帶蒂筋膜瓣包裹復合自體紅骨髓修復骨缺損

帶蒂筋膜瓣包裹復合自體紅骨髓修復骨缺損

0骨組織工程組合法利用傷口修復傷口和供體來源不足等缺陷，限制骨缺損，尤其是大缺陷。正常骨折匹配是連續(xù)的，這是骨細胞與破骨細胞相互作用的結(jié)果。這是骨科臨床上最常見的結(jié)合方法，骨缺損的愈合是間隙愈合。間隙的存在對骨結(jié)合的影響很多，軟組織的“墊層”延長了骨移植。實驗證明具有骨潛能的間質(zhì)細胞向缺損區(qū)生長,移行的速度慢于周圍的結(jié)締組織。許多骨缺損模型中,骨缺損迅速被來自周圍的結(jié)締組織所充填,骨折端間、骨床與移植骨間存在纖維結(jié)締組織是骨不愈合病理基礎(chǔ)。骨組織工程復合物是當今治療骨缺損研究的熱點,但因其不具有血管化,骨髓基質(zhì)干細胞不能夠獲得及時充分的營養(yǎng)易凋亡,再者骨髓基質(zhì)干細胞需要體外擴增培養(yǎng)易發(fā)生污染,且等待時間長、過程費時以及倫理學要求等諸多不足,嚴重制約了其在臨床上應(yīng)用于推廣。國外學者將紅骨髓和生成因子復合即時植入,用于促進骨折愈合已經(jīng)獲得滿意效果。由于不需體外培養(yǎng)過程,只要在抽取紅骨髓后與支架生成因子復合并立即植入,被稱為“非細胞型組織工程化骨”,該方法操作簡單,臨床實用性強。實驗旨在探索利用帶蒂筋膜瓣包裹法構(gòu)建血管化非細胞型組織工程骨并誘導其骨再生修復骨缺損的可行性。1動物分組、藥物聯(lián)合和網(wǎng)絡(luò)營養(yǎng)設(shè)計:同體對照動物實驗。時間及地點:實驗于2007-12/2009-02在河北北方學院實驗中心(BSL-3)及附屬醫(yī)院實驗中心(P3)完成。材料:成年新西蘭大白兔24只,由河北北方學院動物實驗室提供,許可證號:SCXK(京2006-0006,雌雄不限,兔齡四五個月,體質(zhì)量2.0~2.5kg;實驗過程中動物處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》中的要求。生物支架材料為骨誘導活性材料(osteoinductiveabsorbingmaterial,OAM),購于天津生物發(fā)展有限公司,OAM是由多孔磷酸鈣人工骨(porouscalciumphosphatecement,PCPC)作為載體,并與重組人骨形成蛋白2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein2,rhBMP-2)復合構(gòu)成,為疏水嗜酸性糖蛋白,相對分子質(zhì)量為18000±500;PCPC呈條塊狀2cm×0.5cm×0.5cm,具有天然多孔的結(jié)構(gòu),孔徑300~400μm,孔隙率大于80%,與骨髓基質(zhì)干細胞、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)具有良好的組織相容性,每條含BMP≥10mg,實現(xiàn)BMP-2緩釋,而且有與人體骨組織礦物質(zhì)相似的Ca、P比例與晶體結(jié)構(gòu),且Ca/P小于1.6,力學強度可靠且可以在體內(nèi)逐步降解,降解后的鈣參與局部新骨形成或進入機體的鈣磷庫,以正常方式排出體外。實驗方法:組織工程復合物制備:將實驗24只兔于放血干預(yù)動員第5天,從雙側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子處用骨髓穿刺針(含有100U/mL肝素0.2mL的5mL注射器)每側(cè)設(shè)2點,分別抽取自體紅骨髓(autologousredbonemarrow,ARBM)各1mL,將條狀OAM放入含ARBM4mL的注射器中充分浸泡混合,制成ARBM非細胞型組織工程復合物。用前配置。大段骨缺損動物造模及復合物移植:所有動物選取雙側(cè)前臂參加實驗,左前臂即對照組,右前臂即實驗組。氯胺酮注射液10mg/kg耳緣靜脈麻醉下無菌手術(shù),顯露雙側(cè)橈骨中上段,自橈骨小頭下4cm處開始截除相當于直徑長度四五倍約2cm橈骨干及其骨膜,造成橈骨長段骨-骨膜完全缺損。對照組將ARBM組織工程復合物嵌入骨缺損;實驗組利用顯微外科技術(shù),在兔前肢皮下骨缺損鄰近制備一個大小合適的帶有無名血管蒂所屬毛細血管網(wǎng)的筋膜條瓣,通過隧道轉(zhuǎn)移到骨缺損處,將其包裹ARBM組織工程復合物后嵌入骨缺損,將筋膜條兩側(cè)用10-0無創(chuàng)線固定在斷端骨膜或軟組織上,逐層縫合傷口。術(shù)后連續(xù)3d臀大肌注入硫酸慶大霉素注射液,2mL/只,1次/d。術(shù)后4,8,12,16周4個時間段,每個時間段各組隨機取6只動物,X射線攝片后處死,取雙側(cè)橈骨進行大體觀察和組織學相關(guān)檢查。動物觀察:術(shù)后動物的飲食、活動和傷口愈合情況。X射線及吸光度檢查:植骨術(shù)后4,8,12,16周時,各組分別連續(xù)攝兔右尺橈骨正位X射線片,每支兔系統(tǒng)選片5張,在骨缺損區(qū)范圍內(nèi)隨機選取6個測試點,用Pehamed-Densoquick2型透射吸光度計測定其實際吸光度值及空曝區(qū)最大吸光度值,求兩者的百分比即吸光度比,觀察骨缺損修復過程的動態(tài)變化。大體形態(tài)和組織學觀察:術(shù)后4,8,12,16周取骨缺損修復標本做大體觀察,觀察骨缺損修復程度、骨痂生長情況。然后鋸下植骨部位,用體積分數(shù)為4%的中性甲醛溶液固定,稀鹽酸脫鈣,乙醇逐級脫水,二甲苯透明,石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅染色、VG染色,光鏡下觀察骨缺損修復成骨及再血管化情況。修復區(qū)內(nèi)骨形態(tài)計量分析:將術(shù)后4個時間段各組所有組織塊進行連續(xù)切片,系統(tǒng)選片,每塊組織選5張。在放大100倍條件下,每張切片上系統(tǒng)隨機選取5個視野,在圖像分析儀下進行組織形態(tài)分析,測定術(shù)后各時間點新生骨小梁面積占鏡下修復區(qū)面積的比值,以百分比表示。交界區(qū)血管圖像分析:選取組織工程復合物與正常骨交界部位,用圖像分析儀測量單位面積的血管面積。隨機測定每張切片5個區(qū)域內(nèi)血管面積(μm2),用測定的血管面積除以區(qū)域面積,得出數(shù)據(jù)為單位面積內(nèi)的血管面積,以百分比表示。主要觀察指標:(1)動物觀察。(2)X射線檢查。(3)大體形態(tài)和組織學觀察。(4)修復區(qū)內(nèi)骨形態(tài)計量分析。(5)交界區(qū)血管圖像計量分析。統(tǒng)計學分析:數(shù)據(jù)用表示,定量變量組間所得數(shù)據(jù)比較,采用SPSS11.5軟件行方差分析和t檢驗。2結(jié)果2.1動物切口感染動物5例均為單側(cè)肢體(對照組3例,實驗組2例)傷口有紅腫和滲出,10d后對照組2例死亡,另外3例傷口感染裂開,手術(shù)區(qū)外露,實驗組2例繼續(xù)參與實驗,對照組1例植入物脫出,退出實驗。又補充3只實驗兔后,傷口無異常,除實驗組2例感染外,所有動物傷口12d拆線Ⅰ期愈合。術(shù)后第2~4天實驗兔精神差,第8~12天動物前肢由開始重度跛行變?yōu)檩p度跛行,運動由開始不活動變?yōu)榛顒由?采食由開始拒食轉(zhuǎn)為少食,而后采食增加,運動增多,步態(tài)轉(zhuǎn)好,第16~19天恢復術(shù)前狀態(tài)。2.2術(shù)后骨髓內(nèi)固定對照組:術(shù)后4周,可見植入物紋理清楚,密度稍低,與橈骨斷端之間隙清晰可見。8周時,植入物紋理模糊,密度較低,截骨斷面與植入物之間隙不明顯,無外骨痂形成。12周時,有少量外骨痂形成并包裹植入物。16周時,周邊有少許不規(guī)則外骨痂生成并初步形成骨干結(jié)構(gòu),骨皮質(zhì)不連續(xù),髓腔不通。實驗組:術(shù)后4周,即見植入物紋理模糊,密度減低,截骨斷面與植入物之間隙已不明顯,有少許外骨痂形成。8周時,植入物密度逐漸增高,截骨斷面與植入物之間隙基本消失,有較整齊的板層狀骨痂形成。12周時,初步形成骨干結(jié)構(gòu),骨皮質(zhì)連續(xù),部分髓腔再通。16周時,正常骨干結(jié)構(gòu)形成,骨髓腔完全再通。吸光度比測量結(jié)果:兩組之間術(shù)后2周無差異,自第4周起兩組之間同一時間點和同組術(shù)后不同時間吸光度比之間比較差異均有顯著性意義(P<0.05),見表1。2.3術(shù)后骨瘤組織病理學觀察大體形態(tài)觀察:對照組:術(shù)后第4,8周,植入物與尺骨斷端之間有纖維結(jié)締組織連接。第12周,除少量骨痂包裹植入物外,截骨斷面與植入物之間隙已不明顯。16周時少許不規(guī)則外骨痂包裹植入物,與骨干形成一個整體。實驗組:術(shù)后第4周,帶蒂筋膜瓣與植入物生長為一體,形成類似骨膜樣組織,剝開此組織,植入物與尺骨斷端之間有少許纖維結(jié)締組織連接。第8周,少量骨痂包裹植入物。第12周時適量外骨痂完全包裹植入物,與骨干形成一個整體。16周時骨缺損區(qū)骨皮質(zhì)連續(xù),骨干結(jié)構(gòu)得以重塑。組織學觀察:對照組:術(shù)后第4周,鏡下見纖維結(jié)締組織長入植入物內(nèi)部,有散在的軟骨細胞團形成。第8周時有纖維結(jié)締組織和新生骨小梁結(jié)構(gòu),未見血管結(jié)構(gòu)和明顯淋巴細胞浸潤。第12周,骨斷端之間有少許纖維結(jié)締組織,植入物表層即骨痂表層有散在血管結(jié)構(gòu)、纖維性骨痂形成,植入物內(nèi)部即骨痂深層骨小梁及血管結(jié)構(gòu)較少。16周時骨斷端之間仍有纖維結(jié)締組織相連,植入物內(nèi)血管長入較少和發(fā)育較成熟的骨小梁,骨髓腔未通。實驗組:術(shù)后第4周,鏡下見纖維結(jié)締組織長入植入物內(nèi)部并有血管長入,有散在發(fā)育中骨小梁和軟骨細胞團形成,未見明顯淋巴細胞浸潤。第8周,植入物內(nèi)部有較豐富血管長入并有發(fā)育較成熟的骨小梁骨及軟骨組織形成。12周時血管豐富及大量成熟骨小梁形成,骨髓腔部分再通。16周時植入物已吸收降解,完全由新骨替代,新骨中散在少量軟骨,成熟骨結(jié)構(gòu)形成,骨髓腔再通,已不見植入物殘骸。2.4兩組樣本實時時間點評分根據(jù)Lane-Sandhu骨移植物組織學評分法,對兩組樣本各時間段同一時間點進行評分。經(jīng)方差分析,術(shù)后4,8,12,16周實驗組的骨小梁的體積明顯多于對照組(P<0.05),見表2。2.5表3顯示了邊界區(qū)域血管圖像的測量3帶蒂肌力瓣包裹非細胞型組織工程化骨的修復應(yīng)用膜誘導技術(shù),即利用顯微外科技術(shù)在骨缺損鄰近制備一個帶有無名血管蒂所屬毛細血管網(wǎng)的筋膜瓣,使其包裹組織工程復合體防止其散漏并充填骨缺損,首先筋膜瓣覆蓋骨缺損將其作為骨端骨膜再生的支架,機械性地阻礙了纖維結(jié)締組織和周圍軟組織進入骨缺損部位,保持骨缺損部位有以相對穩(wěn)定的環(huán)境。通過X射線攝片及解剖大體形態(tài)觀察,從早期4周時實驗組的帶蒂筋膜瓣與植入物生長為一體,形成類似骨膜樣組織,截骨斷面與植入物之間隙已不明顯,有少許外骨痂形成,其余各時間點連接處成骨作用明顯好于對照組;術(shù)后16周組織學觀察實驗組由于有膜誘導即筋膜瓣阻擋作用,骨斷端之間始終未發(fā)現(xiàn)周圍的纖維結(jié)締組織夾墊,最終新骨將骨缺損兩端橋接,且外觀骨塑性良好;相反,對照組骨缺損兩端始終有來自周圍的纖維結(jié)締組織充填連接骨斷端,且骨塑性外觀較差。充足的血液供應(yīng)是保證組織工程化骨體內(nèi)存活的決定性因素。筋膜組織學本身具有良好的通透性和豐富的毛細血管網(wǎng),可使體液內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)進入缺損部位,給骨細胞的再生提供一定的營養(yǎng)。帶蒂筋膜瓣除了保留筋膜自身血供根源外,在顯微鏡下觀察還帶有無名血管蒂所屬血管網(wǎng),使筋膜瓣血液循環(huán)更豐富。其包裹復合物在構(gòu)建組織工程化骨的同時建立其血液供應(yīng),形成血管化的非細胞型組織工程骨,可使血液中營養(yǎng)物質(zhì)進入缺損部位,保證植入OAM內(nèi)部的ARBM中骨髓基質(zhì)干細胞能夠獲得及時充分的營養(yǎng),延長細胞壽命減少凋亡率,使骨缺損得以修復。通過選取組織工程復合物與正常骨交界部位,用圖像分析儀測量單位面積的血管面積來動態(tài)觀察組織工程化骨在體內(nèi)血管化的進程,發(fā)現(xiàn)兩組各時間段同一時間點,筋膜瓣包裹實驗組與無筋膜瓣包裹對照組相比,在單位面積內(nèi)血管的數(shù)量及質(zhì)量上都較對照組相比有明顯的優(yōu)勢,差異均有顯著性意義(P<0.05),提示帶蒂筋膜瓣包裹對組織工程化骨的血管化進程有明顯的促進作用。從X射線片、大體形態(tài)觀察和組織學切片多種方法檢測兩組各時間段同一時間點無論植入物內(nèi)部血管的長入、骨小梁及軟骨組織形成的數(shù)量和速度,還是成熟骨結(jié)構(gòu)的形成、骨干結(jié)構(gòu)的重塑、骨髓腔的再通、植入物的吸收降解,證實帶蒂筋膜瓣構(gòu)建血管化非細胞型組織工程骨體內(nèi)成骨的能力和修復骨缺損的效果明顯優(yōu)于無筋膜瓣對照組,通過吸光度測定和修復區(qū)內(nèi)骨形態(tài)計量分析筋膜瓣實驗組所形成的骨組織中心未見骨壞死或空隙狀未成骨區(qū),統(tǒng)計學分析差異均有顯著性意義(P<0.05)。帶蒂筋膜瓣包裹非細胞型組織工程化骨修復骨缺損的優(yōu)點:(1)采取ARBM,利用骨髓基質(zhì)干細胞(種子細胞)具有成骨和血管再生雙重特點,與含BMP(骨生長因子)的OAM(載體)均勻混合成非細胞型組織工程復合物。獨特的結(jié)合方式,在控制BMP釋放,提供骨髓基質(zhì)干細胞生長的支架,增強其在骨缺損局部聚積,保證骨髓基質(zhì)干細胞和BMP濃度而不讓流失的同時,BMP誘導下不僅可提高ARBM單位體積內(nèi)骨髓基質(zhì)干細胞、成骨細胞的數(shù)量和活性,還能夠在體內(nèi)、體外高效誘導血管周圍大量游走的間充質(zhì)細胞或骨髓基質(zhì)細胞增殖,轉(zhuǎn)化為軟骨細胞和成骨細胞,通過以軟骨化骨為主膜內(nèi)化骨為輔形成新骨,載體在修復早期起到機械支撐和增加力學強度,后期逐漸經(jīng)生物降解而形成新骨,起到了良好的骨誘導、骨傳導和骨支撐三重作用。(2)血管化組織工程骨本身就有自主成骨及誘導血管再生的能力,與宿主骨連接處愈合快而牢固;筋膜瓣實驗組大體形態(tài)和組織學觀察,無論植入物與橈骨斷端之間連接強度,外骨痂形成程度,還是植入物內(nèi)部即骨痂深層成熟骨小梁形成,均與無筋膜瓣對照組相比所需骨性愈合時間明顯縮短。(3)復合物移植后筋膜管內(nèi)骨再生現(xiàn)象明顯,移植骨內(nèi)部塑形快,能較快地適應(yīng)宿主骨的力學環(huán)境;在實驗研究中觀察到筋膜管內(nèi)的骨形成,是從骨端開始生長,而來源于缺損以外的組織不會穿透此膜進入骨缺損區(qū),膜技術(shù)的應(yīng)用一方面阻礙了周圍組織長入骨缺損區(qū),為骨再生提供了空間,另一方面,筋膜管還有收集骨髓基質(zhì)干細胞、骨端產(chǎn)生的BMP等成骨因子,提高其密度或濃度的作用,筋膜管內(nèi)的環(huán)境有利于骨缺損區(qū)和膜下的軟骨成骨,導致移植后骨再生明顯。由于應(yīng)力的刺激和組織工程骨血管化作用以及膜和膜下豐富血