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精粗比對(duì)泌乳期山羊瘤胃亞急性酸中毒的影響
隨著中國(guó)人民生活水平的提高,奶業(yè)在整個(gè)經(jīng)濟(jì)中的地位日益提高。但是,以秸稈為主要粗飼料時(shí),大量飼喂高精料雖然在一定程度上提高了反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能,卻極易引發(fā)瘤胃亞急性酸中毒(subacuteruminalacidosis,SARA)。SARA是一種常見(jiàn)的代謝性疾病,商業(yè)化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中,有20%以上的奶牛在泌乳早期和泌乳中期患有SARA,并且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。SARA發(fā)生時(shí)瘤胃酸度和細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)濃度顯著增加,嚴(yán)重感染受損的瘤胃上皮,LPS發(fā)生移位進(jìn)入血液,形成內(nèi)毒素血癥,引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)。此外,機(jī)體免疫系統(tǒng)遭到損害,使動(dòng)物處于一種慢性應(yīng)激狀態(tài)。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)SARA的研究多集中于瘤胃發(fā)酵模式和血液參數(shù)的改變,對(duì)應(yīng)激反應(yīng)的研究較少。Steiger等和Waldron等的相關(guān)研究指出,奶牛注射LPS后免疫細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子最終能激活下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamie-pituitary-adrenalaxis,HPA)。Niel等研究表明,綿羊注射IL-6后外周血中促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇濃度均顯著升高,并將這2項(xiàng)指標(biāo)作為HPA軸激活的標(biāo)志。糖皮質(zhì)激素是體內(nèi)重要的應(yīng)激和代謝激素,對(duì)機(jī)體在正常和應(yīng)激,包括疾病和炎癥狀態(tài)下?tīng)I(yíng)養(yǎng)的重分配,能量平衡的維持以及在逆境下的生存起決定性的作用。肝臟作為機(jī)體重要的代謝器官,肝臟上存在高豐度表達(dá)的糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoidreceptor,GR),能夠接受糖皮質(zhì)激素的信息并做出適應(yīng)調(diào)節(jié)。但SARA狀態(tài)下HPA軸是否被激活及受體是否改變卻鮮有報(bào)道。本研究旨在模擬實(shí)際生產(chǎn)中的飼喂模式,通過(guò)添加高精料日糧誘導(dǎo)亞急性瘤胃酸中毒,初步揭示SARA時(shí)機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)及肝臟上糖皮質(zhì)激素受體基因表達(dá)的變化。1材料和方法1.1動(dòng)物飼養(yǎng)與日糧選用健康狀況良好、體重15~20kg的泌乳中期山羊(波爾山羊與浙江麗水本地山羊雜交后代)7只,手術(shù)安裝永久性瘤胃瘺管,恢復(fù)期為14d,2010年12月-2011年2月飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房,單籠飼養(yǎng),隨機(jī)分為2組,分別飼喂精粗比為4∶6和6∶4的日糧,自由飲水。1.2試驗(yàn)日糧羊草、苜蓿草和精料配方本試驗(yàn)采用2×2拉丁方設(shè)計(jì),隨機(jī)分為2組(分別為3和4只),分別飼喂精粗比4∶6(對(duì)照組)和6∶4(SARA組)日糧(由羊草、苜蓿草和精料組成),粗料由20%苜蓿草和80%羊草組成,配方詳見(jiàn)表1。2組日糧總能量和總蛋白含量相等。試驗(yàn)分為2期,每期包括適應(yīng)期14d和采樣期5d(適應(yīng)期和采樣期都飼喂相同的試驗(yàn)日糧),第1期采樣結(jié)束后調(diào)換日糧。每日08:00和20:00各擠奶1次。1.3樣品采集、處理、分析和測(cè)定1.3.1瘤液中ph的測(cè)定采樣當(dāng)天,于飼喂前0h,以及飼喂后1,2,4,6和10h通過(guò)瘤胃瘺管采集瘤胃液10mL(經(jīng)孔徑為0.15mm尼龍絹過(guò)濾),立即測(cè)定pH,然后裝入塑料離心管中,在4℃條件下,1900r/min離心30min,取上清,-20℃保存。1.3.2血液采集和保存采樣前2d,在山羊頸靜脈處安裝血管瘺。分別于飼喂前0h、飼喂后6h經(jīng)頸靜脈血管瘺采集血液,裝入肝素鈉真空離心管中,4℃,3500r/min離心15min,收集血漿,-20℃保存。1.3.3pcr擴(kuò)增驗(yàn)證肝臟活體采樣,利用TRIZOL一步法提取肝臟樣品總RNA,紫外分光光度儀測(cè)定總RNA的濃度和純度(OD260/280),變性瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA質(zhì)量,-70℃保存?zhèn)溆谩7崔D(zhuǎn)錄酶體系及Tap酶為Promega產(chǎn)品,SYBRGreen購(gòu)自TaKaRa公司。GR和β-actin引物采用Primer5.0軟件自行設(shè)計(jì),由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成,引物序列見(jiàn)表2。1.4療效判定標(biāo)準(zhǔn)品溶液瘤胃液、血液內(nèi)LPS采用ELISA法測(cè)定,按試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行,標(biāo)準(zhǔn)方程分別為:Y=297.6X+14.52,R2=0.994;Y=301.1X+13.59,R2=0.994,式中,X表示各樣品所測(cè)OD值,Y表示各樣品對(duì)應(yīng)LPS含量(EU/L),R表示相關(guān)系數(shù),LPS試劑盒購(gòu)于上海朗頓生物科技有限公司。瘤胃液內(nèi)乳酸用比色法測(cè)定,乳酸濃度=(樣品OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/(標(biāo)準(zhǔn)品OD值-空白OD值),乳酸試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。血漿、瘤胃液皮質(zhì)醇濃度采用放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)法測(cè)定,測(cè)定方法按放免檢測(cè)藥盒說(shuō)明書進(jìn)行,試劑盒購(gòu)于北京北方生物技術(shù)研究所。以上試驗(yàn)均重復(fù)2次。1.5變量雙因素分析數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單變量雙因素分析,主效應(yīng)分別為日糧處理和采樣時(shí)間;用ANOVA進(jìn)行方差分析,采用多項(xiàng)式比較分析日糧處理的效應(yīng)。2結(jié)果與分析2.1兩組小鼠造林后瘤胃本身偏緩毒力2種日糧飼喂條件下,瘤胃液pH動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)基本一致(圖1)。瘤胃液pH在飼喂前最高,飼喂后隨時(shí)間延長(zhǎng),pH逐漸下降,隨后由于瘤胃本身的緩沖能力pH又逐漸上升。其中,SARA組山羊在飼喂后1h,pH開始低于5.8,一直持續(xù)到6h。飼喂后6hSARA組山羊瘤胃液pH顯著低于對(duì)照組(P<0.05),飼喂后1,2和4hSARA組山羊瘤胃液pH極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。日糧類型以及日糧類型與發(fā)酵時(shí)間互作效應(yīng)對(duì)瘤胃pH有顯著影響(P<0.05)。2.2日糧類型和發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系飼喂后山羊瘤胃液內(nèi)LPS濃度隨時(shí)間變化呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(P<0.1)(圖2A),但同一時(shí)間點(diǎn)相比2組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。采用雙因子分析日糧類型和發(fā)酵時(shí)間兩因素間的主效應(yīng)關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)日糧類型對(duì)瘤胃液內(nèi)LPS濃度有顯著性影響(P<0.05),但日糧類型與發(fā)酵時(shí)間之間無(wú)互作效應(yīng)(P>0.05)。采食前和采食后6h血漿中LPS濃度也發(fā)生改變,日糧類型對(duì)血液LPS濃度產(chǎn)生顯著性影響(P<0.05)(圖2B),0和6hSARA組血漿內(nèi)LPS濃度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),但日糧類型和發(fā)酵時(shí)間之間無(wú)交互效應(yīng)(P>0.05)。2.3乳酸濃度的變化山羊瘤胃液中乳酸含量較低,均小于1mmol/L(圖3)。采食前SARA組山羊瘤胃液中乳酸濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05),采食后0~4h乳酸含量下降,4h時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05),6~10h時(shí)逐漸增加并極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。然而,對(duì)照組乳酸濃度在采食后1h顯著性上升(P<0.05),采食后2~6h乳酸濃度又急劇下降。采用雙因素方差分析顯示,日糧類型以及日糧類型和發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)乳酸濃度具有極顯著效應(yīng)(P<0.01)。2.4sara組與對(duì)照組羊瘤瞳的制作與對(duì)照組相比,SARA組山羊采食前血液中皮質(zhì)醇濃度有升高的趨勢(shì)(P=0.05,n=7)(圖4A),采食后6h兩組間差異不顯著(P>0.05)。采食后0~6h期間,SARA組山羊瘤胃液皮質(zhì)醇濃度呈逐漸上升的趨勢(shì)(圖4B),采食后6h達(dá)最高水平,10h時(shí)基本恢復(fù)至采食前水平,并且在采食后2,4和6h分別顯著高于對(duì)照組(P<0.05,n=7)。在瘤胃液中皮質(zhì)醇濃度上,日糧類型對(duì)其具有極顯著影響(P=0.006),發(fā)酵時(shí)間具有顯著性影響(P=0.03),日糧類型和發(fā)酵時(shí)間之間有互作的趨勢(shì)(P=0.063)。2.5不同谷物的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)肝臟grmra的影響與對(duì)照組相比,飼喂日糧精粗比6∶4的SARA組山羊肝臟在GRmRNA表達(dá)上表現(xiàn)出顯著性下調(diào)(P<0.05)(圖5)。3討論3.1瘤胃內(nèi)乳酸的積累SARA是指反芻動(dòng)物采食過(guò)多谷物類易發(fā)酵碳水化合物飼料,導(dǎo)致瘤胃長(zhǎng)時(shí)間處于低pH值狀態(tài),并伴隨少量乳酸積累的一種代謝性疾病。目前,研究者已將瘤胃pH值作為衡量SARA發(fā)生與否的最有效指標(biāo)。Yang和Beauchemin認(rèn)為可以把瘤胃pH值低于5.8作為衡量SARA發(fā)生的臨界pH值。本研究顯示,與飼喂精粗比4∶6日糧相比,飼喂精粗比6∶4日糧2周后的山羊瘤胃液pH值在飼喂后1h開始低于5.8,并一直持續(xù)6h后才緩慢上升,試驗(yàn)后期動(dòng)物出現(xiàn)厭食、精神萎靡等典型的亞急性酸中毒癥狀,從而表明本試驗(yàn)已成功誘導(dǎo)泌乳期山羊亞急性瘤胃酸中毒。目前有關(guān)反芻動(dòng)物在SARA期間瘤胃內(nèi)是否存在乳酸以及乳酸含量的范圍尚不清楚。Krause和Oetzel研究發(fā)現(xiàn),奶牛發(fā)生SARA時(shí)瘤胃內(nèi)乳酸濃度為0.45~0.74mmol/L;Keunen等報(bào)道奶牛瘤胃液中乳酸含量小于10mmol/L;胡紅蓮等認(rèn)為,當(dāng)日糧中非纖維性碳水化合物/中性洗滌纖維(NFC/NDF)達(dá)到2.58時(shí),奶山羊瘤胃中才檢測(cè)到乳酸,但其含量低于0.1mmol/L。本研究發(fā)現(xiàn),瘤胃內(nèi)存在少量乳酸,其最高濃度低于1mmol/L,此結(jié)果與以往的報(bào)道相一致。正常情況下,當(dāng)瘤胃pH下降到6左右時(shí),乳酸生成菌迅速增加,而乳酸利用菌增長(zhǎng)速度較慢。本研究發(fā)現(xiàn),對(duì)照組山羊在采食后1h瘤胃液pH下降到6左右時(shí),乳酸含量激增,此后隨時(shí)間延長(zhǎng)乳酸逐漸被利用或吸收,出現(xiàn)乳酸濃度下降,之后恢復(fù)到采食前水平。SARA組山羊在飼喂后1h瘤胃內(nèi)乳酸沒(méi)有出現(xiàn)迅速升高,而是呈先降低后上升的過(guò)程,并且在采食后期極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。這可能是由于瘤胃長(zhǎng)期處于病理狀態(tài),菌群組成發(fā)生改變,也可能與高精料以及精料組成有關(guān)。據(jù)報(bào)道,苜蓿是高果膠(5%~10%)飼料,且富含鈣、鉀等堿性元素,具有較強(qiáng)的緩沖能力,果膠雖在瘤胃中降解快,但發(fā)酵產(chǎn)物是半乳糖醛酸,抑制了酸性乳酸菌的發(fā)酵,從而有助于瘤胃液pH值的穩(wěn)定。在本研究中,SARA組飼料中玉米和麩皮含量高,為乳酸生成菌提供充足的碳源和能源,其中麩皮能增強(qiáng)乳酸菌的耐酸性。因此,瘤胃內(nèi)乳酸的積累促進(jìn)了SARA酸中毒的發(fā)展,與以往的研究結(jié)果相一致。眾所周知,飼料的組成和消化利用率影響反芻動(dòng)物內(nèi)分泌水平和生產(chǎn)性能,SARA對(duì)反芻動(dòng)物內(nèi)分泌、乳成分和乳產(chǎn)量的影響及確切機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。3.2sara中瘤胃和血液中l(wèi)ps的變化脂多糖也是引發(fā)SARA的誘因之一。在正常生理狀態(tài)下,反芻動(dòng)物瘤胃和血液中含有少量LPS,肝臟和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)完全可以清除這些毒素,所以不會(huì)引發(fā)內(nèi)毒素血癥。而有資料報(bào)道,谷物誘導(dǎo)反芻動(dòng)物發(fā)生SARA時(shí)往往伴隨著瘤胃和血液中LPS的升高。SARA時(shí)瘤胃內(nèi)酸度逐漸增加,革蘭氏陰性菌大量裂解,釋放內(nèi)毒素———細(xì)胞壁主要成分LPS,損傷侵染瘤胃壁并少量轉(zhuǎn)移至血液,導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥。本試驗(yàn)研究結(jié)果與以往報(bào)道相一致,SARA組山羊血液中LPS含量顯著高于正常組,日糧處理對(duì)瘤胃液和血漿內(nèi)LPS均有顯著性影響,并且無(wú)論是采食前還是采食后,SARA組瘤胃液和血漿內(nèi)都含有高濃度LPS,提示系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的存在,而LPS的增加可能反過(guò)來(lái)又加劇了SARA的病情,提示LPS與SARA之間具有相輔相成的效應(yīng)。3.3u3000para組在工況中皮質(zhì)醇的變化目前,有關(guān)SARA期間體內(nèi)皮質(zhì)醇濃度變化的研究較少,但注射LPS或IL-6均可引起皮質(zhì)醇的升高。奶牛注射LPS后其外周血中皮質(zhì)醇和腫瘤壞死因子濃度升高,LPS可刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞引起血液皮質(zhì)醇、促乳素和腫瘤壞死因子濃度的增加,而免疫細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子導(dǎo)致應(yīng)激軸HPA軸的激活。Niel等的研究證明,給綿羊注射IL-6可引起外周血促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇濃度的升高,并將這2項(xiàng)指標(biāo)作為HPA軸激活的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn),SARA組在采食前血漿皮質(zhì)醇濃度均高于對(duì)照組,提示SARA組山羊HPA軸被激活,機(jī)體可能處于一種慢性應(yīng)激狀態(tài)。本研究還發(fā)現(xiàn)瘤胃液中也存在皮質(zhì)醇,但濃度顯著低于血漿中濃度,關(guān)于瘤胃內(nèi)皮質(zhì)醇的來(lái)源,可能是經(jīng)血流通過(guò)唾液和瘤胃壁進(jìn)入瘤胃(內(nèi)源性)。有學(xué)者指出,反芻動(dòng)物下丘腦-垂體-靶細(xì)胞分泌的激素可以作用于機(jī)體特殊的靶細(xì)胞———瘤胃微生物而影響瘤胃代謝,瘤胃內(nèi)容物存在內(nèi)分泌激素和遞質(zhì),如甾體類激素17β-雌二醇,可參與調(diào)節(jié)瘤胃內(nèi)微生物的發(fā)酵。此外,本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)SARA組山羊瘤胃液中皮質(zhì)醇水平在采食后2~6h顯著高于對(duì)照組(P<0.05),并且日糧類型對(duì)瘤胃液中皮質(zhì)醇濃度具有極顯著影響(P=0.006)。而有關(guān)高濃度皮質(zhì)醇是否會(huì)對(duì)瘤胃發(fā)酵和瘤胃壁營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收產(chǎn)生影響,或者是否與內(nèi)毒素LPS一起促進(jìn)瘤胃壁的損傷造成內(nèi)毒素血癥,仍有待于進(jìn)一步研究。糖皮質(zhì)激素作為主要的應(yīng)激激素,參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、炎癥反應(yīng)和物質(zhì)代謝等功能,慢性應(yīng)激常導(dǎo)致機(jī)體物質(zhì)代謝的紊亂。肝臟作為體內(nèi)重要的物質(zhì)代謝器官,在糖、脂肪、蛋白質(zhì)和維生素等物質(zhì)代謝中起重要作用,肝臟上存在高豐度的糖皮質(zhì)激素受體GR,接受糖皮質(zhì)激素的信息并作出適應(yīng)性調(diào)節(jié)。本試驗(yàn)中,
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