯原子可以分別在pH8~9和pH9.5~10與蛋白質的氨基反應。由于PEG2上有兩個PEG鏈,在修飾反應后能夠更好地起到保護蛋白質的作用,故修飾效果要比PEG1好一些。Olsen等采用如下方法制備出PEG2:4A分子篩和MPEG5000加入苯中回流干燥,然后向上述混合物中加入氧化鋅和三聚氰氯在80℃下攪拌反應2d左右,冷卻到室溫后再加入一定體積的苯。所得懸浮液進行過濾,濾液經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮至干,即得PEG2。Abuchowski等同時還研究了PEG2的制備方法:MPEG5000溶解在無水二氯甲烷中,加入冷的三乙基胺反應90min后加入乙醚攪拌3min,過濾出黃色沉淀,用乙醚洗滌后用乙酸乙酯除去其中的鹽,緩慢冷卻至室溫,放入冰箱中進一步冷卻,即得產(chǎn)品。2.2peg2—PEG氨基酸類衍生物由于氨基酸本身就是構成蛋白質和多肽分子的重要組分,因此用氨基酸類物質作為PEG的端基,將賦予PEG修飾劑更好的生物相容性。Yamasaki等人通過MPEG酸與正亮氨酸上的α-氨基或賴氨酸上的α-氨基和ε-氨基的反應制備出PEG的氨基酸類衍生物。PEG的氨基酸類衍生物可以通過N-羥基琥珀酰胺進一步活化。根據(jù)該思想,通過下述步驟制備出PEG2—GABA—NHS:將PEG2(圖2中所示)加入到硼酸鹽緩沖溶液中,加入γ-氨基丁酸在4℃下反應過夜,用鹽酸酸化后,用三氯甲烷萃取出PEG2—GABA,重結晶兩次后,用二氯甲烷溶解,加入N-羥基琥珀酰胺(NHS)和環(huán)己基碳二亞胺(DCC),在室溫下反應過夜,得到PEG2—GABA—NHS。PEG2—GABA—NHS相對于PEG2有更高的生物活性,用修飾SOD來比較它們的的活性。在pH=7.2,T=4℃下,PEG2不發(fā)生反應,只有在pH=11.0,T=4℃條件下在16h內完成所需的修飾反應。而在相同的實驗條件下PEG2—GABA—NHS能在4h內完成95%的反應,2/7的氨基殘基發(fā)生反應;并且用PEG2—GABA—NHS進行修飾時,不會產(chǎn)生毒副產(chǎn)物。2.3ss—PEG酰胺類衍生物PEG的N-羥基琥珀酰胺酯類衍生物在pH7~9范圍內可以直接與蛋白質上的氨基反應。將PEG上的羥基衍生為羧基的最常用途徑是通過羥基與琥珀酸酐之間的反應,所得衍生物為PEG琥珀酰胺、琥珀酸酯,如SS—PEG。Abuchowski等人報道了SS—PEG的制備過程:MPEG5000加入到無水甲苯中,然后加入丁二酸酐,將混合物加熱至150℃,控溫反應5h。減壓下蒸餾將甲苯蒸出,蒸餾殘液用二氯甲烷洗滌,然后加入乙醚沉淀產(chǎn)物。產(chǎn)物用二氯甲烷和乙醚重結晶,得到丁二?；募籽趸垡叶?。丁二酰化的甲氧基聚乙二醇溶解到無水二氯甲烷中,加入NHS和DCC,在冰浴中溶解,然后在室溫下反應20h。副產(chǎn)物為固體,可通過過濾除去,濾液加入乙醚后形成沉淀,離心分出,重結晶后得到產(chǎn)品SS—PEG,過程涉及的主要化學反應如下:此外,有關PEG的羧甲基或羧乙基的琥珀酰胺衍生物如SC—PEG(圖2中4所示)的制備,Zalipsky等人開展了一些研究工作,得到了如下制備方法:MPEG5000溶于苯(或者二氯甲烷)中,將光氣溶于甲苯中,與上述液體混合反應過夜,將反應混合物蒸干,剩余的光氣在減壓條件下蒸出,蒸餾殘物重新溶于苯或二氯甲烷中,加入N-羥基琥珀酰胺,然后加入三乙苯胺,將反應液過濾后重新溶于500℃下的乙酸乙酯中,過濾出少量不溶物,降溫結晶得到產(chǎn)品。其主要反應過程如下:2.4活化pm聚合物聚乙二醇與馬來酸酐之間通過共聚反應可以得到具有多個反應位點,呈現(xiàn)梳形結構(縮寫形式為PM)。目前,已經(jīng)制備出兩種活化的PM共聚物:分子量為13,000的活化PM13和分子量為100,000的活化PM100。蛋白質分子上的氨基酸與PM修飾劑上的馬來酸酐直接偶合形成酰胺鍵。這些梳形修飾劑具有獨特的性質,如在蛋白質分子的表面覆蓋上一個陰離子基團等。2.5多功能peg衍生物的合成除了用于修飾氨基的PEG衍生物以外,還有用于修飾其它基團的PEG衍生物。例如,PEG胺類衍生物可以用來修飾羰基化合物并且可以作為合成其它修飾劑的中間體。一種最有吸引力的途徑是把馬來酰亞胺PEG偶合到蛋白質的巰基上,因為蛋白質上的游離半胱氨酸殘基很少存在于蛋白質分子表面。最近的文獻報道,一類新型的多功能PEG衍生物修飾劑通過如下過程合成出:SC—PEG與溶于硼酸鹽緩沖液的賴氨酸鹽酸鹽在pH8.0和室溫下反應2d左右的時間后,用草酸將溶液pH值調至3。然后用二氯甲烷萃取,用硫酸鈉干燥后過濾,濾液在乙醚中沉淀,可以得到賴氨酸的兩個氨基被兩個PEG分支所取代的星形PEG衍生物(MPEG-DisubstitutedLysine)。2.6修飾反應后生物分子活性的變化PEG衍生物修飾劑的性能的主要評價指標是偶合反應的活性與選擇性、修飾劑本身和修飾反應副產(chǎn)物的毒性以及修飾反應產(chǎn)物的生物活性和穩(wěn)定性。修飾劑的活性決定著修飾反應的條件,為了保持生物分子的生物活性,修飾反應應當在盡可能溫和的條件下進行。修飾反應對生物分子上特定的官能團的選擇性決定修飾反應的專一性,也直接影響著修飾產(chǎn)物的其它性能,如免疫原性等。修飾反應后生物分子的活性,如酶的催化性能會發(fā)生變化,不同的修飾劑對偶合物生物活性的影響不一樣。另外,修飾反應往往是可逆反應,由于逆反應的發(fā)生,修飾劑分子也會從偶合物上脫落下來。不同的修飾劑與生物分子形成不同類型的鍵,鍵能的差異導致偶合物的穩(wěn)定性也不同。例如,SS—PEG與賴氨酸氨基形成的是酯鍵,而SC—PEG形成的是尿烷鍵,相比之下,尿烷鍵更穩(wěn)定些,因此其它條件相同的情況下,SC—PEG與生物分子之間形成的偶合物要比SS—PEG與生物分子之間形成的偶合物穩(wěn)定性好。表1列出常見的PEG衍生物用作修飾劑時的性能比較。3peg共價結合免疫原性20世紀50年代,生物化學家利用蛋白質的化學修飾來研究其空間結構和生物學功能。20世紀70年代后期,生物大分子的化學修飾開始引起學術界和應用部門的廣泛關注22~24。1977年,Abuchowski等人證明PEG共價結合到牛血清蛋白或過氧化氫酶上可以降低它們的免疫原性。Sehon等人也報道了用PEG修飾過敏原可以抑制IgE類抗體的產(chǎn)生。在生物技術方面,用具有兩親性的PEG修飾生物酶可以顯著提高酶的催化性能,這些發(fā)現(xiàn)拓展了用PEG對生物分子進行化學修飾的應用領域。1991年PEG修飾的腺苷脫氨基酶(PEG—ADA)成為通過美國FDA認證的第一種修飾蛋白,它用于治療因腺苷脫氨基酶缺乏引起的嚴重綜合免疫缺陷癥。下面就PEG在生物醫(yī)學領域和生物技術領域中的應用分別加以介紹。3.1rhil在生物組織學中的應用迄今為止,在生物醫(yī)學領域僅PEG修飾的蛋白質就有100多種已經(jīng)用于臨床用于疾病治療。例如,Katre和Knauf等人利用PEG(5000)修飾rhIL-2形成偶合物,改變了其原有理化性能使其疏水性變?yōu)橛H水性,分子量增加,在體內的半衰期明顯增加,抗原性明顯消失,且生物活性基本保持不變,提高了rhIL應用效率。利用PEG修飾血紅蛋白進行與血型無關的輸血研究,延長血液的保存時間,提高血液中的血紅蛋白的壽命,消除輸血過程中的傳染的疾病。表2給出了修飾后的生物大分子在生物醫(yī)學領域的主要方向和應用實例。在生物醫(yī)學領域,相關報道的比例大致為抗腫瘤蛋白占21%,代謝酶占6%,消炎蛋白占14%,過敏原占8%,抗血栓占5%,血液替代品占8%,在其他方面,如脂、毒素等占28%。3.2其它普金酶及其它氧化酶在生物技術領域,氧化還原酶占11%,脂酶占16%,蛋白酶占16%,糖苷酶占3%,雙水相分配占26%,其它如NAD(P)和其它輔酶等占22%。表3說明了PEG-生物分子偶合物在生物技術領域中的應用方向和應用實例。4聚乙二醇pacm和聚乙烯基由于聚乙二醇具有前述的獨特的物理化學性質,所以聚乙二醇衍生物修飾劑在今后一段時間內仍會在各種化學修飾劑中占據(jù)主導地位。目前,聚乙二醇衍生物修飾劑在反應活性和選擇性,以及修飾后偶合物分子的穩(wěn)定性和生物