酵母雙雜交系統(tǒng)的應用

酵母雙雜交系統(tǒng)的應用

近年來，作為一個發(fā)現和研究活細胞中蛋白質和蛋白質相互作用的技術平臺，該平臺已在近年來得到廣泛的應用。酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進行的,研究活細胞內蛋白質相互作用,對蛋白質之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達產物敏感地檢測得到,它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質之間關系的技術。大量的研究文獻表明,酵母雙雜交系統(tǒng)既可以用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質之間的相互作用,也可以用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質之間的相互作用。因此,它在許多的研究領域中有著廣泛的應用。本文就酵母雙雜交的技術平臺和應用加以介紹。1gal4轉錄因子活性和報道基因活性酵母雙雜交系統(tǒng)首先是由Fields和Song等在研究真核基因轉錄調控中建立的。酵母雙雜交系統(tǒng)最初是在人們對酵母轉錄因子GAL4的認識基礎上的。天然GAL4分子由1條多肽鏈組成,含有881個氨基酸,1個完整的酵母轉錄因子GAL4可分為結構上可以分開的、功能上相互獨立的2個結構域:位于N端1～174位氨基酸區(qū)段的DNA結合域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和位于C端768～881位氨基酸區(qū)段的轉錄激活域(Activationdomain,DAN-AD)。DNA-BD能夠識別位于GAL4效應基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(UpstreamactivatingSequence,UAS),并與之結合。而AD則是通過同轉錄機(transcriptionmachinery)中的其它成分之間的結合作用,以啟動UAS下游的基因進行轉錄。DNA-BD和AD單獨分別作用并不能激活轉錄反應,但是當二者在上游較為接近時,則呈現完整的GAL4轉錄因子活性并可激活UAS下游啟動子,使啟動子下游基因得到轉錄(圖1)。Fields等人的工作標志雙雜交系統(tǒng)的正式建立。他們以與調控SUC2基因有關的2個蛋白質Snf1和Snf2為模型,將前者與GaL4的DB結構域融合,另外一個與Ga14的AD結構域的酸性區(qū)域融合。由DB和AD形成的融合蛋白現在一般分別稱之為“誘餌”(bait)和“獵物”或靶蛋白(preyortargetprotein)。如果在Snf1和Snf2之間存在相互作用,那么分別位于這2個融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的轉錄激活因子,從而激活相應基因的轉錄與表達。這個被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱之為報道基因(reportergene)。通過對報道基因表達產物的檢測,反過來可判別作為“誘餌”和“獵物”的2個蛋白質之間是否存在相互作用。在此基礎上Fields等人采用編碼β-半乳糖苷酶的LacZ作為報道基因,并且在該基因的上游調控區(qū)引入受GaL4蛋白調控的GAL1序列。這個改造過的LacZ基因被整合到酵母染色體URA3位上。而酵母的GAL4基因和GAL80基因(GaL80是GaL4的負調控因子)被缺失,從而排除了細胞內源調控因子的影響。已經知道在Snf1和Snf2之間存在相互作用。結果發(fā)現只有同時轉化了Snf1和Snf2融合表達載體的酵母細胞才有β-半乳糖苷酶活性,單獨轉化其中任何一個載體都不能檢測出β-半乳糖苷酶活性。2母乳喂養(yǎng)系統(tǒng)的組成和發(fā)展2.1u3000eqp基因的轉錄表達酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白——蛋白的相互作用。主要結構由含有DNA結合域和DNA轉錄激活域二類載體以及酵母報告株構成。將DNA—BD與已知的誘餌蛋白質X融合,構建出BD-X質粒載體;將AD基因與cDNA文庫,基因片段或基因突變體(以Y表示)融合,構建出AD-Y質粒載體。2個穿梭質粒載體共轉化至酵母體內表達。蛋白質X和Y的相互作用導致了BD與AD在空間上的接近,從而激活UAS下游啟動子調節(jié)的酵母菌株特定報告基因(如LacZ,HIS3,LEU2等)的表達(圖1),使轉化體由于HIS3或LEU2表達而可在特定的缺陷培養(yǎng)基上生長,同時因LacZ表達而在X-Gal存在下顯藍色(圖2)。通過篩選陽性菌落即可檢測已知蛋白間的相互作用、蛋白質二聚體的形成、確定蛋白質相互作用的結構域或重要活性位點,以及從cDNA文庫中篩選與已知蛋白質X相互作用的未知蛋白質Y的編碼序列等。上述2類載體在構建融合基因時,測試蛋白基因與結構域基因必須在閱讀框內融合。融合基因在報告株中表達,其表達產物只有定位于核內才能驅動報告基因的轉錄。例如GAL4—BD具有核定位序列(nUCleat—10calizatiOnsequence),而GAL4-AD沒有。因此,在GAL4—AD氨基端或羧基端應克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。目前研究中常用binding—domain基因有:GAL4(1—147);LoxA(Ecoli轉錄抑制因子)的DNA-BD編碼序列。常用的activating-domain基因有:AL4(768-881)和皰疹病毒VPl6的編碼序列等。雙雜交系統(tǒng)的另一個構成部分是報道株。報道株指經改造的、含報道基因(repeetergene)的重組質粒的酵母細胞。2.2細胞內表達的信號酵母雙雜交系統(tǒng)的最重要應用是快速、直接分析已知蛋白質的相互作用及分析新的與已知蛋白質作用的配體及其編碼基因。酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白質之間的相互作用具有許多優(yōu)點:(1)檢測在真核活細胞內進行,在一定程度上代表細胞內的真實情況。(2)作用信號是在融合基因表達后,在細胞內重建轉錄因子的作用而給出的,省去了純化蛋白質的繁瑣步驟。(3)檢測的結果可以是基因表達產物的積累效應,因而可檢測存在于蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。(4)酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構建eDNA文庫,能分析細胞漿、細胞核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。(5)通過mRNA產生多種穩(wěn)定的酶使信號放大。同時,酵母表型,X—Gal及HIS3蛋白表達等檢測方法均很敏感。2.3酵母雙雜交系統(tǒng)的改進酵母雙雜交系統(tǒng)在分析蛋白—蛋白間相互作用具高效和快速性,但在實際應用方面仍存在一些局限性。(1)雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內,而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等,這些反應在細胞核內無法進行。另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助,這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究。(2)酵母雙雜交系統(tǒng)的一個重要的問題是“假陽性”。在酵母雙雜交系統(tǒng)建立的初期階段,由于僅僅采用β-半乳糖苷酶這一單一的報告基因體系,而這種報告基因的表達往往不能十分嚴謹地加以控制,因此容易產生一些假陽性。由于某些蛋白本身具有激活轉錄功能或在酵母中表達時發(fā)揮轉錄激活作用,使DNA結合結構域雜交蛋白在無特異激活結構域的情況下可激活轉錄。另外某些蛋白表面含有對多種蛋白質的低親和力區(qū)域,能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復合物,從而引起報告基因的表達,產生“假陽性”結果。許多研究者對雙雜交系統(tǒng)進行了改進和發(fā)展,包括對報道基因、“誘餌”表達載體以及“獵物”表達載體等做了一些改進。其中一個重要改進是引入額外的報道基因,現大多數酵母雙雜交系統(tǒng)利用酵母營養(yǎng)缺陷特點引入額外的報道基因,如廣泛采用的HIS3基因。經過改造帶有HIS3報道基因的酵母細胞,只有當HIS3被啟動表達才能在缺乏組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上生長。大多數酵母雙雜交系統(tǒng)往往同時使用2個甚至3個報道基因,用不同的啟動子表達位于酵母2個染色體上的報告基因,可明顯減少假陽性。有學者于1996年構建了PJ69—4A菌株,內含3種不同報告基因(AD2、HIS3和LacZ),分別受3種不同的啟動子(GAL2、GALl和GAL7)調控,而這3種不同的啟動子都由GAL4激活,該菌株可靈敏地檢測出很弱的結合作用,又顯著地消除了假陽性現象。針對某些誘鉺蛋白X或待篩選蛋白Y在酵母中大量表達時,可能對酵母產生一定的毒性作用,近幾年來在酵母雙雜交系統(tǒng)中主要的改進是選用更加靈敏的報告基因從而降低這些異源蛋白在酵母中的表達量,減輕這些異源蛋白在酵母中的毒性,如采用kexA酵母雙雜交系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中GAL4的BD區(qū)段被原核生物的lexA蛋白質編碼區(qū)所取代,單純皰疹病毒的88個VP編碼區(qū)取代了GAL4的AD區(qū)段。由于酵母雙雜交系統(tǒng)在原核生物細胞進行,未能真正反映高等動物體內蛋白質活動,而近年發(fā)展哺乳動物雙雜交系統(tǒng)彌補這個缺陷,該系統(tǒng)更好的模仿哺乳動物體內的蛋白——蛋白相互作用,因為哺乳動物雙雜交系統(tǒng)有一個更類似于生理環(huán)境的蛋白質合成、加工及反應體系,有利于發(fā)現起初蛋白質間相互作用,因而,哺乳動物雙雜交系統(tǒng)可作為酵母雙雜交系統(tǒng)的輔助分析手段。3單雜交系統(tǒng)及相關技術隨著酵母雙雜交系統(tǒng)的廣泛應用,這一系統(tǒng)得到了不斷的完善及改進,同時也衍生出單雜交系統(tǒng),三雜交系統(tǒng)等一系列相關的技術。這些技術在不同研究領域中的廣泛應用有力地推動了蛋白質與DNA,蛋白質與RNA,以及多種蛋白質分子間相互作用的研究。3.1酵母單雜交系統(tǒng)間相互作用的研究酵母單雜交系統(tǒng)最早是1993年由Liefal從酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)展而來,酵母雙雜交系統(tǒng)通過對報告基因的表達進行檢測以實現對蛋白質間相互作用的研究,而酵母單雜交(yeastonehybrid)系統(tǒng)是體外分析DNA與細胞內蛋白質相互作用的一種方法,通過對酵母細胞內報告基因表達狀況的分析,來鑒別DNA結合位點并發(fā)現潛在的結合蛋白基因,或對DNA結合位點進行分析。運用此技術,能篩選到與DNA結合的蛋白質,并可直接從基因文庫中得到編碼該蛋白質的核苷酸序列,而無需復雜的蛋白質分離純化操作,故在蛋白研究中,具有一定的優(yōu)勢。3.2可選擇性是毒性1996年Vidal等建立了反向酵母雙雜交系統(tǒng)(reversetwo-hybridsyseem),提供了簡便的鑒定阻斷蛋白間相互作用的方法。該系統(tǒng)用于研究相互作用的蛋白間的結構特征,篩選蛋白突變體。其原理在于BD—X/AD—Y激活的報告基因轉錄在特定的條件下是有毒性的,而相互作用的解除提供了可選擇性。反向酵母雙雜交系統(tǒng)的關鍵是摻入一種表達產物對細胞生長有毒的報導基因,用于監(jiān)測蛋白間的相互作用。例如酵母URA3基因表達產物是尿嘧啶合成所必需的,同時它又可催化5-氟乳清酸(5-FOA)轉化為有毒物質。Vidal等構建了1酵母細胞株,其URA3的表達由含GAL4結合位點的啟動子嚴密控制。此細胞株在缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基中培育需要GAL4激活結構域(GAD)和GAL4DNA結合結構域(CBD)的融合蛋白的相互作用的表達。而在含5-FOA的完全培養(yǎng)基中則受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。因此可通過篩選5-FOA抗性克隆從隨機突變庫中鑒定阻斷蛋白相互作用的突變體。反向雜交系統(tǒng)可更有效地檢測蛋白間作用的關鍵位點或起決定作用的個別氨基酸,進而分析蛋白結構和功能的關系。此外此系統(tǒng)還可篩選能阻止某些蛋白間相互作用的肽或小分子物質用作臨床治療制劑。3.3brid系統(tǒng)三雜交系統(tǒng)(three-bindinghybridsystem)用于分析蛋白質和RNA或其他小分子間的相互作用,2個蛋白之間通過第3者發(fā)生相互作用,第3物可以是蛋白質、小分子或RNA。目前有RNA三雜交系統(tǒng)(RNAthree—hybridsystem)、蛋白質三雜交系統(tǒng)(Proteinthree-hybridsYstem、激酶三雜交系統(tǒng)(Kinasethree-hybridsystem)和小分子(配體)相互作用的三雜交系統(tǒng)等研究方法。RNA三雜交系統(tǒng)是將1個已知的RNA結合蛋白與轉錄因子的DNA結合域(如LexA)構建第1個融合蛋白,第2種蛋白(待選的RNA結合蛋白)與轉錄激活結構域構建融合蛋白。此外構建和表達一雜合RNA,含有2個不同的結合位點。當RNA與2個RNA結合蛋白的結合位點相互作用時可激活報道基因的轉錄和表達。該系統(tǒng)用于確定識別目的RNA的蛋白質的RNA結合域,也可以研究被己知蛋白質識別的RNA序列。利用這個系統(tǒng)成功地發(fā)現了許多RNA與蛋白質之間的相互作用。包括鐵離子調節(jié)蛋白與鐵反應元件的結合:HIV-1RevMl0融合6AL4DB后結合到目的RNA-Rev反應元件;HIV翻譯激活因子Tat與Tar反應元件RNA序列的結合等。蛋白質的三雜交系統(tǒng),2個蛋白X和Y之間的相互作用依賴于第3蛋白Z的存在,蛋白Z調節(jié)或促進2個蛋白X和Y之間的相互作用。Zhang利用該系統(tǒng)證明Grb2促進細胞質的表皮生長因子受體結合域與Sos蛋白的相互作用。三雜交系統(tǒng)可用于分析確定RNA-蛋白作用的精確結構域,甚至單個核苷酸或氨基酸殘基;鑒定和克隆識別結合有重要生理功能RNA(如轉錄、定位、RNA病毒包裝和感染等)的蛋白質,可用于調控的機理研究、疾病的防治以及抗病毒藥物的研制開發(fā)。4.4理論模型的應用由于酵母是一種較低等的生物,蛋白質的翻譯后修飾(糖基化、二硫鍵的形成等)程度很低。因此,要進一步研究蛋白產物的生物學功能,還必須建立高等生物體系的雙雜交系統(tǒng)。近幾年來已建立了哺乳動物雙雜交系統(tǒng),該系統(tǒng)可選擇多種細胞系研究蛋白間相互作用,蛋白質接近其自然狀態(tài),翻譯后修飾,如糖基化,磷酸化,甲基化保持較好。目前,哺乳動物雙雜交系統(tǒng)采用單純皰疹病毒VPl6的AD區(qū)段。用氯霉素乙酰轉移酶為報告基因,其活性可以在細胞提取物中檢測。典型的實驗是將編碼誘餌蛋白和獵物蛋白的基因克隆到相應的載體上,采用磷酸鈣共沉淀轉化入Hela等哺乳動物細胞培養(yǎng),當誘餌蛋白和獵物蛋白發(fā)生相互作用時,可以轉錄,通過對報道基因的表達產物檢測,可以顯示出誘餌蛋白和獵物蛋白的相互作用水平。目前,該方法主要用于檢驗已知蛋白的相互作用。4白結構與功能研究對蛋白質聯系圖譜的設計雙雜交系統(tǒng)自問世以來,該技術已成為研究蛋白相互作用、蛋白結構與功能的重要手段,已廣泛應用于研究蛋白——蛋白間的相互作用、蛋白與其它分子相互作用、篩選未知蛋白、研究蛋白的功能等領域,繪制蛋白質聯系圖譜,在藥物設計等許多方面。4.1蛋白質間相互作用的篩選酵母雙雜交系統(tǒng)具有相對簡便、快速及不經蛋白質純化即可相接獲得編碼基因的特點,采用雙雜交系統(tǒng)從cDNA文庫和基因文庫中直接篩選出蛋白質間相互作用,鑒定的各種受體、轉錄因子、蛋白激酶、磷酸化酶、細胞骨架蛋白以及參與細胞周期調控、腫瘤發(fā)生的蛋白質。另外,也可作為研究已知基因的新功能或多個篩選到的已知基因之間功能相關的主要方法。主要應用于:①驗證通過其他方法發(fā)現的蛋白質間可能的相互作用;②確定蛋白質特異相互作用的關鍵結構域和氨基酸;③篩選文庫以得到與已知蛋白質存在特異相互作用的蛋白質。4.2確定致病菌毒力酵母雙雜交的報告基因能否表達在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對于能夠引發(fā)疾病反應的蛋白相互作用可以采取藥物干擾的方法,阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的。在闡明感染性疾病的發(fā)病機制,制備和設計新的疫苗和藥物,實現有效的預防與治療方面有著重要的應用價值。目前主要集中在以下幾方面:①確定致病菌毒力;②尋找新的診斷標志物;③為疫苗的研制尋找新的候選抗原;④闡明藥物抗菌作用機制與病菌耐藥性發(fā)生機理,為新的抗生素篩選提供更合理的靶