家蠶轉(zhuǎn)基因顯微注射蠶卵解除方法的比較

家蠶轉(zhuǎn)基因顯微注射蠶卵解除方法的比較

自2000年，一些國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)成功獲得了從pig-gybac轉(zhuǎn)變座位上獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)移家蠶。這種以piggyBac為介導(dǎo)的外源DNA導(dǎo)入技術(shù)后幾經(jīng)改進(jìn),已成為迄今制作轉(zhuǎn)基因蠶的最主要和有效方法,并在家蠶基因功能研究、遺傳素材創(chuàng)新和生物反應(yīng)器開發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。目前,家蠶轉(zhuǎn)基因研究首選的受體材料主要為多化性家蠶品種(如Nistari和pnd-w1等)的卵。家蠶多化性品種所產(chǎn)蠶卵在適宜的環(huán)境條件下經(jīng)10d左右即可孵化,世代周期相對較短,可全年采用桑葉或人工飼料飼育,從而極大地方便了轉(zhuǎn)基因操作和后續(xù)分析。但就其實(shí)用性而言,基于多化性家蠶品種轉(zhuǎn)基因的局限性也非常明顯:多化性品種的經(jīng)濟(jì)性狀差,利用其創(chuàng)造的轉(zhuǎn)基因素材很難達(dá)到實(shí)用家蠶品種(多為二化性品種,具有滯育期)的經(jīng)濟(jì)性狀;多化性品種不具有滯育期,利用其制作的轉(zhuǎn)基因蠶必須依靠連續(xù)的飼養(yǎng)繁殖方能維持和繼代,從而增加了生產(chǎn)成本和轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)丟失的風(fēng)險(xiǎn)。這些問題也是基于多化性家蠶品種獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶只能作為基礎(chǔ)研究和育種原始材料,而難以在生產(chǎn)中直接推廣應(yīng)用的根本原因。因此,從家蠶品種分子改良應(yīng)用的實(shí)際需求出發(fā),盡快建立實(shí)用家蠶品種有效轉(zhuǎn)基因技術(shù),尤為必要。建立實(shí)用家蠶品種轉(zhuǎn)基因技術(shù),首要技術(shù)環(huán)節(jié)是建立高效的適合于顯微注射的蠶卵滯育解除的方法,研究人員為此進(jìn)行了許多探索。唐順明等采用低溫催青和浸酸方法比較了二化性家蠶品種(品系)轉(zhuǎn)基因用蠶卵的滯育解除效果;Inoue等采用即時(shí)浸酸方法解除二化性突變品系Nd-sD卵的滯育并注射獲得了轉(zhuǎn)基因家蠶。上述研究為建立實(shí)用家蠶品種轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供了有用參考。本研究以現(xiàn)行生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的優(yōu)良家蠶品種為材料,采用不同的蠶卵滯育解除方法,探索解決二化性家蠶品種轉(zhuǎn)基因注射蠶卵不能及時(shí)和高效孵化的難題,完善實(shí)用家蠶品種的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系,為下一階段開展其分子改良,創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)異的新型家蠶品種提供技術(shù)支撐。1材料和方法1.1供試品種及試劑供試家蠶品種為二化性,其中7532、湘輝由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站提供,871、872、洞·庭、碧·波、秋豐由重慶市北碚蠶種場提供,對照品種P50由本研究室保存。piggyBac供體質(zhì)粒pBac[3×P3DsRedaf]、pBac[3×P3EGFPafm]和輔助質(zhì)粒pHA3PIG由本研究室改建或保存,注射質(zhì)粒DNA采用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGEN公司產(chǎn)品)抽提。1.2蠶卵的沖洗和低溫催青分別采用3種方法解除供試家蠶品種蠶卵的滯育。早期浸酸(參照文獻(xiàn)的方法并改進(jìn)):收集產(chǎn)下后2.5h的蠶卵,用15.16%HCl于46℃水浴處理2.5min,然后用自來水沖洗蠶卵約10min。低溫催青(參照文獻(xiàn)的方法并改進(jìn)):經(jīng)長期冷藏或即時(shí)浸酸處理后解除滯育的當(dāng)代蠶卵于15℃低溫環(huán)境中催青,孵化幼蟲置于25℃、相對濕度75%的環(huán)境中飼育。復(fù)式催青按下述方法對催青溫度和飼育環(huán)境進(jìn)行優(yōu)化:經(jīng)長期冷藏或即時(shí)浸酸處理后解除滯育的當(dāng)代蠶卵于15℃黑暗環(huán)境中催青,孵化幼蟲在1~3齡期間置于23℃黑暗環(huán)境中飼育,隨后轉(zhuǎn)移至27℃光照環(huán)境中飼育,化蛹后取出蛹體置于25℃光照環(huán)境中直至化蛾。1.3質(zhì)粒的制備和注射將交配后的雌蛾投放于上漿的牛皮紙上,保持其在黑暗的環(huán)境中產(chǎn)卵。收集產(chǎn)下后2h左右的蠶卵依次排列于載玻片上(約100粒/片),經(jīng)35%~37%甲醛蒸氣消毒2~3min后進(jìn)行顯微注射。按n(供體質(zhì)粒)∶n(輔助質(zhì)粒)=1∶1混合注射質(zhì)粒,并配制為終濃度400ng/μL注射質(zhì)粒液,每粒蠶卵注射10~15nL,注射后采用無毒膠水(instantstronggluemini,日本Fukui公司產(chǎn)品)封閉注射孔,經(jīng)甲醛蒸氣再次消毒2~3min后,置于25℃、相對濕度90%的條件下催青。孵化幼蟲(G0代)采用桑葉或人工飼料飼育。將G0代的蠶蛾采用自交或回交制種,獲得的G1代蠶卵于點(diǎn)青期前1d置于體視熒光顯微鏡(Olympus,日本)下檢測,篩選在眼睛或神經(jīng)組織(3×P3啟動(dòng)子的特性)發(fā)熒光的轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體,以蛾圈為單位單獨(dú)飼育。2結(jié)果與分析2.1不同品種蠶卵滯育解除率的比較對供試家蠶品種P50、871、872、碧·波產(chǎn)下卵采用早期浸酸方法處理,統(tǒng)計(jì)其孵化率,結(jié)果如表1所示:早期浸酸解除了4個(gè)家蠶品種產(chǎn)下蠶卵的滯育,但滯育解除效果均低于預(yù)期,且導(dǎo)致了較多的死卵;不同家蠶品種蠶卵的滯育解除率有較大差異,其中碧·波>872>871>P50;日系品種(872、碧·波)的孵化率高于中系品種(P50、871),推測這可能是因二者遺傳背景不同和卵殼構(gòu)造差異所致。以872和碧·波產(chǎn)下卵為材料,經(jīng)早期浸酸處理后立即進(jìn)行轉(zhuǎn)基因注射,結(jié)果表明(表2):顯微注射后蠶卵的孵化率均不足2.00%,遠(yuǎn)低于未經(jīng)注射的蠶卵孵化率;只有從碧·波的2個(gè)批次中篩選出了陽性個(gè)體,但陽性蛾圈率較低,僅為4.35%和7.14%。這可能是因早期浸酸處理延誤了最佳注射時(shí)間(蠶卵產(chǎn)下后2~3h注射最佳),以致外源piggyBac發(fā)生轉(zhuǎn)座整合的概率大大降低甚至不發(fā)生整合。2.2中系蠶卵滯育解除率檢測對供試家蠶品種的蠶卵采用15℃低溫催青,以25℃常溫催青作為對照,結(jié)果顯示(圖1):4個(gè)中系品種P50、871、秋豐和洞·庭的蠶卵經(jīng)15℃低溫催青后,其子代卵均可解除滯育,滯育解除率分別達(dá)到100%、100%、96.83%和91.89%,而對照組蠶卵的滯育解除率低于2.00%,說明15℃低溫環(huán)境條件更容易誘發(fā)滯育性蠶卵解除滯育,使胚胎發(fā)育;日系品種與中系品種之間的滯育解除存在顯著的差異,日系品種872和碧·波子代卵的滯育解除率僅為19.44%和11.11%,25℃條件下未能解除蠶卵滯育,推測可能溫度以外的其它環(huán)境因子的影響對日系蠶品種蠶卵的滯育有效解除更為重要。以中系品種P50、871和秋豐的蠶卵為材料,經(jīng)15℃低溫催青后,正常飼養(yǎng),取子代蠶卵進(jìn)行轉(zhuǎn)基因顯微注射,結(jié)果如表3所示:顯微注射后P50的孵化率有所降低,871和秋豐的孵化率則顯著降低,可見顯微注射操作對蠶品種蠶卵的孵化率仍有較大影響;3個(gè)家蠶品種均篩選獲得了陽性個(gè)體,P50的陽性蛾圈率較高,871和秋豐因可供檢測的蛾圈數(shù)很少,尚難評價(jià)其轉(zhuǎn)基因效率。2.3滯育解除率及轉(zhuǎn)導(dǎo)率為更有效地解除實(shí)用家蠶品種蠶卵的滯育,提高其轉(zhuǎn)基因效率,進(jìn)一步優(yōu)化催青條件,對供試家蠶品種蠶卵進(jìn)行復(fù)式催青,結(jié)果表明(圖2):采用優(yōu)化后的復(fù)式催青方法,中系品種P50、871、秋豐和洞·庭子代卵的滯育解除率達(dá)到100%;日系品種872、碧·波、湘輝和7532子代卵的滯育解除率也分別達(dá)到94.74%、80.00%、77.42%和82.16%,顯著優(yōu)于15℃低溫和25℃常溫催青方法,整體優(yōu)于早期浸酸方法。以經(jīng)復(fù)式催青后的碧·波、湘輝和7532的子代卵為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn),結(jié)果如表4所示。盡管因顯微注射等機(jī)械損傷,注射后蠶卵的孵化率(33.79%~63.78%)有所降低,但完全可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。從3個(gè)供試家蠶品種中均篩選獲得了陽性個(gè)體,陽性蛾圈率達(dá)25.00%左右,與多化性蠶品系的轉(zhuǎn)基因效率相當(dāng),表明基于復(fù)式催青的顯微注射轉(zhuǎn)基因方法是可行和有效的。3家蠶品種自身滯育特性及轉(zhuǎn)化學(xué)成分的檢測與分析家蠶品種是蠶業(yè)生產(chǎn)中最為重要的生產(chǎn)資料,決定著蠶絲產(chǎn)量、品質(zhì)乃至行業(yè)整體效益。隨著家蠶全基因組序列的測定和功能基因的發(fā)掘,蠶絲產(chǎn)業(yè)對利用轉(zhuǎn)基因等技術(shù)進(jìn)行實(shí)用家蠶品種分子改良,促進(jìn)功能基因研究成果早日應(yīng)用于生產(chǎn)的需求愈顯迫切。基于此,本研究在前期建立了多化性蠶品系Nistari和二化性品系P50有效轉(zhuǎn)基因技術(shù)基礎(chǔ)上,從首先打破蠶卵的滯育著手,成功建立了基于復(fù)試催青解除蠶卵滯育方法的實(shí)用家蠶品種有效轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。滯育是家蠶等生物物種積極適應(yīng)不良環(huán)境和保持種族綿延的重要生物學(xué)特性。經(jīng)過數(shù)千年的選擇和馴化,家蠶已形成性狀迥異的品種資源類群,并在繭絲產(chǎn)量與品質(zhì)等主要經(jīng)濟(jì)性狀表現(xiàn)出了明顯的地域依賴性或偏好性。特別是因?qū)ψ匀画h(huán)境條件的敏感,包括現(xiàn)行推廣的家蠶品種在內(nèi),許多家蠶品種(品系)均表現(xiàn)出滯育特性,這為實(shí)用家蠶品種轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其分子改良研究帶來了極大困難。一是遺傳親本來源的復(fù)雜性和地理環(huán)境的選擇作用賦予了各類家蠶品種以不同的滯育特性,從而產(chǎn)生了胚胎發(fā)育時(shí)期上的諸多差異,針對不同的家蠶品種,往往需采用不同的條件解除其蠶卵滯育,而即便是同一家蠶品種,采用不同的條件處理,蠶卵滯育解除效率也會存在差異。二是蠶卵的滯育是以每粒卵為單位決定的,解除滯育的蠶卵胚胎發(fā)育的整齊度以及孵化率受溫度、濕度、光線和空氣等多個(gè)環(huán)境因素影響,從而直接影響著顯微注射后的轉(zhuǎn)基因效率。既要高效解除蠶卵滯育,又要使蠶卵孵化齊一,就必須綜合考慮上述因素。因此,可以說幾乎每個(gè)實(shí)用家蠶品種均需要采用特定的蠶卵滯育解除條件以建立有效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。通過本研究發(fā)現(xiàn),復(fù)式催青法解除蠶卵滯育的效果最佳,其次分別為15℃低溫催青和早期浸酸采用早期浸酸方法,日