h1n1亞型豬流感病毒ha基因克隆及致病特性研究

h1n1亞型豬流感病毒ha基因克隆及致病特性研究

豬流暢性（si）是目前影響?zhàn)B豬業(yè)的重要腸道疾病之一。這是單個(gè)豬場(chǎng)中常見(jiàn)的一起疾病之一。不僅如此,豬流感病毒(swineinfluenzavirus,SIV)與人流感的流行有著密切的關(guān)系。2009年暴發(fā)的甲型H1N1流感大流行蔓延至全球200余個(gè)國(guó)家和地區(qū),確診的死亡病例近2萬(wàn)人(劉志輝等,2012);因此,SI具有重要的公共衛(wèi)生意義,而對(duì)于H1N1亞型SI的研究,重新引起了人們的嚴(yán)重關(guān)注(Shinde等,2009;朱來(lái)華等,2010)。動(dòng)物模型是研究流感病毒致病機(jī)制的重要基礎(chǔ)。目前流感病毒的動(dòng)物模型主要包括小鼠、雪貂、豬、靈長(zhǎng)類動(dòng)物等(Barnard,2009)。小鼠是應(yīng)用最多的試驗(yàn)動(dòng)物模型,常被用來(lái)進(jìn)行細(xì)菌及病毒的致病性和免疫效果評(píng)價(jià)。目前,研究人員已利用BALB/c小鼠進(jìn)行了H5N1亞型流感病毒的感染、免疫和抗病毒藥物等方面的研究,結(jié)果表明BALB/c小鼠對(duì)流感病毒易感,適合作為動(dòng)物模型(Xu等,2006,2009)。細(xì)胞因子(cytokine,CK)在機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中起著十分重要的作用,在某些疾病時(shí),機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子基因表達(dá)可能異常,進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生及病情加重。此外,許多致炎細(xì)胞因子及趨化因子的變化與疾病密切相關(guān)。研究結(jié)果表明,細(xì)胞因子在呼吸道合胞病毒(RSV)等病毒性肺炎發(fā)病中發(fā)揮重要作用(Jafri等,2004),IL-6可通過(guò)可溶性IL-6受體(sIL-6R)調(diào)節(jié)間質(zhì)性肺炎的全身及局部炎性反應(yīng)。IL-1β在人類免疫缺陷病毒相關(guān)肺炎中介導(dǎo)肺臟組織損傷。肺炎時(shí)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-8與肺炎嚴(yán)重程度有關(guān),參與多形核白細(xì)胞(PMN)介導(dǎo)的肺炎致病過(guò)程,且急性期腫瘤壞死因子-α(TNF-α)明顯升高。但關(guān)于H1N1亞型SIV感染哺乳動(dòng)物致病機(jī)理的相關(guān)報(bào)道較少,故本研究對(duì)H1N1亞型SIV的血凝素(HA)基因進(jìn)行克隆、遺傳進(jìn)化分析及其對(duì)小鼠致病性的研究,初步了解該病毒HA基因的分子進(jìn)化特征及其對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性,為進(jìn)一步開(kāi)展H1N1亞型SIV對(duì)哺乳動(dòng)物致病機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1病毒分離和鑒定A/swine/Guangdong/2/2012(H1N1)病毒由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存;6周齡雌性的SPF級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2主要試劑RNA提取試劑盒購(gòu)自LifeTechnology公司;SYBRPremixExTaqTM購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;UNIQ-10柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。1.3引用設(shè)計(jì)1.4反應(yīng)條件及測(cè)序參照TRIzolLSReagent的說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA。按常規(guī)RT-PCR方法擴(kuò)增HA基因,反應(yīng)條件:42℃反轉(zhuǎn)錄60min;94℃預(yù)變性5min;94℃變性40s,53℃退火40s,72℃延伸2min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體中并送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。應(yīng)用Mega5.1Beta4軟件進(jìn)化序列分析并繪制進(jìn)化樹(shù)。1.5小鼠滴鼻途徑接種量選取血凝效價(jià)為1∶256的H1N1亞型SIV含毒雞胚尿囊液以滴鼻途徑分別接種9只BALB/c小鼠,0.1mL/只,并設(shè)生理鹽水對(duì)照。攻毒后觀察其臨床癥狀及死亡情況,分別在攻毒后第1、3和7天各取3只試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠,處死后無(wú)菌解剖。1.5.1大鼠器官系數(shù)的測(cè)定無(wú)菌解剖取小鼠肺臟、脾臟和腦組織,并計(jì)算肺臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腦指數(shù)。公式為:1.5.2肺組織病理學(xué)的觀察于感染后第3天處死試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠,取肺臟組織固定于4%甲醛中,石蠟包埋,常規(guī)病理組織切片處理,HE染色觀察組織病理變化。1.5.3實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)應(yīng)用總RNA提取試劑盒抽提腦、肺臟和脾臟組織總RNA,采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板,分別采用特異性引物,據(jù)優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s,61℃退火37s,40個(gè)循環(huán)。記錄Tm值和熔解曲線。1.6統(tǒng)計(jì)分析2結(jié)果與分析2.1ha基因的進(jìn)化分析所擴(kuò)增的HA基因片段為1701bp,編碼567個(gè)氨基酸,裂解位點(diǎn)序列為IPSIQSR↓GL,符合低致病性流感毒株的分子特征。HA基因與GenBank中登錄的A/swine/Guangdong/09/08HA基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性最高,均為99%。與A/swine/HongKong/1733/2002(H1N1)的核苷酸和氨基酸序列的同源性最低,均為95%。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示,HA基因的進(jìn)化分為人源、豬源和禽源3個(gè)譜系;該分離株HA基因與A/swine/Guangdong/2/01位于同一分支,親緣關(guān)系較近,位于豬源的分支譜系(圖1)。2.2小鼠感染前感染情況接種病毒后,小鼠表現(xiàn)出不愿運(yùn)動(dòng),嗜睡,體溫降低,食欲欠佳,部分皮毛松亂等癥狀;但無(wú)咳嗽和死亡,體重較感染前下降,對(duì)照組的小鼠無(wú)異常表現(xiàn)。與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組肺臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腦指數(shù)均稍微升高,但差異均不顯著(P>0.05)(表2)。2.3炎性細(xì)胞浸養(yǎng)由圖2可知,試驗(yàn)組小鼠的肺間隔較正常肺臟組織明顯增厚,可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以淋巴細(xì)胞為主。肺泡腔內(nèi)見(jiàn)少量異常分泌物,肺泡間隔中的毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張充血,周?chē)闻萸怀蚀鷥斝苑螝饽[。2.4小鼠感染前后il-1、tnf-和tnf-變化情況由圖3可知,試驗(yàn)組小鼠腦組織中IL-1β、IL-10、IRF-3和TNF-α4種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比均有不同程度的上調(diào),特別是IL-1β在小鼠攻毒后第3和7天均極顯著上調(diào)(P<0.01),IL-10在小鼠攻毒后第3和7天均顯著上調(diào)(P<0.05),但I(xiàn)RF-3和TNF-α在感染后與對(duì)照組相比差異均不顯著(P>0.05);IP-10mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在感染后第1天即顯著上調(diào)并達(dá)到高峰(P<0.05),此后下降到低于對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄水平,但差異不顯著(P>0.05);而IFN-α和IFN-β在感染后均低于對(duì)照組,但差異均不顯著(P>0.05)。2.5小鼠感染前后ifn-、局部下降的情況由圖4可知,小鼠肺臟組織中IL-1β、IL-10、IFN-β、TNF-α和IP-105種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平在感染第1天后均低于對(duì)照組,但差異均不顯著(P>0.05),第3天均極顯著上調(diào)(P<0.01),此后下降到低于對(duì)照組小鼠的轉(zhuǎn)錄水平,但差異均不顯著(P>0.05);IFN-α在感染后第1和7天均低于對(duì)照組,而第3天上調(diào),但與對(duì)照組相比差異均不顯著(P>0.05);IRF-3mRNA表達(dá)水平在感染后第3天顯著上調(diào)(P<0.05),而第1和7天與對(duì)照組相比均下調(diào),但差異均不顯著(P>0.05)。2.6小鼠感染降低il-1和tnf-的細(xì)胞因子檢測(cè)由圖5可知,小鼠脾臟組織中IFN-α、IFN-β、IL-1β、TNF-α、IP-10、IRF-3和IL-107種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組小鼠相比均有不同程度的上調(diào),特別是IFN-α在小鼠攻毒后第3天極顯著上調(diào)(P<0.01);IL-1β和IRF-3在小鼠攻毒后第3和7天均顯著上調(diào)(P<0.05);IL-10、IFN-β和TNF-α3種細(xì)胞因子在感染后第3天均顯著上調(diào)(P<0.05),但第1和7天與對(duì)照組相比均下調(diào),差異均不顯著(P>0.05);IP-10的轉(zhuǎn)錄水平在感染后第3天上調(diào),但差異不顯著(P>0.05),而在第7天顯著上調(diào)(P<0.05)。3ha基因裂解位點(diǎn)序列及同源性比對(duì)及進(jìn)化關(guān)系季節(jié)型流感病毒不能直接感染老鼠,但毒株在小鼠中經(jīng)肺臟傳肺臟的傳代過(guò)程后毒力和致病性增強(qiáng),從而成為鼠肺臟適應(yīng)株甚至致死株,而一些高致病性的H5和H7亞型禽流感病毒可不經(jīng)過(guò)適應(yīng)而直接對(duì)小鼠致病,因此常被作為流感病毒致病性研究的哺乳動(dòng)物模型(Ward,1997;Herfst等,2010)。Herfst等(2010)利用該病毒感染食蟹猴,結(jié)果發(fā)現(xiàn)新型甲型H1N1病毒也引起以彌漫性肺泡損傷為主的肺臟部病理變化。在本試驗(yàn)中,使用H1N1亞型SIV尿囊液原液感染BALB/c小鼠,結(jié)果表明該病毒所引發(fā)的癥狀不明顯,致病力較弱,且對(duì)BALB/c小鼠并不致死,與王連想等(2003)報(bào)道的H1N1亞型SIV分離株接種小鼠后未導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)癥狀和死亡的結(jié)果相同。HA蛋白是流感病毒的膜外蛋白,可與靶細(xì)胞表面的唾液酸結(jié)合,幫助病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面,使病毒得以侵入細(xì)胞。血凝素蛋白與病毒易感的宿主范圍和宿主對(duì)病毒感染產(chǎn)生的免疫反應(yīng)有直接聯(lián)系,其裂解性、受體特異性和糖基化是決定流感病毒感染性和致病性的重要因素(Hoffmann等,2001)。Matrosovich等(2008)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),HA1和HA2裂解位點(diǎn)處多1個(gè)堿性氨基酸的插入和糖基化位點(diǎn)的缺失均能使HA對(duì)蛋白酶切割的敏感性增強(qiáng),從而使致病力提高。本研究毒株HA基因裂解位點(diǎn)序列為IPSIQSR↓GL,符合低致病性流感毒株的分子特征;且在小鼠的攻毒試驗(yàn)中,小鼠只有輕微的癥狀,并不能致死,分子特征和動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明該H1N1毒株屬于低致病性毒株。同源性比對(duì)及進(jìn)化關(guān)系結(jié)果表明,本研究分離的毒株與豬源SIV進(jìn)化關(guān)系很近且同源性較高(最高為99%),與禽源H1N1進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn),本研究毒株仍為豬源SIV。細(xì)胞因子是主要由活化的免疫細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞所合成、分泌的小分子多肽,具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等功能,作為一類重要的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑,在一些疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用,細(xì)胞因子的檢測(cè)越來(lái)越受重視。在免疫學(xué)領(lǐng)域,許多研究結(jié)果表明病毒性疾病感染與組織細(xì)胞中致炎細(xì)胞因子及趨化因子的變化密切相關(guān)。流感病毒,尤其是H5N1毒株,在體外可誘導(dǎo)多種細(xì)胞釋放高濃度的促炎癥細(xì)胞因子,在體內(nèi)的局部器官和血漿中也存在著大量促炎癥細(xì)胞因子的積累,大量釋放和積累的促炎癥因子,如TNF-α和IL-1β等,通過(guò)細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)(cytokinecascade),產(chǎn)生以細(xì)胞因子分泌失調(diào)和過(guò)度釋放為表現(xiàn)的細(xì)胞因子風(fēng)暴效應(yīng)(cytokinestorm),從而可能引發(fā)相應(yīng)的免疫病理?yè)p傷,這種以促炎癥細(xì)胞因子過(guò)度釋放導(dǎo)致的細(xì)胞因子風(fēng)暴被認(rèn)為是高致病性H5N1引起嚴(yán)重疾病的可能原因(Shu等,2009;Bailey等,2007;Vaknin-Dembinsky等2006)。IL-1β和TNF-α是重要的促炎癥因子,能導(dǎo)致其他炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子等的合成,其表達(dá)發(fā)生強(qiáng)烈上調(diào)時(shí),則引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴。本研究應(yīng)用建立的細(xì)胞因子mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法,對(duì)H1N1亞型SIV感染的BALB/c小鼠肺臟、脾臟和腦組織中7種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè),結(jié)果顯示,H1N1亞型SIV感染的小鼠肺臟、脾臟組織樣本中IFN-α、IFN-β、IP-10、IL-1β、TNF-α、IRF-3和IL-10mRNA含量在感染第3天普遍升高;而腦組織樣本中IL-1β和IL-10在小鼠攻毒后第3和7天均顯著上調(diào)(P<0.05),表明小鼠感染H1N1亞型SIV第3天肺臟、脾臟和腦均有炎癥發(fā)生,這與3個(gè)臟器系數(shù)有輕微升高相符合,特別是肺臟促炎癥因子TNF-α在第3天有顯著的上調(diào)(P<0.05)。細(xì)胞因子雖有抗病毒的作用,但也會(huì)造成組織損傷,IL-10是一種多效的抑制性細(xì)胞因子,不僅能抑制T細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等的活化及各類細(xì)胞因子的產(chǎn)生,也能促進(jìn)B細(xì)胞和天然殺傷性細(xì)胞的分化和增殖,促進(jìn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集及肥大細(xì)胞集落。另外,IL-10還能與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)協(xié)同調(diào)