外標法測定陳皮中橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的含量

外標法測定陳皮中橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的含量

氨基皮膚具有理氣健脾、除濕散粘液的功效。它對心血管系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、氧化和抗衰老都有一定的藥理作用。它的化學成分主要分為揮發(fā)油和黃酮類。黃酮類成分主要包括橙皮苷、川橙皮素、桔皮素、柚皮苷等,其中前3種黃酮類成分在陳皮中含量較高,同時均具有較強的抗氧化和抗癌活性,是陳皮重要的活性成分。陳皮所含成分復雜,功效多樣,《中國藥典》2010年版一部陳皮以含量較高的橙皮苷單一成分作為檢測指標,難以體現(xiàn)陳皮多成分、多功效的特點,且僅以單一成分控制質(zhì)量,不能較好的說明陳皮的內(nèi)在質(zhì)量。因此,多指標的含量測定顯得更為科學可靠。王智民提出的“一測多評”用于多指標的測定,近年來已經(jīng)用于黃連、補骨脂、虎杖、干姜等中藥的質(zhì)量評價,其中黃連“一測多評”的含量測定方法已收入《中國藥典》2010年版,具有重要的指導意義。本文采用“一測多評”法實現(xiàn)陳皮多指標的質(zhì)量控制,以橙皮苷作為指標,計算出川陳皮素、桔皮素與橙皮苷的相對校正因子,從而計算得出川陳皮素和桔皮素的含量。并采用外標法和“一測多評”法同時測定22批陳皮樣品中3種黃酮的含量,比較其結(jié)果進行驗證,最終建立陳皮中3種黃酮類物質(zhì)“一測多評”的方法。1藥物、藥品與對照品LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津),1200型高效液相色譜儀(美國Agilent),BP211DAG型電子天平(德國賽多利斯)。陳皮藥材購于廣州省新會市多個產(chǎn)區(qū)及荷花池中藥材市場,由成都中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室成都中醫(yī)藥大學中藥標本中心盧先明教授鑒定為正品CitrusreticulateBlanco。橙皮苷(批號110902)、川陳皮素(批號120719)、桔皮素(批號120912)對照品均由四川省維克奇生物科技有限公司提供,3種對照品均供含量測定用,純度≥98%。乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1混合對照品溶液精密稱取橙皮苷、川陳皮素、桔皮素對照品適量,置10mL量瓶中,加甲醇溶解,即得質(zhì)量濃度分別為0.398,0.101,0.106g·L-1的混合對照品溶液。2.2超聲法制備法取陳皮粉末約0.5g,置于具塞錐形瓶中,精密加甲醇40mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲(功率250W,頻率40kHz)30min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。2.3酸水b梯度洗脫DiamonsilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動相乙腈(A)-2%乙酸水(B)梯度洗脫(0~25min,20%~40%A;25~30min,40%~50%A;30~50min,50%~60%A),流速1.0mL·min-1,柱溫25℃,檢查波長283nm(橙皮苷),326nm(橙皮苷、川陳皮素、桔皮素)。該色譜條件下,各檢測組分分離度良好,見圖1。2.4線性回歸分析精密吸取2.1項下的混合對照品溶液2,4,8,12,16,20μL,進樣分析,以進樣量對峰面積積分值進行線性回歸,結(jié)果表明各成分在相應的范圍內(nèi),線性關系良好,見表1。2.5精密度測試2.6重復性試驗取同一批陳皮粉末約0.5g,精密稱定,按2.2項下操作,平行制備6份供試品溶液,測得橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的平均含量分別為3.97%,0.42%,0.46%,RSD分別為1.21%,1.46%,1.28%,表明重復性良好。2.7穩(wěn)定性試驗2.8加樣回收率試驗取同一批已知含量的陳皮粉末0.5g,精密稱定,平行6份,分別精密加入橙皮苷、川陳皮素、桔皮素對照品,按2.2項下制備供試液,測定,計算橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的加樣回收率,見表2。2.9川陳皮素、姜片和橙皮苷相對校正因子的測定精密吸取混合對照品溶液10μL,連續(xù)進樣6次,以326nm檢測波長下所測得3種成分的峰面積計算川陳皮素、桔皮素與橙皮苷的相對校正因子,計算公式:,結(jié)果見表3。2.10峰定位各成分“一測多評”僅利用一種對照品作為內(nèi)標物質(zhì),在沒有其他對照品的情況下,通過相對校正因子計算多種成分的含量。因此,準確地定位各成分的色譜峰是計算各成分含量的必要前提。據(jù)文獻報道,可通過保留時間差和相對保留值進行峰定位,結(jié)果見表4。據(jù)結(jié)果可知,兩種定位方法的RSD<3%,說明這兩種定位方法均能準確判斷川陳皮素、桔皮素色譜峰的位置。2.11相對校正因子的重復研究2.11.色譜條件進樣測定精密吸取2.1項下的混合對照品溶液各10μL,利用不同的液相色譜儀和色譜柱,按2.3項下的色譜條件進樣分析,計算相對校正因子,結(jié)果見表5。結(jié)果表明不同的液相色譜儀和色譜柱對相對校正因子沒有顯著影響。2.11.計算流速對各相對校正因子的影響精密吸取2.1項下的混合對照品溶液各10μL,計算流速分別為1,1.1mL·min-1時的相對校正因子,結(jié)果見表6。表明不同流速時對相對校正因子沒有顯著影響。2.11.計算柱溫不同30時的相對校正因子精密吸取2.1項下的混合對照品溶液各10μL,計算柱溫分別為25,30℃時的相對校正因子,結(jié)果見表7。表明不同的柱溫對相對校正因子沒有顯著影響。2.12陳皮中橙皮苷、川陳皮素、瞳皮素的含量精密吸取供試品溶液10μL,注入高效液相色譜儀,記錄峰面積。分別采用外標法和“一測多評”法計算陳皮中橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的含量,結(jié)果見表8。據(jù)結(jié)果可知,兩種方法測得的各成分含量間沒有顯著差異,說明該“一測多評”法測定陳皮中的陳皮苷、川陳皮素、桔皮素準確可靠。3精密度、穩(wěn)定性及與保留值的比較陳皮飲片的品種多樣,據(jù)以上試驗數(shù)據(jù)可知,各品種間除橙皮苷含量差異較大外,其余兩種成分含量差異也很大。橙皮苷是陳皮中含量最高的黃酮類成分,也是《中國藥典》2010年版規(guī)定的指標檢測成分,其對照品也容易獲得,因此選其作為“一測多評”的指內(nèi)標物。本試驗驗證了在不同條件下(色譜儀、色譜柱、流速、柱溫),相對校正因子均無明顯影響。采用了兩種方法定位色譜峰,試驗結(jié)果表明,保留時間差法和相對保留值法均能準確定位色譜峰,但相對保留值法應用更為廣泛,且RSD更小,因此筆者采用相對保留值定位色譜峰。采用外標法和“一測多評”測定了22批陳皮飲片的3種黃酮含量,結(jié)果表明兩種方法測得的含量無明顯差異,說明該“一測多評”法準確可靠。精密吸取混合對照品溶液10μL,連續(xù)進樣6次,記錄橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的峰面積,其峰面積的RSD分別為0.52%,0.67%,1.02%,表明精密度良好。精密吸取同一供試品溶液10μL,分別于0,2,4,6,8,12,24,36h進樣,測定橙皮苷、川陳皮素、桔皮素峰面積,其峰面積的RSD分別為1.21%,1.36%,2.01%,表明供試品溶液在36h內(nèi)穩(wěn)定性良好。本實驗中所用的陳皮飲片種類多樣,有新鮮紺青皮、二紅皮、大紅皮及不同貯存年限的大紅皮(廣陳皮和川陳皮),從試驗的數(shù)據(jù)初步看出陳皮的不同采收期、貯存年限以及產(chǎn)地對其成分的含量有一定影響,但由于本試驗樣品量過少,不能說明其具體的影響規(guī)律,該問題有待進一步研究。據(jù)文獻報道,陳皮中還含有少