青蒿琥酯和雷帕霉素對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的緩解作用

青蒿琥酯和雷帕霉素對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的緩解作用

蠕蟲炎是一種慢性、進(jìn)展性和系統(tǒng)性疾病，主要是滑膜炎，其早期癥狀是滑膜炎，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨骼的損傷，導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形和運(yùn)動的受限。滑膜炎的出現(xiàn)與滑膜細(xì)胞增生和血管痙攣有關(guān)。它的機(jī)制是分泌大量激素，并釋放各種基本金屬酶。雖然ra的病因尚不清楚，但在過去60年中，使用緩解癥狀的抗生素藥物（mdark）治療后，ra的治療效果明顯，副作用明顯，無法治愈。隨著英偉單抗（infelticiab）和阿達(dá)穆單銀（adalimmab）等腫瘤壞死因素的uf061（tnfuf061）單克隆抗體得到認(rèn)可，大多數(shù)接受治療的ra患者的病情有所改善，關(guān)節(jié)損傷程度也有所減輕。然而，根據(jù)臨床數(shù)據(jù)，tnf061單一抗抗劑的有效治療效果非常差。同時(shí)，tnf061失去了活力，干擾了身體的正常免疫防御功能，增加了患者受到病原體感染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，tnf061的有效治療不能修復(fù)關(guān)節(jié)和愈合損傷。因此，為了為不接受tnf61抗炎劑的患者提供更多的治療方法，有必要開發(fā)基于發(fā)病機(jī)制的ra治療藥物。由于RA初期的滑膜血管新生和細(xì)胞增殖類似于腫瘤的部分特征,因此預(yù)期細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑對阻止滑膜增生有效.Hultqvist等人用活性氧(ROS)誘導(dǎo)劑植醇治療佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROS發(fā)生增強(qiáng),自身免疫應(yīng)答減弱,可同時(shí)改善關(guān)節(jié)炎的急性期及慢性期癥狀.同樣,考慮到青蒿琥酯能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5~7],有理由將其用作抗RA藥物.Xu等人發(fā)現(xiàn),青蒿琥酯可通過阻斷NF-uf06bB和P13激酶/Akt信號通路抑制RA患者纖維母細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增殖.He等人也證明青蒿琥酯能下調(diào)與血管形成有關(guān)的缺氧誘導(dǎo)因子-1uf061(HIF-1uf061)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá).另一種青蒿素衍生物SM905被Wang等人證實(shí)能通過阻遏炎癥反應(yīng)及Th17應(yīng)答使DBA/1小鼠關(guān)節(jié)炎明顯好轉(zhuǎn).上述結(jié)果表明,青蒿琥酯不僅能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制滑膜炎發(fā)作,而且還能以非細(xì)胞凋亡方式發(fā)揮其抗炎作用.另一方面,哺乳類雷帕霉素靶點(diǎn)(mTOR)在多種癌癥中均被發(fā)現(xiàn)活性上調(diào)[11~13],而mTOR抑制劑雷帕霉素(sirolimus或everolimus)可用于晚期視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、難治性套細(xì)胞淋巴瘤、進(jìn)展性晚期神經(jīng)內(nèi)分泌瘤治療[14~16].由此推測,雷帕霉素對關(guān)節(jié)炎也應(yīng)當(dāng)有效.Glantschnig等人發(fā)現(xiàn),sirolimus在離體條件下能防止關(guān)節(jié)骨骼消融,其機(jī)理是抑制破骨細(xì)胞中S6蛋白、S6激酶和4E-BP1的磷酸化.Kneissel等人報(bào)道,通過抑制cathepsinK表達(dá)及成骨細(xì)胞活性,everolimus可阻斷卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)骨骼成分丟失.Laragione等人發(fā)現(xiàn),雷帕霉素通過降低mTOR及其底物p70S6K1和4EBP的磷酸化,可減少降植烷誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎中纖維母細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞對關(guān)節(jié)軟骨及骨骼的侵蝕.Cejka等人也報(bào)道,在患有慢性炎癥性及破壞性關(guān)節(jié)炎的轉(zhuǎn)人TNFuf061基因小鼠中,sirolimus或everolimus可下調(diào)消化酶類表達(dá)及促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡,借此減少滑膜破骨細(xì)胞形成,并保護(hù)關(guān)節(jié)避免骨骼侵蝕和軟骨損失.盡管Nagy曾推測一氧化氮(NO)可能是RA的關(guān)鍵致病因素,但迄今對于NO如何誘導(dǎo)RA仍然一無所知,而且以往闡述的青蒿琥酯及雷帕霉素治療機(jī)理從未涉及對NO的抑制作用.為了探討RA的發(fā)病原因并闡明青蒿琥酯和雷帕霉素的抗RA機(jī)理,本研究通過小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射完全弗氏佐劑(CFA)建立了完全模擬膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)的CFA誘導(dǎo)急性關(guān)節(jié)炎(CIAA)模型,并利用此模型初步驗(yàn)證“NO爆發(fā)性缺氧誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎”的假說,由此證實(shí)NO在實(shí)驗(yàn)性RA造模中的關(guān)鍵作用.本研究得出的有關(guān)青蒿琥酯和雷帕霉素抗關(guān)節(jié)滑膜炎的實(shí)驗(yàn)動物活體藥理評價(jià)結(jié)果,將為未來進(jìn)一步開展新的非抗體類RA治療藥物的臨床試驗(yàn)打下良好的基礎(chǔ).1材料和方法1.1cea模型的建立SPF級昆明小鼠(7~8周齡,雌雄各半,體重20~22g)由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查批準(zhǔn)(許可證編號:SPF-2011C007).在CIA模型制備中,將膠原Ⅱ(CⅡ,購自Sigma-Aldrich)溶于0.1mol/L乙酸中.在CⅡ溶液中加入等體積CFA(Sigma-Aldrich)溶液乳化.取CⅡ-CFA乳化液于小鼠尾基部皮下多點(diǎn)注射,并在初次免疫后3周用相同CⅡ-CFA混合液加強(qiáng)免疫1次.為建立CIAA模型,將CFA溶液(2mg/mL)直接注射于小鼠后腿單側(cè)踝關(guān)節(jié)腔內(nèi).炎癥程度分級采用0~4分制:0=正常;1=一趾或多趾紅腫;2=自踝關(guān)節(jié)至中爪(跗骨)發(fā)紅并中度腫脹;3=自踝關(guān)節(jié)至中跗骨關(guān)節(jié)發(fā)紅并重度腫脹;4=踝、爪、趾全部紅腫,關(guān)節(jié)變形和僵硬.1.2雙蒸水注射注射用硝普鈉(SNP)粉劑(北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限公司)、NG-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA)(碧云天生物技術(shù)研究所)均溶于無菌雙蒸水中,并過濾除菌,用于踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射給藥;青蒿琥酯(桂林南藥股份有限公司)用5%碳酸氫鈉配制,過濾除菌,現(xiàn)配現(xiàn)用,為肌肉注射給藥.雷帕霉素(LCLaboratories)用無水乙醇配制,為肌肉注射給藥.1.3血清no、la、spo2值的測定血清NO(NO3-/NO2-)含量及LA含量測定均使用國產(chǎn)試劑盒(南京建成生物工程研究所),并按廠家提供的說明書操作.將全血與生理鹽水等體積混合,于8000r/min離心10min,反應(yīng)完畢后,在550nm波長處測定反應(yīng)液的光吸收值(A550),根據(jù)下式計(jì)算血清NO濃度:NO(uf06dmol/L)=(A550測定管-A550空白管/A550標(biāo)準(zhǔn)管-A550空白管)×C標(biāo)準(zhǔn)管(20uf06dmol/L)×稀釋倍數(shù).將全血與0.6mL蛋白質(zhì)沉淀劑混合,于4000r/min離心8min,反應(yīng)完畢后,在530nm波長處測定反應(yīng)液的光吸收值(A530),由下式計(jì)算血清LA濃度:LA(mmol/L)=(A530測定管-A530空白管/A530標(biāo)準(zhǔn)管-A530空白管)×C標(biāo)準(zhǔn)管(3mmol/L)×稀釋倍數(shù).采用國產(chǎn)便攜式血氧儀(北京超思電子有限公司)測定關(guān)節(jié)部位的SpO2值,將待測小鼠單腿置于測定槽,將膝關(guān)節(jié)對準(zhǔn)光線射出孔,記錄LED屏上顯示的讀數(shù),即為SpO2(%).1.4半定量分析將福爾馬林固定和石蠟包埋關(guān)節(jié)組織(含滑膜及軟骨)切成3uf06dm薄片,用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、蒸餾水洗滌.經(jīng)蘇木精染色后,用1%酸性乙醇分化、1%氨水返藍(lán)、95%乙醇沖洗.伊紅染色后,經(jīng)梯度乙醇脫水和二甲苯清洗,用含二甲苯的封片液封片.在裝備照相機(jī)的顯微鏡下,采用非數(shù)值計(jì)分系統(tǒng)對組化染色切片進(jìn)行半定量分析:0,+,++,+++,++++分別表示正常、滑膜增生、滑膜下組織纖維化、淋巴浸潤、關(guān)節(jié)損傷.將石蠟切片與3%H2O2在室溫下共育,以抑制內(nèi)源性過氧化物酶,然后用煮沸的檸檬酸修片.經(jīng)磷酸緩沖液(PBS)洗滌后,用2%牛血清白蛋白(BSA)封片,再與1:100稀釋的一抗在37℃下保溫1h.將玻片用PBS洗滌后,與生物素化二抗在37℃下保溫20min,再用PBS洗滌,與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)保溫1~5min.先用自來水沖洗,再用蘇木精復(fù)染.經(jīng)脫水、清洗和封片后,用配置OLYMUPUSBX-51數(shù)碼相機(jī)的MIAS顯微圖像分析系統(tǒng)(北京炳洋)進(jìn)行免疫組化分析,由下式計(jì)算結(jié)果:免疫組化強(qiáng)度=陽性目標(biāo)總面積/統(tǒng)計(jì)場總面積(面密度)×陽性目標(biāo)的陽性單位(PU).1.5pcr芯片分析炎癥相關(guān)細(xì)胞因子抗體芯片分析及缺氧響應(yīng)基因PCR芯片分析由上?？党缮锕こ逃邢薰緟f(xié)作完成.抗體芯片分析采用RayBio?MouseCytokineAntibodyArray試劑盒,步驟包括:蛋白質(zhì)抽提、蛋白質(zhì)定量、細(xì)胞因子檢測(封閉和孵育、檢測、圖像和數(shù)據(jù)采集).PCR芯片分析采用RT2ProfilerTMPCRArrayMouseHypoxiaSignalingPathway試劑盒,步驟包括:RNA抽提、DNA酶Ⅰ消化、RNA純化、RNA質(zhì)量檢測、cDNA合成、實(shí)時(shí)定量PCR、數(shù)據(jù)分析.1.6測試結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析除非特別指明,用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的數(shù)據(jù)均來自實(shí)驗(yàn)分組(n=3)內(nèi)測定結(jié)果的均值±標(biāo)準(zhǔn)差抗體芯片及PCR芯片數(shù)據(jù)僅為單個(gè)樣品的分析結(jié)果.全部數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用SPSS10.0(Windows版)軟件進(jìn)行分析.2結(jié)果2.1csa和csa在小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射c-fps、c、f、f-b模型中的表達(dá)經(jīng)肌內(nèi)注射CⅡ-CFA建立的經(jīng)典CIA小鼠模型,其炎癥表型是腿部、足部和腳趾出現(xiàn)肉眼可辨的紅腫現(xiàn)象(圖1A),在組織病理學(xué)圖譜上可見明顯的滑膜細(xì)胞增生和淋巴細(xì)胞浸潤(圖1B).相應(yīng)地,經(jīng)關(guān)節(jié)內(nèi)注射CⅡ-CFA或CFA建立的CIAA模型也顯示出與CIA模型相類似的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)損傷(圖1C~F).從圖中可以看出,經(jīng)CⅡ-CFA或CFA注射后,踝關(guān)節(jié)部位的腫脹程度較明顯,單爪的炎癥計(jì)分可達(dá)3分(整個(gè)腿部重度紅腫),而且其組織損傷程度也已達(dá)到+++級(滑膜增生和炎性浸潤).經(jīng)典的CIA模型是將CⅡ-CFA點(diǎn)狀注射于小鼠尾根部,造模時(shí)間長達(dá)28天.利用關(guān)節(jié)內(nèi)注射CⅡ-CFA或CFA進(jìn)行造模只需3天,令造模時(shí)間大大縮短.同時(shí),大規(guī)模CⅡ-CFA造模組(n=15)或CFA造模組(n=15)的造模成功率高達(dá)100%,表明本研究建立的CIAA造模方法代表了目前最快捷、最有效的小鼠早期RA造模方法之一.為闡明關(guān)節(jié)發(fā)炎與免疫激活的相關(guān)性,在CFA免疫前后分別對血清中的細(xì)胞因子進(jìn)行了抗體芯片分析(表1).結(jié)果顯示,CIAA小鼠與對照小鼠相比,在所測定的全部40種細(xì)胞因子中,共有31種細(xì)胞因子上調(diào),其中幾種關(guān)鍵的促炎癥細(xì)胞因子均顯著上調(diào),包括IL-6(2.78倍),MIP-1uf061(2.59倍),TNFuf061(2.24倍),GM-CSF(1.92倍),GCSF(1.76倍),INFuf067(1.5倍),IL-1uf062(1.46倍),MCSF(1.39倍).以上結(jié)果表明,小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射CFA可以廣泛激活促炎癥細(xì)胞因子,進(jìn)而開啟后續(xù)炎癥應(yīng)答事件.因此,CFA誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的第一步是全身性免疫激活.2.2fps性免疫反應(yīng)對pahss-rendth小鼠血清no、spo2、spo2水平的影響為闡明免疫激發(fā)與組織供氧的關(guān)系及其NO在其中所起的作用,對血清中的NO及關(guān)節(jié)部位的SpO2進(jìn)行了連續(xù)跟蹤測定.結(jié)果顯示,在關(guān)節(jié)內(nèi)注射CFA之后的第一天即可測到NO釋放入血,第二天出現(xiàn)NO劇烈爆發(fā)而形成NO峰,第三天NO峰值開始下降.CIAA小鼠與對照小鼠血清NO水平的最大差異接近2倍(圖2A).相應(yīng)地,在CFA注射后還可同步出現(xiàn)SpO2的下降,對照小鼠中SpO2的最大值高于80%,而CIAA小鼠中SpO2的最小值低于60%(圖2B).由此可見,NO升高可導(dǎo)致SpO2下降,暗示NO與SpO2呈反相關(guān).換言之,CIAA造模過程中CFA免疫激發(fā)產(chǎn)生的NO可能直接導(dǎo)致關(guān)節(jié)部位供氧不足及滑膜組織缺氧.2.3不同免疫組化對血管la對CIAA小鼠滑膜組織中的HIF-1uf061和VEGF進(jìn)行了免疫組化定量測定.結(jié)果顯示,HIF-1uf061和VEGF均在CFA免疫后出現(xiàn)不同程度的上調(diào),HIF-1uf061比VEGF的免疫組化染色強(qiáng)度更高(圖3A和B).在滑膜組織中,還可清晰地見到血管新生現(xiàn)象(圖3C).這一結(jié)果表明,CFA免疫激發(fā)的NO通過誘導(dǎo)滑膜缺氧可上調(diào)HIF-1uf061和VEGF表達(dá),而HIF-1uf061與VEGF的激活即可啟動滑膜組織的血管新生過程.作為重要的缺氧指標(biāo)之一,血清LA水平也在CFA注射的第一天起出現(xiàn)輕微升高,隨后不斷下降(圖3D).由此推測,因NO爆發(fā)性缺氧引起的無氧代謝致使LA出現(xiàn)短暫升高,由此誘導(dǎo)HIF-1uf061和VEGF表達(dá)及新生血管大量形成.隨著新血管的形成及供氧狀況的改善,無氧代謝活動受到抑制,于是血清LA水平隨之持續(xù)下降.2.4no在關(guān)節(jié)滑膜炎中的應(yīng)用為進(jìn)一步確認(rèn)NO就是關(guān)節(jié)滑膜炎的啟動因素,利用NO供體化合物SNP注射小鼠關(guān)節(jié)腔,并在連續(xù)注射3天后觀察關(guān)節(jié)腫脹情況,并與關(guān)節(jié)內(nèi)注射CⅡ-CFA及SNP+CⅡ-CFA的小鼠進(jìn)行比較.結(jié)果顯示,SNP能模擬CIAA小鼠的關(guān)節(jié)炎癥表型,單爪的炎癥程度可計(jì)2分,比2mg/mL及200uf06dg/mLCⅡ-CFA處理誘導(dǎo)的炎癥(計(jì)3分)稍低,但高于20uf06dg/mLCⅡ-CFA處理誘導(dǎo)的炎癥(僅計(jì)1分).在相同濃度下,SNP+CⅡ-CFA合并處理與CⅡ-CFA單獨(dú)處理的炎癥計(jì)分無明顯差異,可能原因是SNP+CⅡ-CFA與CⅡ-CFA的注射量均為200uf06dL,合用時(shí)CⅡ-CFA濃度已減半(圖4).以上結(jié)果顯示,無論NO的來源如何,它都扮演著啟動關(guān)節(jié)滑膜炎的關(guān)鍵角色.為從反面證實(shí)NO在關(guān)節(jié)滑膜炎中的啟動作用,用NO合成抑制劑L-NMMA與CFA聯(lián)合注射后,觀察了小鼠關(guān)節(jié)部位的腫脹情況.結(jié)果表明,不同劑量及不同部位(左后腿或右后腿)注射CFA均可引起關(guān)節(jié)腫脹,而且炎癥程度較高(計(jì)3分)(圖5A~C).若注射CFA又同時(shí)注射L-NMMA,則不出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)腫脹(圖5D和E).但是,在兩條后腿的踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)均注射CFA,而僅在一條后腿的踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射L-NMMA,還是會在兩條后腿上出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹,只不過注射L-NMMA者腫脹較輕微(圖5F).對各小鼠關(guān)節(jié)部位的SpO2測定結(jié)果表明,CFA注射后關(guān)節(jié)部位對應(yīng)于較低的SpO2值,而CFA+L-NMMA注射后關(guān)節(jié)部位對應(yīng)于較高的SpO2值(表2),表明L-NMMA可以通過抑制NO合成而改善關(guān)節(jié)部位的供氧狀況,從而緩解關(guān)節(jié)滑膜炎癥狀.2.5血清炎癥基因表達(dá)水平滑膜細(xì)胞缺氧信號基因表達(dá)PCR芯片分析表明,CⅡ-CFA及CⅡ-CFA+SNP均能上調(diào)NOS2基因表達(dá)(2~4倍),而SNP下調(diào)NOS2基因表達(dá)(3倍),表明SNP釋放的NO對NOS2基因有阻遏作用.同時(shí),無論CⅡ-CFA誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源NO或SNP釋放的外源NO,均能上調(diào)免疫應(yīng)答基因的表達(dá),這些基因包括IL-1a,IL-6,NOTCH1基因等(表3).這些結(jié)果與前述CⅡ-CFA注射上調(diào)促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的抗體芯片分析結(jié)果相吻合.由上表還可見,缺氧響應(yīng)基因(ANGPTL4,ARNT2,CREBBP,EP300,HIF-1a,MT3,PRKAA1)、氧化應(yīng)激響應(yīng)基因(CAT,CYGB,GPX1)及其他與應(yīng)激響應(yīng)有關(guān)的基因(ADM,EPO,HYOU1,VEGF)等的誘導(dǎo)表達(dá)水平偏低,表明這些基因的表達(dá)在SNP注射后3天內(nèi)尚未出現(xiàn)明顯升高.另外,快骨骼肌可磷酸化肌球蛋白輕鏈基因(Mylpf)分別被SNP,CII-CFA,SNP+CⅡ-CFA下調(diào)1000,50和15倍,其生理意義暫不明確.為闡明SNP,CⅡ-CFA,CFA單用或聯(lián)用對缺氧響應(yīng)基因表達(dá)在較長時(shí)間內(nèi)的調(diào)控作用,利用不同濃度的SNP,CⅡ-CFA,SNP+CⅡ-CFA,CFA,SNP+CFA注射小鼠背部皮下組織,并在12天后對HIF-1uf061和VEGF進(jìn)行免疫組化分析.測定結(jié)果表明,隨著SNP濃度逐漸增加,HIF-1uf061和VEGF表達(dá)水平不斷升高,其中以100uf06dg/mLSNP處理的表達(dá)水平最高,HIF-1uf061約為對照的7倍,而VEGF約為對照的4倍(表4).由上表還可看出,SNP,CⅡ-CFA,CFA單用都能上調(diào)HIF-1uf061和VEGF表達(dá),但聯(lián)用并未在單用的基礎(chǔ)上提高HIF-1uf061和VEGF的表達(dá)水平,這可能是因?yàn)槁?lián)用時(shí)SNP使用濃度(100uf06dg/mL)低于單用時(shí)濃度(50uf06dg/mL)的緣故.2.6青蒿表現(xiàn)對減少前注射限制后小鼠血清no水平的影響在CFA免疫前4h,于小鼠皮下注射青蒿琥酯或雷帕霉素,并在CFA免疫后繼續(xù)注射(每天2次,連續(xù)注射3天),然后分析青蒿琥酯或雷帕霉素對CIAA造模過程中促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響.結(jié)果表明,僅雷帕霉素對CFA誘導(dǎo)的免疫激活具有較強(qiáng)的抑制作用,而青蒿琥酯并未對CFA的誘導(dǎo)表現(xiàn)出明顯的免疫抑制效應(yīng)(表5).雷帕霉素使INFuf067,IL-1uf061和IL-6等促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平分別下降至CFA免疫小鼠的70%,85%和82%,而青蒿琥酯則使上述促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平略有升高,分別為CFA免疫小鼠的1.46,1.41和1.79倍.由上表還可看出,經(jīng)青蒿琥酯或雷帕霉素注射的CIAA小鼠,其TNFuf061及可溶性TNFuf061受體(sTNFRⅠ,sTNFRⅡ)的表達(dá)水平均比未注射藥物的CIAA小鼠稍高(1~2倍),這說明青蒿琥酯或雷帕霉素對TNFuf061及其受體表達(dá)無抑制作用.將小鼠CIAA模型的治療分成造模前給藥組(CFA免疫前4h開始注射,每天注射2次,連續(xù)注射3天)和造模后給藥組(CFA免疫后開始注射,每天注射2次,連續(xù)注射5天),觀察青蒿琥酯或雷帕霉素對血清NO水平的調(diào)節(jié)作用.在前處理組中,經(jīng)青蒿琥酯或雷帕霉素注射3天后,其血清NO水平下降到與對照相當(dāng)?shù)乃?在后處理組中,經(jīng)青蒿琥酯或雷帕霉素注射5天后,其血清NO水平與對照水平相當(dāng)或低于對照(圖6A).與未處理CIAA小鼠相比,無論前處理或后處理都能使SpO2升高,但青蒿琥酯后處理組并未恢復(fù)到正常的SpO2水平(圖6B).這些結(jié)果表明,青蒿琥酯或雷帕霉素都能通過抑制NO的合成而部分緩解CFA誘導(dǎo)的缺氧現(xiàn)象,但前處理的效果比后處理好.2.7青蒿表現(xiàn)對fpse-la和vegf表達(dá)的影響在CFA免疫小鼠中,青蒿琥酯或雷帕霉素前處理3天以及青蒿琥酯后處理5天,均可逆轉(zhuǎn)HIF-1uf061表達(dá)上調(diào),但雷帕霉素后處理5天的效果較差(圖7A).雷帕霉素前處理的HIF-1uf061表達(dá)水平與對照相當(dāng),而雷帕霉素后處理的HIF-1uf061表達(dá)水平為對照的2倍.青蒿琥酯或雷帕霉素處理使血管再生過程受阻,使CFA免疫導(dǎo)致的LA含量增加顯著(圖7B).無論前處理或后處理,青蒿琥酯或雷帕霉素都能促進(jìn)無氧代謝活動的增強(qiáng),其中雷帕霉素處理的LA含量比青蒿琥酯處理的LA含量更高,甚至高于CFA處理.以上結(jié)果表明,青蒿琥酯或雷帕霉素可抑制CFA誘導(dǎo)的HIF-1uf061和VEGF表達(dá)上調(diào),前處理的效果比后處理好.但是,由于血管增生受到抑制,青蒿琥酯或雷帕霉素均不能阻止血清LA水平的升高.2.8青蒿表現(xiàn)在造模前后和聯(lián)合給藥前后的質(zhì)量比較見表1.在造模前給藥組中,經(jīng)青蒿琥酯處理后,CIAA小鼠的腿部仍有腫脹(圖8A);經(jīng)雷帕霉素處理后,CIAA小鼠的腿部腫脹減輕(圖8B);青蒿琥酯+雷帕霉素處理的CIAA小鼠表現(xiàn)明顯的足部紅腫現(xiàn)象(圖8C).在造模后給藥組中,青蒿琥酯處理的CIAA小鼠的關(guān)節(jié)及腳趾可見明顯紅腫(圖8D),但雷帕霉素或青蒿琥酯+雷帕霉素處理可使紅腫程度大為緩解(圖8E和F).上述結(jié)果表明,青蒿琥酯、雷帕霉素對實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)滑膜炎具有不同程度的預(yù)防和治療作用,其中雷帕霉素優(yōu)于青蒿琥酯.在造模前給藥組中,青蒿琥酯與雷帕霉素聯(lián)合給藥的效果比單用青蒿琥酯好.造模前聯(lián)合給藥效果不如造模后聯(lián)合給藥效果的原因可能是前者的雷帕霉素劑量低(30uf06dg/mL),而后者的雷帕霉素劑量高(50uf06dg/mL).2.9滑膜細(xì)胞水浸青蒿琥酯前處理的CIAA小鼠,滑膜細(xì)胞輕度增生,間質(zhì)大量中性粒細(xì)胞浸潤(圖9A);雷帕霉素前處理的CIAA小鼠,滑膜未見明顯增生,間質(zhì)見中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(圖9B);青蒿琥酯+雷帕霉素前處理的CIAA小鼠,滑膜細(xì)胞輕度增生成1~2層,可見散在少許慢性炎細(xì)胞浸潤(圖9C).青蒿琥酯后處理的CIAA小鼠,滑膜細(xì)胞增生成2層,可見散在慢性炎細(xì)胞浸潤(圖9D).雷帕霉素后處理的CIAA小鼠,滑膜細(xì)胞增生成2層,未見明顯炎細(xì)胞浸潤(圖9E);青蒿琥酯+雷帕霉素后處理的CIAA小鼠,滑膜細(xì)胞未見明顯增生,未見炎細(xì)胞浸潤(9F).由上述結(jié)果可知,無論前處理或后處理,雷帕霉素或青蒿琥酯+雷帕霉素的效果均優(yōu)于青蒿琥酯,其中青蒿琥酯+雷帕霉素后處理對于阻斷滑膜增生及炎性浸潤具有良好作用,可能是實(shí)驗(yàn)性RA模型治療的較好方案之一.3no的作用意義基于TNFuf061單抗的生物療法已獲準(zhǔn)用于臨床治療RA患者,在一定程度上解除了RA患者的病痛.可是,仍有多達(dá)40%的患者對于TNFuf061單抗治療無應(yīng)答或不敏感,凸顯出開發(fā)其他替代性治療藥物的緊迫性和必要性.為什么RA患者中存在TNFuf061單抗的無應(yīng)答者呢?根據(jù)本文得出的結(jié)論,NO爆發(fā)性缺氧是啟動關(guān)節(jié)滑膜血管新生和細(xì)胞增殖并導(dǎo)致滑膜炎乃至關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵因素,但NO既可由TNFuf061激發(fā),也能由IL-1uf062等其他促炎癥細(xì)胞因子激發(fā).因此,僅僅抑制TNFuf061而不抑制其他促炎癥細(xì)胞因子就不足以阻斷炎癥誘導(dǎo)的NO合成,這可能是TNFuf061單抗僅對部分RA患者有效的原因.由此推論,用工程肽或反義技術(shù)封閉TNF受體對保護(hù)RA患者免受關(guān)節(jié)炎癥損傷的作用可能也是有限的.構(gòu)建基于發(fā)病機(jī)理的RA動物模型不僅有利于篩選和評價(jià)抗RA候選藥物,而且可以從另一個(gè)側(cè)面揭示RA的真正病因.在小鼠中進(jìn)行CIA造模需要含有加熱滅活細(xì)菌的CFA對CⅡ誘導(dǎo)的免疫激活作用加以強(qiáng)化,而且造模所需要的時(shí)間較長(3~4周).我們嘗試將CⅡ-CFA免疫由皮內(nèi)注射改成關(guān)節(jié)內(nèi)注射后,已將造模至滑膜炎出現(xiàn)的時(shí)間縮短到3天.由于已有報(bào)道稱抗CⅡ反應(yīng)只是RA致病的結(jié)果而非原因,因此我們嘗試用CFA替代CⅡ-CFA進(jìn)行造模,結(jié)果可在1~3天內(nèi)誘導(dǎo)急性滑膜炎.這可能是迄今為止已知最快捷的小鼠RA造模方法之一,有望成為抗早期RA藥物高通量篩選及高效藥理評價(jià)的實(shí)驗(yàn)平臺.關(guān)于NO在RA發(fā)作中的意義,Perkins等人報(bào)道,誘導(dǎo)型NO合酶(iNOS)基因敲除可賦予小鼠對骨骼消融的抗性,表明NO控制著RA發(fā)病的某個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié).最近,Chow等人報(bào)道,廣泛用于骨關(guān)節(jié)炎治療的透明質(zhì)酸可通過抑制滑膜中iNOS活性阻斷佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠的軟骨及骨骼侵蝕性損傷.盡管過去曾有人提及NO在RA致病過程中的可能作用,但只注意到NO誘導(dǎo)免疫功能失調(diào)或NO調(diào)節(jié)線粒體活性.作為RA病因的機(jī)理性探索,我們最近首次證實(shí)了病原體感染、促炎癥細(xì)胞因子上調(diào)、NO爆發(fā)、缺氧誘導(dǎo)、血管新生、細(xì)胞增殖和炎性浸潤之間的因果關(guān)系.Ng等人在RA患者中發(fā)現(xiàn),氧分壓(tPO2)與滑膜炎癥之間存在著直接的相關(guān)性,認(rèn)為缺氧是關(guān)節(jié)發(fā)生炎癥的一個(gè)可能的驅(qū)動因素.同樣,本研究所觀察到的免疫激發(fā)性NO與SpO2的互作也支持這一結(jié)論.那么,NO究竟是如何驅(qū)動缺氧的呢?Han等人指出,NO可通過加速進(jìn)入紅細(xì)胞促進(jìn)其自身消耗,NO可能占據(jù)血紅蛋白中的O2結(jié)合位點(diǎn).滑膜原本就是一個(gè)相對缺氧的組織,其軟骨中的氧分壓從表層的6%到深層的1%,NO的大量積累將使滑膜的缺氧狀況更趨嚴(yán)重.同時(shí),NO也可跨膜進(jìn)入線粒體內(nèi)并結(jié)合細(xì)胞色素c氧