細(xì)胞工程學(xué)：第7章 細(xì)胞融合與體細(xì)胞雜交

第7章細(xì)胞融合與體細(xì)胞雜交酸酸甜甜才是生活！細(xì)胞雜交技術(shù)可以改變生活！同樣，有沒有可能培育出地下結(jié)土豆，地上結(jié)番茄的超級(jí)植物？1978年德國(guó)科學(xué)家梅歇爾斯將番茄與馬鈴薯進(jìn)行體細(xì)胞雜交育成薯番茄“泡馬豆”（po(tato)-(to)mato）。馬鈴薯與番茄兩種原生質(zhì)體的融合率竟高達(dá)40％～50％。植物細(xì)胞雜交視頻觀看：/special/show_3043714/ACRkYAQc9LIhIUwv.html這種植株已經(jīng)雜交成功了，不過遺憾的是地上的馬鈴薯的地上部分，地下是番茄的地下部分既不結(jié)番茄也不結(jié)馬鈴薯本章主要內(nèi)容：1細(xì)胞融合2體細(xì)胞雜交1、細(xì)胞融合定義及意義細(xì)胞融合（Cellfusion）是指使用人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。如果親本細(xì)胞是體細(xì)胞，也叫“體細(xì)胞雜交（somaticcellhybridization）”。

由于它不僅能產(chǎn)生同種細(xì)胞融合，也能產(chǎn)生種間細(xì)胞的融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)在創(chuàng)造新細(xì)胞、培育新品種方面意義重大。§7-1細(xì)胞融合2、細(xì)胞融合的分類2.1從親本來源：（1）同核體（Homokaryon）：基因型相同的細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞稱為。（2）異核體（Heterokaryon）：來自不同基因型的融合細(xì)胞。2.2從融合效果：（1）對(duì)稱融合（Symmetricfusion）：兩個(gè)完整的細(xì)胞間的融合。（2）不對(duì)稱融合（Asymmetricfusion）：利用物理（如X、Y射線）或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再與另外一個(gè)完整細(xì)胞進(jìn)行融合。后代變異較大，一般都是非整倍體。細(xì)胞核的融合是關(guān)鍵若是沒發(fā)生細(xì)胞核的融合，僅發(fā)生了細(xì)胞質(zhì)的融合，則可能成為嵌合細(xì)胞。含有多個(gè)核的異核細(xì)胞合并后形成的單核細(xì)胞稱為合核細(xì)胞。細(xì)胞核的合并發(fā)生在有絲分裂過程中。但是這種有絲分裂只有當(dāng)兩個(gè)核的DNA合成基本同步時(shí)才能發(fā)生：兩個(gè)核同時(shí)進(jìn)行有絲分裂，形成一個(gè)紡錘體，全部染色體都排列在一個(gè)赤道板上，結(jié)果伴隨著細(xì)胞分裂就形成了單核的子細(xì)胞，其細(xì)胞核中含有雙親細(xì)胞的染色體。3、細(xì)胞融合的主要步驟（1）優(yōu)良親本選擇（單細(xì)胞或原生質(zhì)體制備）（2）兩原生質(zhì)體或細(xì)胞互相靠近，粘附（3）質(zhì)膜融合形成細(xì)胞橋（關(guān)鍵一步）（4）胞質(zhì)滲透（5）細(xì)胞核融合（6）融合細(xì)胞篩選細(xì)胞橋的形成4細(xì)胞融合方法1.生物法病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合：是研究最早的細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法。主要是由于病毒會(huì)與宿主細(xì)胞膜直接融合，同時(shí)進(jìn)入兩個(gè)細(xì)胞就會(huì)打破兩個(gè)細(xì)胞膜的隔閡，引發(fā)細(xì)胞質(zhì)的交流，進(jìn)而達(dá)到細(xì)胞融合的目的。原因可能是病毒的磷脂外衣與動(dòng)物細(xì)胞膜相似，病毒外殼上的某些糖蛋白有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能。仙臺(tái)病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙臺(tái)病毒（HAJ）是兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合體。因HAJ病毒毒力弱，易被滅活而常采用。缺點(diǎn)：要提前大量培養(yǎng)病毒，并且滅活后才能作為融合劑使用，操作繁瑣，而且一旦滅活不充分的話，病毒還可能感染操作者與親本細(xì)胞。因此，目前已經(jīng)很少使用病毒誘導(dǎo)法進(jìn)行細(xì)胞融合。病毒介導(dǎo)融合原理與過程（1）足夠量的病毒顆粒附著在細(xì)胞膜上起搭橋作用，使細(xì)胞聚集在一起。（2）通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相融合。粘結(jié)部位質(zhì)膜被破壞，不同細(xì)胞間形成通道，細(xì)胞質(zhì)流通并融合（病毒也隨之進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)）。（3）有絲分裂，細(xì)胞核融合，形成雜種細(xì)胞。（4）融合細(xì)胞篩選。2化學(xué)法采用化學(xué)誘導(dǎo)劑促使細(xì)胞融合，包括：NaNO3、高pH的高濃度Ca2+離子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明膠、抗體、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等。機(jī)理在于：細(xì)胞膜電荷平衡被打破。（1）NaNO3誘導(dǎo)融合1909年，凱斯特（Kuster）發(fā)現(xiàn)機(jī)械分離的發(fā)生了質(zhì)壁分離的洋蔥表皮細(xì)胞原生質(zhì)體在NaNO3溶液中可以恢復(fù)并伴隨著細(xì)胞融合。1972年，卡爾森（Carlson）利用NaNO3誘導(dǎo)融合了粉蘭煙草和郎氏煙草原生質(zhì)體，培育出世界第一株體細(xì)胞雜種。原理:NaNO3的鈉離子可以中和原生質(zhì)體表面負(fù)電荷，引起原生質(zhì)體聚集，促進(jìn)細(xì)胞融合。NaNO3對(duì)原生質(zhì)體無損害，但融合效率低，一般小于4%。（2）高pH的高濃度Ca2+離子誘導(dǎo)融合1973年，凱勒（Keller）和梅爾切斯（Melchers）發(fā)現(xiàn)采用強(qiáng)堿性（例如pH10.5）的高濃度鈣離子溶液（50mmol/LCaCl2?2H2O）在37℃下處理兩個(gè)品系的煙草葉肉原生質(zhì)體，很容易促使融合，融合率可以達(dá)到10%。原理：鈣離子中和原生質(zhì)體膜或細(xì)胞膜表明表面電荷，使彼此緊密接觸，決定質(zhì)膜的穩(wěn)定性和可塑性；高pH能改變質(zhì)膜的表面電荷，利于細(xì)胞融合。（3）PEG誘導(dǎo)聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)是一種多聚化合物，分子式為H(OHCH2-CH2)nOH)。常用的PEG平均分子量在200－20,000之間，分子量1,000以下者為液體，1,000以上者為固體。1、PEG分子具有輕微的負(fù)極性，可以與具有正極性基團(tuán)的水分子、蛋白質(zhì)、碳水化合物形成氫鍵，在相鄰的原生質(zhì)體間起到分子橋的作用，使原生質(zhì)體接觸。

當(dāng)PEG分子被洗脫時(shí)，膜電荷發(fā)生紊亂而重新分配。此時(shí)，一種原生質(zhì)體上帶正電的基團(tuán)可能與另外一個(gè)原生質(zhì)體中帶負(fù)電的基團(tuán)相連，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合?？赡軝C(jī)理：2、PEG可以改變細(xì)胞膜的理化性質(zhì)，增加膜脂的流動(dòng)性，使細(xì)胞膜發(fā)生疏松和重排，導(dǎo)致細(xì)胞融合。（4）高Ca2+和pH誘導(dǎo)PEG結(jié)合誘導(dǎo)在高Ca2+和pH溶液的作用下，將與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，將進(jìn)一步加劇電荷平衡失調(diào)，從而提高融合的幾率。因此，PEG結(jié)合高pH的高濃度Ca2+離子誘導(dǎo)融合方法成為一種較常用的細(xì)胞融合方法。優(yōu)點(diǎn)：融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。缺點(diǎn)：是融合過程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。PEG法誘導(dǎo)融合3物理法電融合誘導(dǎo)法（Electrofusion）：利用電場(chǎng)來誘導(dǎo)細(xì)胞彼此連接成串，再施加瞬間強(qiáng)脈沖促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促進(jìn)細(xì)胞融合的技術(shù)。原理：在直流電脈沖的刺激下，細(xì)胞膜或原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞或原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。優(yōu)點(diǎn)：融合率高、重復(fù)性與可控制性強(qiáng)。缺點(diǎn)：可能會(huì)造成不可恢復(fù)的細(xì)胞損傷。

電融合步驟：（1）聚集：兩種親本細(xì)胞在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，極化產(chǎn)生偶極子，彼此靠近，定向排列成串球狀。（2）細(xì)胞膜融合：在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體膜兩側(cè)產(chǎn)生電勢(shì)，正負(fù)電荷相吸，細(xì)胞膜變薄，觸發(fā)膜的穿孔（質(zhì)膜瞬間破裂）。（3）異核體：膜之間形成通道，細(xì)胞質(zhì)等得以交換、融合。（4）融合細(xì)胞：細(xì)胞核融合。融合率達(dá)到16-27%，原生質(zhì)體存活率97%§7.2體細(xì)胞雜交1Somaticcellhybridization：指將不同來源的體細(xì)胞融合，并使之分化再生、形成新品種的技術(shù)。2體細(xì)胞雜交育種的意義1克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性，創(chuàng)造新物種。2與基因工程改造相比的優(yōu)點(diǎn)：植物的抗逆性多為多基因控制，因此易于實(shí)現(xiàn)多基因控制性狀。3實(shí)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)遺傳組合：農(nóng)作物一些性狀如細(xì)胞質(zhì)雄性不育、抗除草劑性，都是由胞質(zhì)遺傳物質(zhì)控制引起的遺傳現(xiàn)象（又稱非染色體遺傳）。3體細(xì)胞雜交技術(shù)路線技術(shù)：細(xì)胞融合+植物組織培養(yǎng)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：細(xì)胞篩選與雜種植物鑒定4雜種細(xì)胞篩選方法（1）抗藥性篩選法：–

利用細(xì)胞對(duì)藥物敏感性差異篩選融合細(xì)胞。例如親本細(xì)胞A只對(duì)amp敏感，親本細(xì)胞B只對(duì)Kan敏感，則在含有amp和Kan的培養(yǎng)基上，融合細(xì)胞會(huì)生存，而雙親本死亡。（2）營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選法：–

利用兩親本細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)可以篩選融合細(xì)胞。例如，親本A為色氨酸Trp缺陷型，B為蘇氨酸Thr缺陷型，則在不含色氨酸和蘇氨酸培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，雙親本死亡，而雜種細(xì)胞存活。異硫氰酸熒光素（FITC，綠色熒光）和異硫氰酸羅丹明（RITC，紅色熒光）（4）熒光標(biāo)記法兩個(gè)親本原生質(zhì)體在融合前用能發(fā)不同顏色熒光的熒光染料分別進(jìn)行染色，則融合細(xì)胞顯示兩種熒光標(biāo)記。但儀器價(jià)格昂貴，不常用。（3）物理特性篩選法：–利用親本原生質(zhì)體形態(tài)、大小、顏色差異如采用倒置顯微鏡用微管將融合細(xì)胞吸取出來。（1）形態(tài)學(xué)特征鑒定（2）細(xì)胞學(xué)鑒定（3）同工酶鑒定（4）分子標(biāo)記鑒定：RFLP鑒定、RAPD、SSR標(biāo)記鑒定5雜種植物鑒定形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定：根據(jù)莖、葉、花等組織的形態(tài)、顏色來鑒別雜種。兩親本的親源關(guān)系較遠(yuǎn)時(shí)，雜種植物的形態(tài)傾向于親本之一，但存在差異。（2）細(xì)胞學(xué)鑒定：原生質(zhì)體融合的親本材料一般為二倍體，雜種細(xì)胞的染色體應(yīng)該為雙二倍體。如果親本的親源關(guān)系較遠(yuǎn)，染色體差異會(huì)較大；同時(shí)，雜種細(xì)胞中一親本的染色體可能會(huì)受到另外一親本的排斥，可能會(huì)產(chǎn)生大量非整倍體。因此可以從雜種植物染色體的數(shù)目鑒定是否是雜種植物。18條染色體36條染色體

（3）同工酶（isoenzyme）鑒定同工酶：是催化的化學(xué)反應(yīng)相同而理化性質(zhì)、免疫學(xué)活性都不同的一組酶。由于蛋白質(zhì)分子量和表面所帶電荷不同，其等電點(diǎn)也不同，故在電場(chǎng)中移動(dòng)的速率不同而使蛋白質(zhì)分離。由于同工酶理化性質(zhì)、免疫學(xué)活性都不同，因此可以用電泳法分離。原理：根據(jù)親本和雜種植物的同工酶譜的差異來鑒別雜種植物。雜種植物的同工酶譜是雙親本酶譜的總和，表現(xiàn)為條帶增多、酶帶顏色加深、寬度加大，有時(shí)還出現(xiàn)兩親本都不具有的新譜帶或者丟失部分親本酶帶。常用來作為分析對(duì)象的有乙醇脫氫酶、乳酸脫氫酶、過氧化物酶、酯酶、氨肽酶、核酮糖二磷酸羧化酶等。

DNA分子標(biāo)記鑒定：是在分子水平對(duì)親本和雜種植物遺傳性狀差異進(jìn)行鑒定，能正確揭示出生物個(gè)體間核苷酸序列的差異。一些基因指紋技術(shù)（如RFLP

、RAPD、SSR等）已經(jīng)成功應(yīng)用于雜種的鑒定。RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphisma,限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性)RAPD（RandomAmplificationofPolymorphicDNA，隨機(jī)擴(kuò)增的DNA多態(tài)性），可對(duì)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)。其以基因組DNA為模板,以單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列(通常為10個(gè)堿基對(duì))為引物,進(jìn)行PCR(PolymeraseChainReaction)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后,在紫外透視儀上檢測(cè)多態(tài)性。擴(kuò)增產(chǎn)