牛早期胚胎性別鑒定中pcr反應(yīng)體系的建立及應(yīng)用

牛早期胚胎性別鑒定中pcr反應(yīng)體系的建立及應(yīng)用

動(dòng)物和動(dòng)物的性別控制一直是人們追求的目標(biāo)。實(shí)現(xiàn)家畜性別的人為控制主要有兩條途徑:一是X精子和Y精子的分離;二是早期胚胎的性別鑒定。從目前X、Y精子分離技術(shù)的發(fā)展來(lái)看,雖然使用流式細(xì)胞分類儀已成功分離了X、Y精子,但其成本高,分離效率低,一時(shí)還很難在實(shí)際應(yīng)用中推廣。隨著胚胎移植技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化推廣,早期胚胎的性別鑒定技術(shù)日益發(fā)展成熟,成為目前最有實(shí)用價(jià)值的一項(xiàng)性別控制技術(shù)牛早期胚胎的性別鑒定已有十幾年的發(fā)展歷史,從早期的免疫學(xué)方法到胚胎細(xì)胞的染色體核型分析,取得了巨大的發(fā)展,但真正進(jìn)入實(shí)用化階段是PCR技術(shù)在牛早期胚胎性別鑒定中的應(yīng)用。Herr等(1990)首先成功應(yīng)用PCR技術(shù)鑒定牛羊胚胎性別。曾溢滔等(1993)通過(guò)對(duì)牛SRY基因片段的直接測(cè)序,設(shè)計(jì)了牛SRY基因引物,對(duì)牛早期胚胎進(jìn)行了性別鑒定研究。目前常用的牛胚胎性別鑒定的PCR方法主要有兩種:一種為常規(guī)PCR,即用一對(duì)Y-染色體特異性引物或同時(shí)使用一對(duì)公、母牛共有基因引物作為內(nèi)標(biāo)引物對(duì)胚胎樣品進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增來(lái)鑒定胚胎性別。另一種為巢式PCR,即先用Y-染色體特異基因的外引物和內(nèi)標(biāo)引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增,然后取第一次擴(kuò)增產(chǎn)物再加入內(nèi)引物和內(nèi)標(biāo)引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增。本試驗(yàn)中,我們根據(jù)牛SRY基因序列自行設(shè)計(jì)了2對(duì)SRY基因引物(嵌套式引物)作為性別鑒定引物,同時(shí)根據(jù)牛酪蛋白基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物作為內(nèi)標(biāo)引物,建立了牛胚胎性別鑒定的PCR反應(yīng)體系,對(duì)比分析了常規(guī)PCR和巢式PCR方法在牛胚胎性別鑒定中的實(shí)用性,還對(duì)微量胚胎細(xì)胞樣品DNA的提取方法,所用的犢牛血清是否會(huì)對(duì)鑒定結(jié)果產(chǎn)生污染等進(jìn)行了研究和檢測(cè),以期找到最佳的牛胚胎性別鑒定方法。1材料和方法1.1致桑蝦胚、早期囊胚的提取牛耳組織DNA提取:提取牛耳組織DNA,檢驗(yàn)所設(shè)計(jì)引物的特異性。從牛場(chǎng)或屠宰場(chǎng)采集牛耳組織,70%乙醇保存,回實(shí)驗(yàn)室后剪碎,用蛋白酶K、組織裂解液消化過(guò)夜,然后用酚、氯仿反復(fù)抽提,無(wú)水乙醇沉淀,70%乙醇洗滌后干燥,TE溶解至終濃度100ng/μl。微量細(xì)胞DNA的提取:使用微量血細(xì)胞或顆粒細(xì)胞模擬胚胎細(xì)胞樣品,尋求最佳的胚胎細(xì)胞DNA提取方法,使用相同數(shù)量的顆粒細(xì)胞對(duì)比兩種PCR方法的靈敏度。提取方法分兩種:一是取少量血液或在高倍實(shí)體顯微鏡下取10個(gè)顆粒細(xì)胞在沸水中煮10min,離心后取其上清作為反應(yīng)模板;二是將顆粒細(xì)胞樣品用液氮反復(fù)凍融幾次后離心,取上清作為反應(yīng)模板。胚胎樣品DNA提取:選擇A級(jí)或B級(jí)的致密桑椹胚和早期囊胚,采用日本產(chǎn)NALISHIGEMN-151型簡(jiǎn)易胚胎分割儀對(duì)胚胎進(jìn)行分割取樣,取樣細(xì)胞數(shù)為整個(gè)胚胎的1/5～1/3。取樣細(xì)胞用熱處理或液氮處理,離心取上清。1.2pcr引物的合成根據(jù)參考文獻(xiàn)報(bào)道的牛SRY基因序列設(shè)計(jì)合成了2對(duì)巢式PCR引物,同時(shí)根據(jù)牛酪蛋白基因序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)內(nèi)標(biāo)引物,引物由上海生工生物工程有限公司合成。1.3pcr檢測(cè)taq酶常規(guī)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為20μl,其中10×PCRBuffer2μl,Mg2+2.5mmol/l,dNTP(上海生工)0.4μl,Taq酶(上海生工)2.5U,各引物濃度為0.3μmol/l。循環(huán)參數(shù)為:預(yù)變性94℃,5min;變性94℃,30s;退火63℃,30s;延伸72℃,1min;共進(jìn)行38個(gè)循環(huán),最后在72℃,5min。巢式PCR的反應(yīng)體系為:第一次PCR反應(yīng)體積為10μl,其中含各引物0.1μmol/l,Taq酶2.0U,共20個(gè)循環(huán)。取第一次PCR反應(yīng)物4μl作為第二次PCR反應(yīng)模板,同時(shí)加入SRY基因內(nèi)引物和內(nèi)標(biāo)引物各0.25μmol/l,Taq酶2.0U共進(jìn)行30個(gè)循環(huán),循環(huán)參數(shù)和常規(guī)PCR一樣。PCR反應(yīng)在PTC-100(MJResearch)上進(jìn)行。1.4pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析取8μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,電壓90V,電泳時(shí)間30min,紫外透射分析儀觀察擴(kuò)增結(jié)果。1.5血清是否會(huì)對(duì)胚胎性別鑒定結(jié)果產(chǎn)生污染在PBS中加入10%、20%的犢牛血清,再分別取10μl含血清的PBS經(jīng)煮沸10min后離心取上清作為反應(yīng)模板,通過(guò)鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)來(lái)判定所用血清是否會(huì)對(duì)胚胎性別鑒定結(jié)果產(chǎn)生污染。1.6在對(duì)受影響牛的同時(shí)病因和性別鑒定后，進(jìn)行了胚胎移植在供體牛注射PG前一天對(duì)受體牛注射PG進(jìn)行同期發(fā)情處理。性別鑒定后的胚胎,移植到同期發(fā)情牛的子宮角。2結(jié)果2.1推進(jìn)ndb基因的擴(kuò)增帶分析采集15頭公牛,13頭母牛的耳組織樣品,用抽提的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果常規(guī)PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下公牛可觀察到255bp的SRY基因擴(kuò)增帶和403bp的酪蛋白基因擴(kuò)增帶,而母牛只能看到403bp的酪蛋白基因擴(kuò)增帶(圖2)。而采用巢式PCR時(shí),公?？煽吹?05bp的SRY基因擴(kuò)增帶和403bp的酪蛋白基因擴(kuò)增帶,母牛只能看到403bp的酪蛋白基因擴(kuò)增帶(圖1),其性別鑒定結(jié)果和實(shí)際性別完全一致。2.2pcr擴(kuò)增帶對(duì)比在同樣取0.5μl新鮮血液加入30μl水熱處理后取其中6μl作為反應(yīng)模板的情況下,用常規(guī)PCR擴(kuò)增38個(gè)循環(huán)時(shí),在紫外燈下看到的擴(kuò)增帶較模糊,易產(chǎn)生誤判,而使用巢式PCR時(shí)擴(kuò)增帶比較清晰。相同數(shù)量顆粒細(xì)胞(10～20個(gè))提取DNA后作為反應(yīng)模板的情況下,使用一次PCR擴(kuò)增38個(gè)循環(huán),在紫外燈下有時(shí)因?yàn)閿U(kuò)增產(chǎn)物少而看不到明顯的擴(kuò)增帶,采用巢式PCR時(shí),則可以清晰地看到403bp的一條擴(kuò)增帶。減少細(xì)胞量的試驗(yàn)結(jié)果表明,使用巢式PCR只需10個(gè)細(xì)胞即可看清楚擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳帶,因此在胚胎性別鑒定時(shí),由于從胚胎上切取的細(xì)胞數(shù)量少,所以最好使用巢式PCR。2.3從未經(jīng)處理的細(xì)胞樣本中提取dna的方法使用熱處理法和使用液氮處理法提取的微量細(xì)胞樣品DNA的擴(kuò)增效率相同,所以在胚胎性別鑒定時(shí)可以使用任意一種處理方法。2.4血清純度對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響含10%、20%血清的PBS試驗(yàn)結(jié)果表明,所用的犢牛血清比較純不會(huì)對(duì)PCR鑒定結(jié)果產(chǎn)生污染。2.5實(shí)際胚胎鑒定結(jié)果對(duì)12枚黑白花奶牛胚胎進(jìn)行了性別鑒定,其中第2號(hào)和第9號(hào)胚胎由于操作過(guò)程中胚胎細(xì)胞丟失而無(wú)法判定其性別,其余10枚胚胎的性別鑒定結(jié)果如下表,受體牛不夠所以每頭受體移植雙胚。由于性別鑒定和胚胎移植都是在牛場(chǎng)進(jìn)行,當(dāng)時(shí)氣溫很高(8月初),因此鑒定性別的10枚胚胎中只有2枚胚胎移植成功,次年5月已產(chǎn)下兩頭牛犢,其實(shí)際性別和鑒定結(jié)果完全一致。今后將進(jìn)一步擴(kuò)大性別鑒定和移植胚胎的規(guī)模。3不同的pcr方法對(duì)胚胎性別鑒定結(jié)果的影響使用PCR鑒定牛早期胚胎性別是目前牛性別控制中最實(shí)用、最有推廣價(jià)值的一項(xiàng)技術(shù)。目前人們已報(bào)道了多種用PCR鑒定牛早期胚胎性別的方法和引物序列。根據(jù)牛SRY基因序列設(shè)計(jì)的2對(duì)巢式PCR引物經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明完全公牛特異。在牛胚胎性別鑒定過(guò)程中,特別是分割取樣過(guò)程中容易丟失樣品,所以如果只用一對(duì)公牛特異的引物,就會(huì)把已丟失樣品的個(gè)體誤判為母牛而影響準(zhǔn)確率,我們根據(jù)牛酪蛋白基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)內(nèi)標(biāo)引物,因此如果樣品丟失,那么酪蛋白基因擴(kuò)增帶也沒(méi)有,避免了假陰性的產(chǎn)生。在胚胎性別鑒定所用的PCR方法中,常規(guī)PCR雖然可以減少性別鑒定所需要的時(shí)間,但由于胚胎性別鑒定時(shí)切割取樣的細(xì)胞數(shù)少,一次擴(kuò)增靈敏度有限,所以容易產(chǎn)生在紫外燈下看不到擴(kuò)增帶或擴(kuò)增帶亮度不夠而對(duì)鑒定結(jié)果產(chǎn)生誤判的現(xiàn)象,如果采用巢式PCR,由于經(jīng)過(guò)兩次擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物的量增加,結(jié)果更容易判斷,而且巢式引物的使用增加了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性,提高了準(zhǔn)確度。除引物的特異性之外,微量胚胎細(xì)胞DNA的提取是另一個(gè)關(guān)鍵,它關(guān)系到PCR反應(yīng)的成敗。試驗(yàn)所使用的煮沸法和凍融法都可用于胚胎細(xì)胞樣品DNA的提取,這兩種方法和傳統(tǒng)的DNA提取方法相比操作簡(jiǎn)便、用時(shí)短,適合在牛胚胎性別鑒定中使用。在胚胎性別鑒定中,由于胚胎培養(yǎng)液中含有犢牛血清,如果血清不純,再加上PCR極為靈敏,所以有可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。根據(jù)HerrC·M等報(bào)道,胚胎培養(yǎng)用的牛血清和BSA等都會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。我