生化綜合性試驗

PAGEPAGE6實驗四十五胃蛋白酶在水溶液和有機溶劑中的動力學測定一．目的和要求1學習并掌握胃蛋白酶活性測定的基本原理。2掌握在水相和有機相中胃蛋白酶Km、Vmax測定的實驗設計和測定原理。3學習和理解酶促反應動力學曲線的實驗設計和實驗方法。4熟練掌握紫外分光光度計的使用方法。二．實驗原理近幾年，酶在有機介質中催化反應的研究十分活躍，日益增多的研究報導和綜合評述展示了有機溶劑中的酶優(yōu)于水相酶的巨大應用潛力。而酶在有機介質中催化活性的充分發(fā)揮和催化選擇性的調(diào)節(jié)與控制是有機溶劑中酶催化研究的重要基礎與核心。有機溶劑中的酶催化已經(jīng)進行了四種體系的研究：a.單相共溶劑體系(水/水溶性溶劑；b.水-有機溶劑兩相體系；c.微水有機溶劑體系；d.反向膠束體系（reversedmicelles）。有機相中酶促反應的過程、機制與水溶液中是相同的，符合米氏方程、乒乓反應機制。米氏酶在非水介質中的反應符合Michaelis-Menten公式，影響有機介質中酶促反應動力學變化的因素涉及底物和溶劑的性質。酶和溶劑競爭底物，如果底物與溶劑的親和性高，則底物與酶的親和力低，Km大；如果底物與溶劑的親和力低，則酶與底物的親和力高，Km小。胃蛋白酶（Pepsin）是一種巰基蛋白酶，它分解比胰臟蛋白水解酶更多、更廣泛的蛋白底物，它也具有脂酶活力。其分子量約為23000~35000。酪蛋白是一種蛋白質，它被蛋白酶降解生成的酪氨酸，在紫外光區(qū)275nm處有吸收峰，根據(jù)測定275nm處的吸收值，可以判定蛋白酶的活力。吸收值的大小與酪氨酸含量的多少有關，吸收值大說明酪氨酸含量高，也就是說胃蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。在保持恒定的合適條件（時間、溫度及pH、激活劑）下以同一濃度的胃蛋白酶催化不同濃度的底物酪蛋白分解，于一定限度內(nèi)，酶促反應速度與酪蛋白濃度成正比。因此，用酶促反應速度倒數(shù)（l/V）為縱坐標，酪蛋白濃度倒數(shù)（l/[S]）為橫坐標，用雙倒數(shù)作圖法可以計算得到胃蛋白酶在水相和有機相中的Km、Vmax。胃蛋白酶活性（反應速度v）定義：蛋白酶催化酪蛋白水解，每分鐘使生成的酪氨酸的A275nm上升0.01為1個酶活力單位（U）。胃蛋白酶比活力定義：每毫克（mg）蛋白中具有的催化活力，U/mg。該胃蛋白酶的純度達到電泳純（PAGE1條電泳帶），所以可以直接使用實驗所稱的毫克數(shù)為胃蛋白酶的蛋白含量（mg）。三．實驗儀器和用品1實驗儀器：（1）紫外分光光度計（石英比色杯）（3~4臺），（2）水浴鍋（2~3臺），（3）電子天平（2臺），（4）臺式天平（離心平衡用）（2臺），（5）冰箱（1臺）。2實驗用品：（1）以組為單位帶塞試管（30支），試管架（2個），100mL燒杯（2個），200mL燒杯（1個），吸管（2支）、玻棒（1支），移液管或移液槍5mL（1支）、1mL（2支）、0.5mL（1支）、0.2mL（1支），漏斗（3個），濾紙（1盒），100mL量筒（1個），蒸餾水瓶（1個），標簽紙。（2）全班共用1000mL試劑瓶（7個），250mL試劑瓶（3個），1000mL燒杯（4個），2000mL塑料燒杯（2個），1000mL量筒（2個），500mL量筒（2個），容量瓶250mL（1個）、100mL（1個），pH廣泛試紙（1~2？？），剪刀（2個），電爐和鍋（2-3個），蒸餾水容器（50L）（1四．實驗材料和試劑配制1實驗材料：市售胃蛋白酶2試劑配制：（1）全班共用試劑：①1mol/LHCl溶液1000mL：取濃鹽酸84mL，用量筒定容至1000mL，配制成1mol/L的鹽酸溶液。②1mol/LNaOH溶液100mL：取4gNaOH（2）6個小組為一個大組，共用以下試劑：③0.065mol/L的HCl溶液：取1mol/L的鹽酸溶液65mL，加蒸餾水用量筒定容至1000mL，配制成0.065mol/L的鹽酸溶液。④2.4%（W/V）酪蛋白：配500mL。稱2.4g酪蛋白，加入80mL蒸餾水，55℃水浴加熱，邊攪拌邊加入1.6mL1mol/L的NaOH助溶，待酪蛋白完全溶解后，迅速加入4.8mL1mol/LHCl使pH值至1.5，邊快速加入HCl邊攪拌，使酪蛋白溶解，然后用容量瓶加蒸餾水定容至100mL。1）1.2%（W/V）酪蛋白：配100mL。取50mL2.4%酪蛋白，用0.065mol/L的鹽酸溶液于量筒定容到100mL。2）0.6%（W/V）酪蛋白：配100mL。取50mL1.2%酪蛋白，用0.065mol/L的鹽酸溶液于量筒定容到100mL。3）0.3%（W/V）酪蛋白：配100mL。取50mL0.6%酪蛋白，用0.065mol/L的鹽酸溶液于量筒定容到100mL。4）0.15%（W/V）酪蛋白：配100mL。取50mL0.3%酪蛋白，用0.065mol/L的鹽酸溶液于量筒定容到100mL。⑤20%（W/V）三氯乙酸（TCA）：配500mL。稱20gTCA溶解于蒸餾水，并用量筒定容至100mL。⑥48%（V/V）丙三醇溶液：配100mL。量取48mL無水丙三醇，加0.065mol/L的鹽酸溶液于量筒定容至100mL。⑦配不同濃度二甲基亞砜（DMOS）：1）24%（V/V）DMOS：配200mL。量取24mLDMOS，用0.065mol/L的鹽酸溶液于量筒定容至100mL。2）48%（V/V）DMOS：配100mL。量取48mLDMOS，用0.065mol/L的鹽酸溶液于量筒定容至100mL。3）72%（V/V）DMOS：配100mL。量取72mLDMOS，用0.065mol/L的鹽酸溶液于量筒定容至100mL。五．實驗步驟12mg/mL胃蛋白酶制備（300mL/6個小組）精確稱取200mg胃蛋白酶粉，用0.065mol/L鹽酸溶液溶解并于容量瓶定容至100mL，即得2mg/mL的胃蛋白酶液。2不同濃度DMSO（二甲基亞砜）對胃蛋白酶的活性影響按表1加試劑和操作，各種濃度的有機溶劑分別以相對應的CK管做空白調(diào)零。表1不同濃度DMSO對胃蛋白酶的活性影響有機溶劑終濃度（％）0102030試管號CK11CK22CK33CK442.4%酪蛋白(mL)02020202不同濃度DMSO(mL)002(24%)2(24%)2(48%)2(48%)2(72%)2(72%)0.065mol/LHCl(mL)2200000020%TCA(mL)222237℃恒溫水浴，準確保溫102mg/mL胃蛋白酶液(mL)0.80.80.80.80.80.80.80.837℃恒溫水浴，準確反應1020%TCA(mL)020202022.4%酪蛋白(mL)20202020反應總體積（mL）6.86.86.86.86.86.86.86.8過濾A275nm酶活性（U）U=100×A275nm/t3在水相中胃蛋白酶水解酪蛋白的Km和Vmax（采用雙倒數(shù)作圖法）按表2加試劑和操作，在水相中，測定不同的底物（酪蛋白）濃度與反應速度（v）的變化。本組實驗各底物濃度均以1號管調(diào)零，t為分鐘。用酶促反應速度倒數(shù)（l/V）為縱坐標，酪蛋白濃度倒數(shù)（l/[S]）為橫坐標，用雙倒數(shù)作圖法得胃蛋白酶在水相中的Km、Vmax值。表2在水相中不同濃度的胃蛋白酶水解酪蛋白的反應速度測定組數(shù)123456底物終濃度（mg/mL）00.6251.252.55.0100.065mol/LHCl(mL)222222不同濃度酪蛋白(mL)02(0.15%)2(0.3%)2(0.6%)2(1.2%)2(2.4%)20%TCA(mL)20000037℃恒溫水浴，準確保溫102mg/mL胃蛋白酶液（mL）0.80.80.80.80.80.837℃恒溫水浴，準確反應1020%TCA（mL）0222222.4%酪蛋白(mL)200000過濾總體積（mL）6.86.86.86.86.86.8A275nm[s]（mg/mL）1/[s]V=A275nm/t1/VKm(mg/mL)Vmax4在10%DMSO有機相中胃蛋白酶水解酪蛋白的Km和Vmax（采用雙倒數(shù)作圖法）按表3加試劑和操作：在有機相DMSO中，測定不同的底物（酪蛋白）濃度與反應速度（v）的變化。本組實驗各底物濃度均以1號管調(diào)零，t為分鐘。用酶促反應速度倒數(shù)（l/V)為縱坐標，酪蛋白濃度倒數(shù)（l/[S])為橫坐標，用雙倒數(shù)作圖法得胃蛋白酶在水相中的Km、Vmax值。表3在10%DMSO有機相中不同胃蛋白酶水解酪蛋白的反應速度測定組數(shù)123456底物終濃度(mg/mL)00.06250.1250.250.501.0不同濃度酪蛋白(mL)02(0.15%)2(0.3%)2(0.6%)2(1.2%)2(2.4%)24%的DMSO(mL)22222220%TCA(mL)20000037℃恒溫水浴，準確保溫10胃蛋白酶液（mL）0.80.80.80.80.80.837℃恒溫水浴，準確反應1020%TCA（mL）0222222.4%酪蛋白(mL)200000過濾總體積（mL）6.86.86.86.86.86.8A275nm[s]（mg/mL）1/[s]V=A275nm/t1/VKm(mg/mL)Vmax5在20%丙三醇中胃蛋白酶水解酪蛋白的Km和Vmax（采用雙倒數(shù)作圖法）按表4加試劑和操作：在20%丙三醇有機相中，測定不同的底物（酪蛋白）濃度與反應速度（v）的變化。本組實驗各底物濃度均以1號管調(diào)零，t為分鐘。用酶促反應速度倒數(shù)（l/V)為縱坐標，酪蛋白濃度倒數(shù)（l/[S]）為橫坐標，用雙倒數(shù)作圖法得胃蛋白酶在20%丙三醇中的Km、Vmax值。表4在20%丙三醇有機相中不同胃蛋白酶水解酪蛋白的反應速度測定管號123456底物終濃度(mg/mL)00.06250.1250.250.501.048%丙三醇(mL)222222不同濃度酪蛋白(mL)02(0.15%)2(0.3%)2(0.6%)2(1.2%)2(2.4%)20%TCA(mL)20000037℃恒溫水浴，準確保溫10胃蛋白酶液（2mg/mL）（mL）0.80.80.80.80.80.837℃恒溫水浴，準確反應1020%TCA（mL）0222222.4%酪蛋白(mL)200000過濾總體積（mL）6.86.86.86.86.86.8[s]（mg/mL）A275nm1/[s]V=A275nm/t1/VKm(mg/ml)Vmax六．結果與計算1根據(jù)雙倒數(shù)作圖法，可求出胃蛋白酶在水相中的Km和Vmax。2根據(jù)雙倒數(shù)作圖法，可求出胃蛋白酶在有機相DMSO中的Km和Vmax。3根據(jù)雙倒數(shù)作圖法，可求出胃蛋白酶在有機相丙三醇中的Km和Vmax。4根據(jù)雙倒數(shù)作圖法，可求出水相及有機溶劑中胃蛋白酶的動力學參數(shù)Vmax、Km，分別填于表5中，試分析它們之間的差異。表5水相及有機溶劑中胃蛋白酶的動力學參數(shù)反應體系Vmax（U）Km（mg/mL）水相10%DMSO20%丙三醇七．注意事項1配制酪蛋白溶液時，一定要按要求操作，加鹽酸一定要快速，邊快速加入HCl邊攪拌，才能使酪蛋白溶解，否則，會使溶解的酪蛋白出現(xiàn)沉淀。2要確保酶促反應的時間，根據(jù)酶活動定義計算酶的活力。