熒光光譜法在藥物分析中的應(yīng)用

熒光光譜法在藥物分析中的應(yīng)用

1熒光分析方法通常的藥物分析方法包括重量分析、壓力法、色度法、薄色度法、離子交換法、液相色譜法、高效液相色譜法、固相微萃取、高效毛細(xì)管電泳等。分光分析的優(yōu)點(diǎn)（包括紅外和紫外分光光度法、分光光譜法、化學(xué)發(fā)光法、磷光分析法、原子吸收光譜法、質(zhì)量光譜法、共振光散射法等）。[11,12,13,14,15,16,17,18]。和電鉻法具有高靈敏度、選擇性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。該方法已在藥物分析、藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究、臨床醫(yī)學(xué)與療效分析等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。常規(guī)熒光分析法最早被應(yīng)用于分析抗瘧疾藥物奎寧.隨著熒光分析法的發(fā)展,其應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大,被廣泛用于抗菌素藥物、止痛藥、鎮(zhèn)靜劑、止血藥等的分析,涉及合成藥物、生物藥物和天然藥物.由于自身具有發(fā)射熒光特性的物質(zhì)相對(duì)較少,并且受到拉曼峰和散射光等背景的干擾,常規(guī)熒光分析法在藥物分析中的應(yīng)用受到限制.為使熒光分析法的應(yīng)用更加廣泛,發(fā)展了各類(lèi)熒光分析方法,如對(duì)不發(fā)熒光的物質(zhì)可通過(guò)某類(lèi)化學(xué)反應(yīng)使其轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合測(cè)定的熒光物質(zhì),對(duì)熒光較弱的物質(zhì)可采取熒光增敏分析法.近年來(lái),還發(fā)展了各種新型熒光分析技術(shù),如激光誘導(dǎo)熒光法、同步熒光法、導(dǎo)數(shù)熒光法、熒光探針?lè)?、光化學(xué)熒光法、時(shí)間分辨熒光法、三維熒光法、偏振熒光法、熒光免疫測(cè)定法、熒光成像技術(shù)、熒光光纖傳感器等.這些技術(shù)的應(yīng)用加速了各種新型熒光分析儀器的研制,使熒光分析不斷朝著高效、痕量、微觀和自動(dòng)化方向發(fā)展.2一般光度法的光度分析2.1直接熒光分析方法直接熒光分析法適用于自身能產(chǎn)生熒光的藥物.因熒光性質(zhì)與溶液的pH值有關(guān),故熒光強(qiáng)度的測(cè)定需在適宜的pH緩沖溶液中進(jìn)行.對(duì)于成分復(fù)雜的生物供試品,為了防止干擾,有時(shí)需利用萃取、沉淀、色譜分離等方法除去干擾物,以降低熒光空白本底,提高分析靈敏度.已用于直接熒光分析法的藥物有鹽酸洛哌丁胺、雙水楊酯、左旋溶肉瘤素、葉酸等.2.2表面活性劑的合成膠束增敏熒光分析法是在膠束溶液中進(jìn)行的熒光分析法.膠束溶液對(duì)極性較小的弱熒光物質(zhì)有增溶作用,對(duì)熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射有增敏增穩(wěn)作用;因此,對(duì)某些不發(fā)熒光或熒光很弱的藥物無(wú)法進(jìn)行直接熒光分析法測(cè)定時(shí),可通過(guò)加入某些增溶增敏試劑來(lái)增強(qiáng)藥物的熒光,提高藥物分析的靈敏度,如加入CTMAB,SDS,CPB,PVA,TritonX-100,Brij-35等表面活性劑及環(huán)糊精(α-CD,β-CD,γ-CD).由于主客體分子的結(jié)構(gòu)特征,以及溫度、表面電荷及其它分子和離子等所形成的微環(huán)境,有利于形成膠束,膠束的存在,大大降低了熒光分子的非輻射過(guò)程速率,而輻射速率常數(shù)改變不大;因此,量子效率增加,激發(fā)光壽命增長(zhǎng),客體分子穿入、吸附和包絡(luò)于膠束內(nèi)外,使其行動(dòng)受到限制,客體分子有效吸光面積、摩爾吸光系數(shù)增加,其激發(fā)態(tài)也不易被溶液中的熒光熄滅體碰撞而獲得保護(hù),從而熒光增強(qiáng).馬紅燕等用膠束增敏熒光光度法對(duì)土霉素的測(cè)定作了研究.梁麗華等用膠束增敏熒光法測(cè)定吡哌酸的含量.潘祖亭等利用表面活性劑、β-CD對(duì)藥物熒光進(jìn)行增敏作用,研究了左炔諾孕酮、醋酸甲萘氫醌、鹽酸蘆氟沙星、醋酸潑尼松龍、雙嘧達(dá)莫、吲哚美辛等的熒光光譜.劉秀萍等用競(jìng)爭(zhēng)熒光包合法研究了維生素B6、β-環(huán)糊精及其衍生物的包合性能.2.3其他有熒光藥物反應(yīng)化學(xué)引導(dǎo)熒光分析法是利用化學(xué)反應(yīng)(氧化還原反應(yīng)、絡(luò)合反應(yīng)、光化反應(yīng)、化學(xué)衍生、顏色反應(yīng)等)改變藥物的熒光特性,使藥物產(chǎn)生熒光或提高其熒光強(qiáng)度.潘祖亭等利用濃硫酸與無(wú)熒光藥物作用后產(chǎn)生有熒光的物質(zhì)研究了醋酸甲地孕酮、丙酸睪酮.Gonzalez-BarreiroC等用高效液相色譜分離、光化學(xué)誘導(dǎo)熒光檢測(cè)了一些廢水中的中性和酸性藥物.Al-MajedAA等利用藥物凈他敏與混合酸酐反應(yīng)產(chǎn)生的強(qiáng)熒光對(duì)藥劑和人體血漿中凈他敏進(jìn)行了熒光分析,檢出限約1.5×10-10mol/L.HefnawyM等利用熒光胺與藥物反應(yīng)對(duì)頭孢克洛、頭孢羥氨芐、頭孢氨芐和頭孢握定進(jìn)行了分析測(cè)定.2.4熒光探針研究以稀土離子、熒光分子等和藥物作用的熒光探針技術(shù),大大拓寬了熒光分析法在藥物分析中的應(yīng)用范圍,顯著提高了熒光分析的靈敏度和選擇性.對(duì)熒光探針研究已有綜述.凌連生等綜述了脫氧核糖核酸(DNA)熒光探針的研究進(jìn)展.林章碧等綜述了以納米粒子作為熒光探針在生物分析中的應(yīng)用.王磊等以鋱離子作為熒光探針測(cè)定了尿樣中痕量的環(huán)丙氟哌酸.趙長(zhǎng)春等研究了小蘗堿的特殊的熒光性質(zhì).王敏等用熒光探針?lè)治龇ㄑ芯苛丝s氨基硫脲類(lèi)鈀抗癌配合物的初步篩選與作用機(jī)理.2.5苦參堿與熒光熒光研究對(duì)有些藥物可利用其對(duì)某一特定體系的熒光猝滅作用而進(jìn)行定量測(cè)定.龐志功等利用苦參堿和氧化苦參堿對(duì)熒光試劑乙酸乙烯酯的定量猝滅作用,建立了測(cè)定苦參堿和氧化苦參堿的熒光分析方法.杜黎明等研究了氯苯胺酸與洛美沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星發(fā)生的荷移反應(yīng),并對(duì)這4種藥物進(jìn)行了定量分析.此外,熒光猝滅法還用于分析羥基苯丙酮酸、甲硝唑等藥物的含量.2.6一些新型光學(xué)分析技術(shù)2.6.1導(dǎo)數(shù)熒光分析導(dǎo)數(shù)熒光分析的特點(diǎn)是,以熒光強(qiáng)度對(duì)波長(zhǎng)的導(dǎo)數(shù)dF/dλ代替熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)記錄熒光發(fā)射光譜,此光譜稱(chēng)為一階導(dǎo)數(shù)熒光光譜.若以d2F/d2λ代替F記錄熒光發(fā)射光譜,則稱(chēng)為二階導(dǎo)數(shù)熒光光譜,依此可得到其他高階導(dǎo)數(shù)熒光光譜.利用導(dǎo)數(shù)熒光光譜法進(jìn)行物質(zhì)測(cè)定的方法稱(chēng)為導(dǎo)數(shù)熒光分析.導(dǎo)數(shù)熒光分析可以提高光譜精細(xì)結(jié)構(gòu)的分辨能力,減小光譜干擾;所以,導(dǎo)數(shù)熒光分析的抗干擾能力強(qiáng),應(yīng)用于多組分混合物分析可不經(jīng)分離而直接進(jìn)行熒光測(cè)定.該方法已用于維生素B、氧氟沙星對(duì)映體、環(huán)丙沙星等藥物的定量測(cè)定.2.6.2同步熒光分析方法當(dāng)一些化合物的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)存在比較大的差距時(shí),應(yīng)用同步熒光技術(shù)能有效降低散射峰的干擾.同時(shí),對(duì)激發(fā)和發(fā)射光譜同步掃描,對(duì)描出的圖譜進(jìn)行微分處理,使重疊的峰彼此分離,可得到較可靠的測(cè)量結(jié)果.同步熒光分析法與導(dǎo)數(shù)熒光分析法聯(lián)用能取得較高的靈敏度,如用同步-導(dǎo)數(shù)熒光光譜法測(cè)定尿樣中的痕量左氧氟沙星和洛美沙星,檢出限分別可達(dá)0.3,0.35mg/L.JoseAntonioMurilloPulgarin等用可變角同步熒光法測(cè)定了幾種熒光相近的混合藥物.2.7藥物分析技術(shù).藥物分析學(xué)科.在現(xiàn)代分析化學(xué)技術(shù)中,聯(lián)用技術(shù)大大提高了分析檢測(cè)的效率和效果,其中發(fā)展較快、使用較多的有色譜-熒光檢測(cè)技術(shù)和流動(dòng)注射-熒光檢測(cè)技術(shù)等.多種分析技術(shù)的聯(lián)用,使分析方法的連續(xù)化、自動(dòng)化、最優(yōu)化和智能化特征成為藥物分析學(xué)科發(fā)展的必然趨勢(shì).3藥物小分子與生物大分子的相互作用3.1藥物與蛋白質(zhì)的相互作用研究小分子與生物大分子之間的相互作用,特別是具有生物活性的藥物小分子與生物大分子的相互作用,有助于了解藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布情況,對(duì)闡明藥物的作用機(jī)制、藥代動(dòng)力學(xué)及藥物的毒副作用有重要意義.藥物從給藥部位進(jìn)入血液,其中一部分可能與血漿中的蛋白質(zhì)(主要為白蛋白)發(fā)生可逆的結(jié)合,結(jié)合的部分稱(chēng)為結(jié)合型藥物,未結(jié)合的部分稱(chēng)為游離型藥物,當(dāng)游離型藥物濃度降低時(shí),部分結(jié)合型藥物解離為游離型,二者處于動(dòng)態(tài)平衡.只有游離型藥物可透過(guò)血壁分布到作用部位與受體發(fā)揮作用,絕大多數(shù)藥物也只有游離型可被機(jī)體代謝和排泄.藥物的這種與蛋白可逆型結(jié)合不僅影響其代謝動(dòng)力學(xué)(作用強(qiáng)度與時(shí)間),而且往往與藥物的相互作用、作用機(jī)理等密切相關(guān),所以引起人們?cè)絹?lái)越多的注意和研究.藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合后能改變藥物或蛋白質(zhì)的吸收光譜性質(zhì),如吸收光譜的改變、吸收強(qiáng)度的改變、新吸收峰的出現(xiàn)等,都可以提供藥物與蛋白質(zhì)相互作用的信息.研究藥物分子與受體之間的關(guān)系,也可為藥物分子結(jié)構(gòu)的改造及合成療效更好、毒性更低的藥物提供信息.YuriVIl’ichev等研究了赭曲霉素與人血清白蛋白的相互作用,以及相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、赭曲霉素和其他酸性化合物與蛋白質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合.潘祖亭等應(yīng)用熒光光譜法和紫外-可見(jiàn)吸收光譜法研究了雙嘧達(dá)莫、鹽酸多西環(huán)素、甲苯咪唑等藥物與牛血清白蛋白的結(jié)合反應(yīng),并根據(jù)F?ster理論模型計(jì)算出給體與受體間的結(jié)合距離和一些物理化學(xué)、熱力學(xué)參數(shù),為研究藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合作用提供了借鑒.PurcellM研究了藥物與人血清白蛋白之間的作用,得出它們之間的鍵合常數(shù)及鍵合位點(diǎn)數(shù).AnnaSulkowska研究了抗甲腺藥物與人血清和牛血清白蛋白的結(jié)合情況.RibouAC用熒光探針和熒光光譜技術(shù)研究了牛血清白蛋白和乙二胺四乙酸、鈣離子對(duì)體系的影響.崔鳳靈等用熒光光譜法研究了氨基硫脲的衍生物與蛋白質(zhì)結(jié)合的機(jī)理.3.2種藥物與dna的作用方式DNA和核糖核酸(RNA)是重要的遺傳物質(zhì),也是某些藥物作用的靶分子,研究NDA和RNA與小分子熒光探針及藥物的相互作用有重要意義.應(yīng)用熒光光譜法和紫外-可見(jiàn)吸收光譜法研究藥物與DNA相互作用的主要依據(jù)是,藥物與DNA作用后吸收光譜和熒光光譜發(fā)生了變化.但與蛋白質(zhì)不同的是,DNA的吸收波長(zhǎng)在260nm,而其熒光很弱,直接利用熒光光譜法研究藥物與DNA的相互作用受到一定的限制;因此,在用熒光光譜法研究藥物與DNA相互作用時(shí),一般要利用與之相互作用的藥物的自身熒光,或者利用熒光探針試劑與DNA作用后產(chǎn)生的熒光.DNA與小分子化合物的作用方式有3種(見(jiàn)圖1).第1種是靜電作用,此作用沿著DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的外壁,沒(méi)有選擇性,且受到溶液中離子強(qiáng)度的影響較大;第2種是小分子與DNA溝槽的相互作用;第3種是嵌入作用.后2種作用方式具有選擇性,是該研究領(lǐng)域的重點(diǎn).核酸分子與小分子化合物作用的3種方式各有不同的特點(diǎn),在紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜上表示出不同的光譜信息.若藥物本身有熒光,當(dāng)與DNA發(fā)生某種形式的作用后,其熒光光譜發(fā)生了變化.阿霉素、柔紅霉素、喜樹(shù)堿等就是具有這種性質(zhì)的藥物,其作用模型可由Scatchard方程描述.當(dāng)核酸上可與藥物結(jié)合的結(jié)合點(diǎn)為同一類(lèi)型且相互獨(dú)立時(shí),藥物與DNA的結(jié)合過(guò)程可簡(jiǎn)單地用質(zhì)量作用定律來(lái)描述:K=r/[c(n-r)],r/c=K(n-r).(3)其中:K為結(jié)合常數(shù);c為游離藥物的物質(zhì)的量濃度;r為每一個(gè)核苷酸上已結(jié)合的藥物的分子個(gè)數(shù);n為每個(gè)核苷酸上能結(jié)合的核苷酸的分子數(shù).若以r/c對(duì)r作圖,可得到一條直線(xiàn),直線(xiàn)的斜率為K,截距為Kn.根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖,按所得的斜率和截距可計(jì)算出藥物與DNA的穩(wěn)定常數(shù)K及每個(gè)核苷酸可結(jié)合的藥物的分子數(shù).藥物與DNA的作用方式可通過(guò)離子強(qiáng)度對(duì)結(jié)合常數(shù)K的影響情況來(lái)判斷.若Na+濃度的增加對(duì)藥物與DNA的作用影響較大,K和n均會(huì)發(fā)生變化,則藥物與DNA的作用主要表現(xiàn)為靜電力作用;若藥物與DNA相互作用的結(jié)合常數(shù)不受Na+濃度影響,則藥物與DNA的作用主要為嵌入作用.若藥物本身沒(méi)有熒光,與DNA的作用可用溴化乙錠(EB)、噻唑橙二聚體、唑黃二聚體等熒光探針來(lái)研究.EB是檢測(cè)雙鏈DNA的靈敏探針試劑.當(dāng)向EB中加入DNA后,體系的吸光度降低,最大吸收峰紅移,這是EB峰值的平面菲羅啉環(huán)嵌入DNA堆積的堿基對(duì)之間所致.當(dāng)向EB-DNA體系中加入藥物后,若EB的最大吸收峰值增加,且EB紅移后的吸收峰是向原位(紫外)回復(fù),則可證明藥物的存在破壞了DNA與EB之間的嵌入作用,EB又游離出來(lái);如果作用不強(qiáng),影響不大,就需借助其他方法作進(jìn)一步判斷.核酸是當(dāng)代新藥發(fā)展的首選目標(biāo).李志良等將熒光法用于抗癌藥物的初步篩選.唐宏武等根據(jù)吖啶橙可穿過(guò)完整的細(xì)胞膜并能用于細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA染色的特點(diǎn),提出一種新的抗癌藥物的篩選方法.GOPALM等利用紫外吸收光譜法、熒光光譜法研究了一種抗癌新藥與DNA的作用.袁小英等用熒光法研究了環(huán)丙沙星與小牛胸腺DNA的結(jié)合反應(yīng),并利用所測(cè)的結(jié)合常數(shù)研究了銅(Ⅱ)對(duì)環(huán)丙沙星和DNA相互作用的影響及其可能的機(jī)理.此外,如金屬離子及其對(duì)藥物與DNA作用的影響,順鉑