牛胚胎移植技術(shù)要點(diǎn)

牛胚胎移植技術(shù)要點(diǎn)

牛胚胎移植技術(shù)充分利用了優(yōu)秀母牛的繁殖潛力，加快了遺傳進(jìn)步，增加了用于肉動(dòng)物的雙胎率，克服了母羊的并發(fā)癥，降低了引進(jìn)成本，降低了疾病傳播。牛的胚胎移植過(guò)程大致可分為以下幾個(gè)環(huán)節(jié):同期發(fā)情→超數(shù)排卵→胚胎采集→胚胎檢測(cè)→胚胎保存→胚胎移植。只有嚴(yán)格把握各個(gè)操作環(huán)節(jié)技術(shù)要領(lǐng),才能獲得滿(mǎn)意的結(jié)果。1同時(shí)發(fā)送1.1體抗體和受體祖母的選擇1.1.1能生長(zhǎng)、能高、無(wú)遺傳和無(wú)基因供體應(yīng)是良種,而且性狀表現(xiàn)優(yōu)秀,具有較高育種價(jià)值與遺傳優(yōu)勢(shì)的個(gè)體,生產(chǎn)性能高、遺傳性穩(wěn)定、系譜清楚、體質(zhì)健壯、繁殖機(jī)能正常、無(wú)遺傳和傳染性疾病、年齡在2周歲到7周歲以?xún)?nèi)、產(chǎn)犢在3個(gè)月以上,6個(gè)月以?xún)?nèi)的母牛。必須嚴(yán)格掌握發(fā)情時(shí)間和前兩個(gè)發(fā)情周期,不能改變飼養(yǎng)環(huán)境條件,如長(zhǎng)途運(yùn)輸,飼養(yǎng)成分等。1.1.2發(fā)情周期正常受體牛僅作為借腹懷胎,不要求遺傳性狀,但發(fā)情周期必須正常,年齡在2周歲到5周歲以?xún)?nèi),健康狀況良好,不能有任何影響繁殖性能的疾病,尤其是生殖器官正常。1.2外源性激素要求受體和供體的發(fā)情時(shí)間要相同或相近,前后差異不超過(guò)1d,故對(duì)供、受體進(jìn)行同期發(fā)情處理。同期發(fā)情常用PMSG、GnRH、FSH、LH、hCG、P4等外源性激素對(duì)牛只進(jìn)行處理,達(dá)到發(fā)情和排卵的時(shí)間同期化的目的。目前,生產(chǎn)中常用的是氯前列烯醇(PGC),其溶黃體的生物活性相當(dāng)于PG的200倍,相當(dāng)于15-甲基前列腺素的10倍以上,由于其效果確實(shí),價(jià)格低廉,使用方便,廣泛應(yīng)用于家畜同期發(fā)情,牛的用量一般為0.3mg。2超數(shù)排列2.1植草管單次給藥后超排超排處理時(shí)選擇母牛上次發(fā)情周期9~12d進(jìn)行,發(fā)情時(shí)要注意跟蹤直腸檢查,確定黃體數(shù)、級(jí)別、卵泡數(shù)等,判斷黃體的位置及數(shù)量與卵泡的數(shù)量及位置是否一致。超排開(kāi)始時(shí)要停止直腸檢查。超排時(shí)所用藥物劑量要因牛而異。對(duì)選擇好的供體牛于上次發(fā)情周期的9~12d開(kāi)始超排處理。2.2供體牛感染后第913d一次性注射將30mgFSH溶解于10mL30%PVP(聚乙烯吡咯酮)后,在供體牛發(fā)情后第9~13d一次性注射。朱華彬等指出,用30%的聚乙烯吡咯酮溶解后,FSH在牛體內(nèi)的半衰期為3d,因此可以一次肌肉注射給牛超排,既簡(jiǎn)化超排程序,又能提高超排效果。3尾椎硬膜外腔麻醉供體受精日計(jì)0d,輸精第6d或第7d采集胚胎。首先將牛保定,保定架前高后低(相差20cm),然后用2%普魯卡因2~5mL在第一與第二尾椎間隙部位進(jìn)行尾椎硬膜外腔麻醉。麻醉后消毒外陰,用子宮擴(kuò)張棒擴(kuò)張子宮頸,清除宮頸粘液。采取二通管正壓沖卵,即將插有內(nèi)芯的沖卵管插入一側(cè)子宮角,在達(dá)到子宮大彎時(shí),助手協(xié)助拔出內(nèi)芯5~10cm,直到?jīng)_卵管達(dá)到子宮角首段為止,給二通管內(nèi)充氣10~20mL,最后拔出內(nèi)芯。操作者握住子宮輸卵管結(jié)合處,每次宮注液量依子宮大小而定,每側(cè)宮角沖洗6~7次。4體外受精開(kāi)放觀(guān)察檢查的過(guò)程中一般先將沖胚液靜置30min,然后放于實(shí)體顯微鏡下放大16倍尋找胚胎。根據(jù)平皿的形態(tài)可以從上到下,從左到右,從外到內(nèi)螺旋形依次移動(dòng),將找到的卵用吸管吸出放入裝有PBS的保存液滴中,然后吸些PBS吹向卵周?chē)?使卵在液滴中翻騰,以便清除胚胎周?chē)恼尺B物。將凈化后的胚胎置于PBS液中,然后放在40~200倍顯微鏡下作形態(tài)學(xué)檢查。研究證實(shí),胚胎內(nèi)活細(xì)胞數(shù)的多少與之妊娠率成正比例。一般按質(zhì)量把胚胎分為A、B、C、D四個(gè)等級(jí)。胚胎與發(fā)育期相吻合,卵裂球輪廓清晰,透明度適中,細(xì)胞密度大,卵裂均勻,無(wú)水泡樣裂球,無(wú)變性細(xì)胞,即為優(yōu)秀胚,定為A級(jí);與典型的胚胎相比,稍有變形,但卵細(xì)胞和分裂球的輪廓清晰,細(xì)胞質(zhì)較致密,分布均勻,變性細(xì)胞和水泡不超過(guò)10%~30%的定為B級(jí);凡形態(tài)有明顯變異,卵細(xì)胞和分裂球輪廓稍不清晰,或部分不清晰,細(xì)胞質(zhì)不致密,分布不均勻,色調(diào)發(fā)暗,突出的細(xì)胞、水泡和變性細(xì)胞占30%~50%的胚胎定為C級(jí);凡總體形態(tài)結(jié)構(gòu)不正常的卵子、未受精的退化或破碎卵子,透明帶空的或?qū)⒖盏穆炎?以及與正常胚胎相比,發(fā)育遲2d或2d以上的胚胎定為D級(jí)。5胎盤(pán)保護(hù)許多優(yōu)秀供體的胚胎常經(jīng)液氮冷凍保存多年。用于冷凍保存的胚胎是經(jīng)質(zhì)量鑒定的A、B級(jí)胚胎。現(xiàn)有的牛胚胎冷凍方法有五種5.1冷凍保護(hù)液l2具體步驟為①在室溫下,胚胎放入小分子滲透性冷凍保護(hù)劑中,如:乙二醇、甘油、DMSO或丙二醇中直到胚胎冷凍保護(hù)液達(dá)到平衡;②在-5℃到-7℃誘發(fā)結(jié)晶(植冰);③以0.2℃~2.0℃/min速度冷凍;④在-35℃到-75℃時(shí)浸入LN2并保存在LN2中;⑤以大約250℃/min(如25℃靜止水浴)解凍;⑥在培養(yǎng)或轉(zhuǎn)移前室溫下脫冷凍劑。為確保冷凍胚胎存活率,嚴(yán)格按照冷凍程序進(jìn)行冷凍是非常重要的。5.2細(xì)管路解凍法Loibo,SP(1984)發(fā)明了牛胚胎一步細(xì)管冷凍保存法,方法為:將冷凍液(1.5mol/L甘油)和解凍液(0.5~1.0mol/L蔗糖)放在同一細(xì)管內(nèi):兩種液體用氣柱分開(kāi),解凍時(shí),輕輕搖動(dòng)細(xì)管使兩種液體混合,由于蔗糖是高滲溶液,使甘油從牛胚胎內(nèi)脫出。這種方法不需要顯微鏡觀(guān)察,直接把胚胎移入母畜體內(nèi),胚胎進(jìn)入子宮后,通過(guò)吸收子宮水份而使其恢復(fù)到最初的等滲體積狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),這種方法受體牛妊娠率不穩(wěn)定。主要原因是:①在細(xì)管內(nèi)冷凍液和解凍液難以混合;②胚胎易粘在細(xì)管棉塞上造成丟失;③當(dāng)解凍溫度升高時(shí),高濃度蔗糖對(duì)胚胎發(fā)育有害。5.3冷凍保護(hù)劑的使用考慮到甘油冷凍劑分子量高和對(duì)細(xì)胞膜通透性差的特點(diǎn),Hernandez-Ledezma,JJ(1988)等提出使用高滲透性、低毒性的冷凍保護(hù)劑如乙二醇或丙二醇對(duì)一步細(xì)管法冷凍保存牛胚胎進(jìn)行了改進(jìn),該方法為直接用1.4M乙二醇進(jìn)行牛胚胎冷凍,冷凍和解凍方法同傳統(tǒng)方法。不同之處,是解凍后將胚胎連同冷凍保護(hù)劑一起直接移植到母畜體內(nèi),不需要搖動(dòng)細(xì)管使冷凍和解凍液混合(未有解凍液)。這種方法具有不需要特定的儀器設(shè)備、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,總的牛胚胎移植妊娠率接近傳統(tǒng)的冷凍保存方法。該冷凍是牛胚胎移植產(chǎn)業(yè)化最理想的方法之一。5.4b.使用方法顧名思義,該方法主要加快了冷凍速度,由傳統(tǒng)冷凍法250℃/min提高到1250℃/min,這樣使冷凍時(shí)間由過(guò)去的3h縮短到30min(Rayos,1992;Shaw,1991),使用方法是利用2~4.5mol/L滲透性冷凍保存液如甘油、乙二醇,DOSO或乙二醇與0.25~0.5mol/L滲透性冷凍保存液如蔗糖、海藻糖、半乳糖或乳糖混合物作為哺乳動(dòng)物胚胎冷凍保存液,平衡30s到3min后,處于部分脫水胚胎放入液氮蒸氣中冷凍后浸入LN2中。在快速冷凍過(guò)程中,細(xì)胞外水份被冷凍,同時(shí)提高冷凍液的滲透壓,促使細(xì)胞水份進(jìn)一步滲出。利用此法冷凍胚胎,細(xì)胞內(nèi)有可能形成冰晶。在解凍過(guò)程中如果解凍速度不當(dāng)會(huì)造成胚胎損傷,牛胚胎快速冷凍后存活率為33.3%,低于傳統(tǒng)的快速冷凍法和玻璃化冷凍方法(NiemannH,1986)。5.5冷凍保護(hù)劑的配制是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的方法。將胚胎在適當(dāng)?shù)睦鋬霰Ｗo(hù)劑混合液中作短暫處理后,直接投入液氮。冷凍保護(hù)劑在急劇降溫到很低溫度時(shí)能被濃縮而不結(jié)晶,而且液體的粘性增強(qiáng),由液態(tài)變?yōu)橥该鞯墓虘B(tài),形成玻璃化。用這種方法冷凍,無(wú)需凍前分步添加抗凍劑和凍后分步脫除抗凍劑的繁瑣步驟,簡(jiǎn)化了冷凍過(guò)程,是一種簡(jiǎn)便、快速、有效的冷凍方法,不需要冷凍儀器。6胚胎移植6.1群發(fā)發(fā)發(fā)發(fā)酵液h要求受體牛發(fā)情時(shí)直腸檢查的卵泡直徑在10~20mm左右,發(fā)情后36h出現(xiàn)排卵。移植前檢查黃體,其直徑在11~15mm以上,黃體的手感性好,質(zhì)地軟而充實(shí)。6.2主管稅的處理用2%普魯卡因2~5mL實(shí)施1~2尾椎間隙硬膜外腔麻醉,系尾,清洗外陰,用高錳酸鉀水沖洗消毒,用滅菌紙擦干,最后用酒精棉球消毒。6.3嬰兒選擇根據(jù)受體牛的發(fā)情天數(shù)選擇不同胚齡的胚胎。一般將致密桑椹胚、早期囊胚和囊胚分別移植給發(fā)情6d、7d、8d的發(fā)情母牛。6.4中間有測(cè)定胚胎移植時(shí)可用0.25mL吸管分三段吸入PBS保存液,中間由兩個(gè)氣泡隔開(kāi),中段含有胚胎。剪去封口端,輕輕甩向棉塞端,裝槍,把移植槍推入黃體一側(cè)的子宮角,并使其深入到子宮角的大彎部,持移植槍的右手推出胚胎,緩慢旋轉(zhuǎn)地抽出移植槍。7明移植失敗后的妊娠和妊娠診斷在移植后第12~15d觀(guān)察受體牛發(fā)情返情情況。若牛出現(xiàn)返情,則表明移植失敗;如未發(fā)情,繼續(xù)觀(guān)察3~5個(gè)情期,并在適宜時(shí)期進(jìn)行妊娠診斷,通常用直腸檢查法在移植3個(gè)月時(shí)檢查。在妊娠90d時(shí),子宮繼續(xù)增大,落入腹腔,可感覺(jué)胎兒的浮動(dòng),孕角出現(xiàn)孕脈,有時(shí)可觸摸到子葉。8技術(shù)應(yīng)用的問(wèn)題和應(yīng)用前景8.1操作要點(diǎn)一:反思分,確定最佳位置,確?；炷猎隗w我國(guó)胚胎移植技術(shù)起步較晚,目前牛胚胎移植技術(shù)在推廣在中還存在一些問(wèn)題:①是專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員缺乏,因?yàn)樵诓僮鬟^(guò)程中,大部分環(huán)節(jié)要靠操作者嫻熟的操作技能把握分寸,確定最佳時(shí)機(jī)、最佳位置,以取得最佳效果;②是胚胎移植費(fèi)用較高,限制了它的大量推廣;③是純種動(dòng)物胚胎來(lái)源主要靠超排,由于無(wú)法完全掌握其規(guī)律,還不能預(yù)測(cè)超排結(jié)果,不同個(gè)體對(duì)超排處理的反應(yīng)差異較大,排卵率不夠穩(wěn)定;④是胚胎回收率低,通常在50%~8