聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的藥動(dòng)學(xué)研究

聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的藥動(dòng)學(xué)研究

重組人骨髓聚集刺激因子（rhg-csf）是治療腫瘤放射化療引起的中性細(xì)胞減少的有效藥物。它具有提高血容量中粒徑含量的功能，在傷口移植中得到了廣泛應(yīng)用。但其半衰期短,需要每日給藥。聚乙二醇(PEG)化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)是通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)的PEG化多肽類一類新藥,是將相對(duì)分子質(zhì)量為20000的單鏈PEG共價(jià)偶聯(lián)到rhG-CSF的N末端氨基上而形成的長(zhǎng)效制劑。PEG本身沒有明顯的生物活性,PEG-rhG-CSF與rhG-CSF作用機(jī)制相同,都是與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合,促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞的分化和增值,但PEG化后的rhG-CSF降低腎清除并延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)研究了癌癥患者化療后48h單次sc不同劑量的PEG-rhG-CSF,用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測(cè)藥后不同時(shí)間血液中的藥物濃度變化,以進(jìn)行臨床藥動(dòng)學(xué)研究,為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1耐藥患者和藥動(dòng)學(xué)1.1藥品與試劑:PEG-rhG-CSF質(zhì)控樣品,無色透明液體,每支0.5mL,150μg/mL,HPLC測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%,批號(hào)20030201,由山東格蘭百克生物制藥有限公司提供。樣品試驗(yàn)前于4℃保存。檢測(cè)PEG-rhG-CSF的ELISA試劑盒,購(gòu)自美國(guó)Biosource公司。1.2儀器:Model550型酶標(biāo)微板讀數(shù)儀(美國(guó)Bio-Red公司);Columbus洗板機(jī)(奧地利Tecan公司)。1.3受試患者:16例住院癌癥患者(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院),男女各8例,經(jīng)組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為非小細(xì)胞肺癌或乳腺癌(其中14例非小細(xì)胞肺癌,2例乳腺癌),年齡35~65歲(中位年齡50歲),用藥前的基礎(chǔ)中性粒細(xì)胞2.11×109~10.42×109/L(中位值5.84×109/L)。既往未接受過化療或放療,KPS功能狀態(tài)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(Karnofsky,KPS)≥60分,預(yù)計(jì)生存期3個(gè)月以上,骨髓無腫瘤轉(zhuǎn)移,造血功能和外周血常規(guī)正常,無出血傾向,無明顯心、肝、腎功能異常,自愿受試,簽署知情同意書。1.4給藥及采血方法:患者化療結(jié)束后48h單次sc給予PEG-rhG-CSF,劑量分別為30、60、100、200μg/kg,每組4例病人。于給藥前和給藥后不同時(shí)間從前肢肘窩靜脈取血,每次5mL。取血時(shí)間點(diǎn)為0d(藥前)、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、18d(藥后)。血液在室溫放置30min后,4000r/min離心15min,分離出血清,-20℃保存待測(cè)(血清樣品由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院提供)。1.5ELISA法測(cè)定血藥濃度:在預(yù)包被第一抗體的96微孔板上,孔內(nèi)加入樣品(標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品)和生物素化第二抗體各50μL(標(biāo)準(zhǔn)品100μL),輕輕混勻20s后于37℃保溫2h。除去孔內(nèi)液體,洗板4次,每次3min,除凈孔內(nèi)殘液后每孔加100μL鏈親和素-辣根過氧化物酶,室溫放置0.5h。洗去并除凈孔內(nèi)殘液后,每孔加100μL底物液TMB(3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺),室溫反應(yīng)0.5h后加100μL硫酸終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀450nm處讀取各孔的吸光度(A)值。1.6數(shù)據(jù)處理及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算:血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)用3P97藥動(dòng)程序擬合分析并計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù);采用梯形法計(jì)算AUC值,tmax和Cmax采用實(shí)測(cè)值;實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示。2結(jié)果2.1血清中peg-rhen-csf的表達(dá)分別用藥盒中提供的rhG-CSF標(biāo)準(zhǔn)品和本實(shí)驗(yàn)中PEG-rhG-CSF的質(zhì)控樣品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。rhG-CSF的終質(zhì)量濃度為0、39、78、156、312、625、1250、2500pg/mL,PEG-rhG-CSF的終質(zhì)量濃度為0、78、156、312、625、1250、2500、5000pg/mL。在上述質(zhì)量濃度范圍內(nèi),藥物質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)與吸光度值對(duì)數(shù)呈直線相關(guān),回歸方程分別為lgA=-2.636+0.902×lgC,r=0.9987(rhG-CSF)和lgA=-2.850+0.869×lgC,r=0.9979(PEG-rhG-CSF),經(jīng)平行性測(cè)驗(yàn)表明,兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線平行相關(guān)(P>0.05)。本試驗(yàn)最低定量限為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低質(zhì)量濃度點(diǎn),即78pg/mL。在100~4000pg/mL質(zhì)量濃度,測(cè)定血清中PEG-rhG-CSF的板內(nèi)RSD為6.6%~9.6%,平均準(zhǔn)確度96%~105%;板間RSD為6.3%~10.2%,平均準(zhǔn)確度為99%~100%。結(jié)果見表1。另外,該藥盒為IL-2、IL-3、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α等多種細(xì)胞因子均無明顯的交叉反應(yīng)。以上各項(xiàng)條件均能滿足藥動(dòng)學(xué)的實(shí)驗(yàn)要求。2.2血清中藥物的量測(cè)定PEG-rhG-CSF的定量測(cè)定:按照測(cè)定方法項(xiàng)下規(guī)定的方法測(cè)定,每次測(cè)定均制備1條標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算血清中藥物的量。癌癥患者化療后48h分別單次sc給予PEG-rhG-CSF30、60、100、200μg/kg后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖1。2.3計(jì)算和分析藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)血藥濃度試驗(yàn)數(shù)據(jù)用3P97藥代計(jì)算程序進(jìn)行處理。經(jīng)擬合優(yōu)度分析,藥物消除符合一房室模型,具體藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2。3討論3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定藥盒:本實(shí)驗(yàn)所用ELISA藥盒中的兩株抗體是針對(duì)天然和重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的單克隆抗體組成,用藥盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品rhG-CSF作標(biāo)準(zhǔn)曲線能很好地重復(fù)出藥盒說明書上的數(shù)據(jù),標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)與吸光度值對(duì)數(shù)呈直線相關(guān);但用該藥盒測(cè)定本研究提供的PEG-rhG-CSF,相同質(zhì)量濃度下所測(cè)定的A值均偏低,這可能與PEG大分子影響了抗rhG-CSF抗體的親和力有關(guān),造成對(duì)PEG-rhG-CSF結(jié)合靈敏度的降低;但基于兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線平行相關(guān),說明該藥盒沒有改變測(cè)定rhG-CSF的本質(zhì),可以用于測(cè)定樣品中的PEG-rhG-CSF。每次試驗(yàn)均用PEG-rhG-CSF質(zhì)控樣品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而確保了血藥濃度測(cè)定的準(zhǔn)確性。另外,本方法的精密度和準(zhǔn)確度,最低定量限以及特異性均能符合新藥藥動(dòng)學(xué)的試驗(yàn)要求。3.2單次sc給予peg-rhen-csf的單次給藥后血藥濃度變化病人sc給予PEG-rhG-CSF后,4個(gè)劑量組的消除相半衰期(t1/2ke)差異不大,組間平均半衰期為47.0h(44.6~49.8h);Cmax和AUC隨給藥劑量的增大而增大,CL隨劑量增大有降低的趨勢(shì),tmax在30~100μg/kg劑量范圍內(nèi)基本一致,而高劑量組200μg/kg則明顯延長(zhǎng)。病人化療后48h單次sc給予PEG-rhG-CSF100μg/kg后血藥濃度變化與中性粒細(xì)胞提升的關(guān)系如圖2所示,化療后病人先經(jīng)歷3d由于化療而自身動(dòng)員中性粒細(xì)胞的升高期后,從化療后第3天(給藥次日)起開始下降,到化療后第6天(藥后4d)降到低谷(3.00×109/L),該期間血液中PEG-rhG-CSF一直維持在較高的質(zhì)量濃度;藥后5~7d中性粒細(xì)胞開始持續(xù)上升,在第7天達(dá)峰值11.59×109/L;此時(shí)PEG-rhG-CSF的血藥濃度開始很快下降,提示PEG-rhG-CSF在血液中的清除受中性粒細(xì)胞的介導(dǎo),這與非PEG化的rhG-CSF主要是通過腎小球?yàn)V過被清除的機(jī)制不盡相同,該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。3.3peg-rhen-csf化rhG-CSF比較:津恤力是山東格蘭百克生物制藥有限公司上市的非PEG化的rhG-CSF產(chǎn)品,其血液消除半衰期為3.5h,血液清除率為30mL/(h·kg),臨床上用5μg/kg的劑量,需要每天注射1次;PEG化后的本品在血液中的清除半衰期明顯延長(zhǎng)(平均半衰期為47.0h),清除率明顯減慢[平均清除率為4.29mL/(h·kg)]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)PEG-rhG-CSF劑量為100μg/kg時(shí),一周只需要sc1次,就可以達(dá)到持續(xù)升高中性粒細(xì)胞的臨床效果;與每天注射5μg/kg的rhG-CSF,連續(xù)注射1周的效果相同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一長(zhǎng)效作用。3.4單次scpegfilgrastim結(jié)果比較:Pegfilgrastim(PEG化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子)是美國(guó)Amgen公司的同類產(chǎn)品。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,3例臨床非小細(xì)胞肺癌病人化療后24h按100μg/kg劑量單次scPegfilgrastim后的平均半衰期為33.2h(30.3~53.8h),平均清除率為14.0mL/(h·kg)[4.2~15.