脈沖電磁場(chǎng)對(duì)dop大鼠骨形態(tài)學(xué)及血清學(xué)指標(biāo)的影響

脈沖電磁場(chǎng)對(duì)dop大鼠骨形態(tài)學(xué)及血清學(xué)指標(biāo)的影響

近年來，由于長期臥床、剎車和長期超載，殘余性骨質(zhì)疏松癥（dop）的發(fā)病率逐漸增加，給人們的家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。預(yù)防和治療殘余性骨質(zhì)疏松癥已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。有研究報(bào)道,脈沖電磁場(chǎng)(pulsedelectromagneticfields,PEMF)可以有效增加廢用性骨質(zhì)疏松的骨量。本研究旨在觀察PEMF對(duì)廢用性骨質(zhì)疏松骨組織形態(tài)學(xué)及血清學(xué)指標(biāo)的影響,探討PEMF治療廢用性骨質(zhì)疏松疾的可能機(jī)制,以期為PEMF的臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。1材料和方法1.1藥物和試劑大鼠(RAT)骨鈣素OT/BGPELISA檢測(cè)試劑盒購自武漢博士德公司,阿侖膦酸鈉購自杭州默沙東制藥有限公司。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠,雌性,體重250g~280g由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)SCXK-吉2007-0003。1.3自動(dòng)生化分析方法生物切片自動(dòng)化系統(tǒng)(德國;萊卡顯微鏡),成像系統(tǒng)(DM4000B,德國),BECKMAN自動(dòng)生化分析儀,哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院脈沖磁場(chǎng)系統(tǒng),信號(hào)發(fā)生器輸出波形為脈沖方波,頻率10Hz,亥姆霍茲線圈,直徑240mm,銅線直徑0.9mm,單包匝數(shù)200匝,當(dāng)線圈通電電流為1A時(shí)中心磁場(chǎng)強(qiáng)度為15GS。本裝置與哈爾濱工業(yè)大學(xué)聯(lián)合研制,已通過哈爾濱醫(yī)科大學(xué)申請(qǐng)獲得國家專利。1.4模型建立及改良1.4.1分組將實(shí)驗(yàn)大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)抽樣分為四組:正常對(duì)照組INT組、廢用模型組DOP組、藥物治療組ALN組、脈沖電磁場(chǎng)組PEMF組,每組20只,除正常對(duì)照組外,其余大鼠通過改良脛骨-尾部固定法制動(dòng)建立模型廢用性骨質(zhì)疏松模型,各組大鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。大鼠右下肢制動(dòng)兩周后,隨機(jī)抽取5只大鼠使用雙能X線骨密度儀(小動(dòng)物軟件)對(duì)右股骨近端進(jìn)行骨密度掃描,確定廢用性骨質(zhì)疏松模型成功后,進(jìn)行治療。藥物治療組(ALN組)大鼠灌胃予以阿侖膦酸鈉(1mg·kg-1·d-1)治療,PEMF組大鼠予以PEMF照射40min·d-1治療,磁場(chǎng)參數(shù)3.82mT,10Hz。在治療后2、4、8、12周時(shí)各組分別取5只大鼠,進(jìn)行血清學(xué)等指標(biāo)的檢測(cè)和骨組織形態(tài)學(xué)觀察。1.4.2模型建立廢用性骨質(zhì)疏松模型在傳統(tǒng)脛骨-尾部固定法基礎(chǔ)上,加以改良,具體步驟:大鼠行腹腔注射水合氯醛30mg·kg-1麻醉,在距離肛門大約1cm尾根部用醫(yī)用膠帶纏繞,醫(yī)用膠帶減輕鐵絲壓迫,加大鐵絲固定受力面。后用粗細(xì)適中醫(yī)用鐵絲穿過右后肢脛骨遠(yuǎn)端約1cm處,大鼠右后肢緊貼尾部右側(cè)上方,醫(yī)用鐵絲置于尾根部膠帶上,將鐵絲彎折成類似“∝”形,鐵絲兩端用鉗子擰住,擰至松緊適中,不易滑脫為止。醫(yī)用膠帶能有效減輕鐵絲壓迫,加大鐵絲固定受力面。并隨著老鼠的生長調(diào)節(jié)老鼠尾部醫(yī)用鋼絲的松緊度。各組大鼠置于大鼠專用飼養(yǎng)籠,每籠5只,飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好、室溫20℃~22℃、濕度60%~70%、12~12h間隔照明。標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)(鈣、磷含量分別為0.51%和0.42%),INT組大鼠喂養(yǎng)DOP大鼠飼料消耗量的平均水平,以防止體重差異過大影響結(jié)果評(píng)價(jià),自由飲水。1.5試驗(yàn)組和方法1.5.1脛骨近端組織電鏡下觀察大鼠麻醉后,取右下肢脛骨近端約1CM,仔細(xì)剔除軟組織,使用3%戊二醛和4%多聚甲醛固定待檢,臨檢脛骨制備切片,使用掃描電鏡觀察。1.5.2血清學(xué)指標(biāo)測(cè)定大鼠麻醉后,右心室穿刺取血,3000r/min離心后收集血清,-70℃低溫冰箱保存待測(cè)。骨鈣素采用ELISA方法檢測(cè),按照說明書進(jìn)行操作。其余指標(biāo)由生化分析儀常規(guī)檢測(cè)。1.6比較方法及統(tǒng)計(jì)學(xué)采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)量資料以u(píng)e0af±s表示,多組間的比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1兩組骨小梁排列、排列建模后4周,DOP組制動(dòng)側(cè)脛骨近段病理切片電鏡下觀察,骨小梁顯微結(jié)構(gòu)呈退行性改變,骨小梁數(shù)量的減少,厚度變薄,骨小梁間隔大,板型的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)斷裂,骨體積減小;而ALN組骨小梁排列較DOP組緊密、整齊,骨小梁間隔較大,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)斷裂程度較輕。建模后12周,PEMF組較ALN組,骨小梁排列整齊有序,骨小梁數(shù)目增多,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)完整,骨小梁體積增大,厚度增厚。2.2各組bgp、alt的比較治療2周后,與INT組相比,其余各組血清鈣水平無明顯差異(P>0.05),血磷明顯降低(P<0.05或p<0.01),骨鈣素、堿性磷酸酶、抗酒石酸磷酸酶則顯著升高(P<0.01),見表1。治療4周后,與INT組比較,血清鈣仍無差異,血磷略有降低(P<0.05或P<0.01),骨鈣素、堿性磷酸酶、抗酒石酸磷酸酶則顯著升高(P<0.01);而ALN組相較,PEMF組BGP、ALT顯著升高(P<0.01),見表2。治療8周后,與正常對(duì)照組比較,DOP組血鈣、血磷降低(P<0.01),其余各組骨鈣素、堿性磷酸酶、抗酒石酸磷酸酶則顯著升高(P<0.01);而與DOP組比較,余組ALP、TRAP降低(P<0.01),與藥物治療組相較,PEMF組BGP、ALT顯著升高(P<0.01),見表3。治療12周后,與正常對(duì)照組比較,其余各組骨鈣素、堿性磷酸酶、抗酒石酸磷酸酶則顯著升高(P<0.01)。與DOP組比較,余組BGP、ALP、TRAP降低(P<0.05或P<0.01)。與藥物治療組相較,PEMF組BGP、ALT、TRAP顯著升高(P<0.05或P<0.01),見表4。3廢用性皮質(zhì)松茸骨模型的建立廢用性骨質(zhì)疏松是由于活動(dòng)功能受限、活動(dòng)障礙和失重等多種原因?qū)е氯砉墙M織礦物含量降低,骨生物力學(xué)性能下降,骨折風(fēng)險(xiǎn)增高的骨質(zhì)疏松,屬于繼發(fā)性骨質(zhì)疏松骨類型的一種。目前對(duì)于廢用性骨質(zhì)疏松疾病,治療手段相當(dāng)有限,并且存在嚴(yán)重副作用[7，8]。因此,迫切需要一種能安全有效治療廢用性骨質(zhì)疏松疾病的方法。脈沖電磁場(chǎng)作為一種新型生物物理治療方法,早在幾十年前就被人們所發(fā)現(xiàn),當(dāng)Fukada和Yasude發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了骨的壓電效應(yīng)后,Bassett于1989年提出Wolf定律歸納PEMF機(jī)制,認(rèn)為生物電在骨的代謝和重建中有十分重要的意義。更加引起了人們對(duì)于研究PEMF的熱情。有研究報(bào)道,PEMF能通過細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡、骨生化指標(biāo)、鈣調(diào)激素等影響骨形成與骨吸收,進(jìn)而使機(jī)體表現(xiàn)出骨生物力學(xué)和骨密度的改變,可有效治療骨折延遲愈合、骨不連、先天性假關(guān)節(jié)及骨質(zhì)疏松等骨骼疾病,但PEMF目前的臨床運(yùn)用僅僅局限為原發(fā)性骨質(zhì)疏松,在廢用性骨質(zhì)疏松疾病防治領(lǐng)域涉及不多。本研究旨在觀察PEMF治療廢用性骨質(zhì)疏松的作用并探討其可能的機(jī)制。研究結(jié)果表明,與正常對(duì)照組比較,廢用骨質(zhì)疏松組血鈣、血磷濃度均有所下降,可能因?yàn)閺U用性骨質(zhì)疏松大鼠骨組織礦物質(zhì)丟失過多,溶解增高,沉積變緩。有文獻(xiàn)指出[13.14],生物電刺激能有效增加細(xì)胞中鈣離子濃度,而鈣離子能增高成骨細(xì)胞功能活性。本研究中,PEMF組在建模后,血清鈣磷濃度略有升高,反映成骨細(xì)胞功能狀態(tài)的ALT、BGP濃度顯著升高。Zaidi曾提出破骨細(xì)胞膜上有鈣離子受體,鈣離子濃度升高,與受體結(jié)合后直接抑制破骨細(xì)胞的吸收功能。骨鈣素是成骨細(xì)胞特異性合成并分泌的一種非膠原蛋白,是間接反應(yīng)骨代謝過程的生化指標(biāo)。在鈣離子存在條件下,與羥磷灰石結(jié)合并穩(wěn)定其構(gòu)象,被認(rèn)為是向成骨細(xì)胞分化最特征性的標(biāo)志物。血清ALP、BGP能有效反映成骨細(xì)胞的功能狀態(tài),而TRAP是反映破骨細(xì)胞功能狀態(tài)的有效指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,建模后2周,與正常對(duì)照組比較,DOP組ALP、BGP、TRAP等指標(biāo)均顯著增高,表明在廢用性骨質(zhì)疏松模型建立后成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞功能均呈亢進(jìn)狀態(tài),建模后ALN組血清ALP濃度略有上升,隨后明顯下降,TRAP濃度明顯降低,與DOP組均有明顯差異,且在建模后12周時(shí)與PEMF組相較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明藥物阿侖膦酸鈉主要通過降低破骨細(xì)胞功能狀態(tài),從而達(dá)到抑制骨吸收的目的,,而促進(jìn)骨形成可能在早期具有雙向性,具體機(jī)制有待考證。PEMF組自建模后血清ALP、BGP濃度顯著增高,TRAP濃度明顯降低,且與ALN組比較,血清ALP、BGP明顯增高,PEMF可能通過增強(qiáng)成骨細(xì)胞功能促進(jìn)骨形成,或降低破骨細(xì)胞功能抑制骨吸收[20，21]。PEMF在增強(qiáng)成骨