廢用性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的構(gòu)建

廢用性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的構(gòu)建

骨松（癥狀）是一種全身骨疾病，具有低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)退化的特點(diǎn)。隨著骨干部分的敏感性增加，容易發(fā)生骨折。廢用性骨質(zhì)疏松(disusedosteoporosis)屬繼發(fā)性骨質(zhì)疏松,是由于肌肉不活動(dòng)和負(fù)重減少引起的骨量丟失,依原因和環(huán)境因素不同可影響整個(gè)或部分骨骼系統(tǒng)。臨床上廢用性骨質(zhì)疏松常常繼發(fā)于骨折或其他手術(shù)后必要的不同程度的制動(dòng);中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脊髓或周?chē)窠?jīng)病變或損傷后引起的肌肉癱瘓[4~6];關(guān)節(jié)肌肉疾病導(dǎo)致的肌肉失活動(dòng);長(zhǎng)期的全身消耗性疾病;長(zhǎng)期工作生活于失重環(huán)境;長(zhǎng)期臥床。骨具有承重和支架作用,其生物力學(xué)性能是區(qū)別于其他組織的重要特點(diǎn),是描述骨生理功能的重要指標(biāo)之一。在廢用性骨質(zhì)疏松的發(fā)展過(guò)程中,骨的結(jié)構(gòu)和礦物質(zhì)含量發(fā)生了變化,這些變化都會(huì)影響到骨的生物力學(xué)性能,從而影響骨的承重和支架作用。所以,研究廢用性骨質(zhì)疏松的形成過(guò)程中骨生物力學(xué)性能的變化很有意義。構(gòu)建有效的廢用性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型很有必要。1材料和方法1.1動(dòng)物和模型的生產(chǎn)1.1.1動(dòng)物選擇8月齡日本大耳白兔(由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)55只,均為雄性,體重2.5~3.0kg。1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)全部放養(yǎng)于室內(nèi)寬敞的圈籠中(4.0m×3.0m×1.0m),保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由活動(dòng)。飼料和水放置于四角,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物須在籠中活動(dòng)才可覓到足夠食物。飲水為靜置的自來(lái)水,飼料由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。室溫控制在(25±3)°C,濕度60%,定期紫外線消毒與排風(fēng),保持12h光照和黑白交替。1.1.3作為空白對(duì)照組飼養(yǎng)適應(yīng)飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)石膏固定50只兔的右后肢作為實(shí)驗(yàn)側(cè),左側(cè)后肢作為自身對(duì)照側(cè),另5只作為空白對(duì)照組飼養(yǎng)3個(gè)月。使用聚氨酯石膏繃帶(韓國(guó)友三牌,Woosan)纏2~3層,至髖關(guān)節(jié)并保持膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)于伸直位,然后繼續(xù)放養(yǎng),自由活動(dòng)。每?jī)芍芨鼡Q石膏,避免石膏松動(dòng)和肢體壓瘡。1.1.4生物力學(xué)測(cè)定分別于石膏固定后2、4、6、8、12周采用氣栓法處死10只兔。解剖雙側(cè)脛腓骨,浮力法測(cè)量體積,然后置-20℃冰箱保存,供生物力學(xué)試驗(yàn)用。雙側(cè)跖骨10%中性甲醛固定,供組織學(xué)觀察。1.2骨骼生物力的測(cè)定1.2.1測(cè)試長(zhǎng)度取實(shí)驗(yàn)側(cè)和對(duì)照側(cè)脛腓骨(在骨生物力學(xué)性能測(cè)定稱試件),用游標(biāo)卡尺測(cè)量其總長(zhǎng)度。用薄塑料紙包裹試件,防止試驗(yàn)過(guò)程中試件干燥,及便于收集生物力學(xué)試驗(yàn)時(shí)碎裂的骨組織。1.2.2試件的長(zhǎng)度和直徑使用GELightspeed型、4層螺旋CT掃描試件的全長(zhǎng),eFilmTM2.0(MergeTechnologiesIncorporated)軟件測(cè)量試件的直徑。1.2.3測(cè)試安裝試件兩端用自凝樹(shù)脂包埋固定。固定時(shí)保持試件豎直,包埋深度一致,自凝樹(shù)脂基托與試驗(yàn)機(jī)的接觸面水平光滑。1.2.4壓縮試驗(yàn)和加載固定好的試件于天津大學(xué)機(jī)械學(xué)院力學(xué)工程實(shí)驗(yàn)中心提供的CSS-44100型電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(長(zhǎng)春試驗(yàn)機(jī)研究所制造)上進(jìn)行壓縮試驗(yàn)。測(cè)量加載于試件兩端的不同壓力下試件長(zhǎng)度縮短的量。壓力加載的速率是2.00mm/min。將脛腓骨橫截面看成近似橢圓形,通過(guò)載荷-變形曲線計(jì)算彈性模量。1.3樣品的制備及測(cè)定收集經(jīng)過(guò)生物力學(xué)試驗(yàn)的脛腓骨,用粉碎機(jī)將樣品粉碎并充分混勻,以四分法取樣。準(zhǔn)確稱取0.5000g樣品置于HYP-Ⅱ消化爐中消化,制成透明的待測(cè)樣品溶液,同時(shí)制備試劑空白溶液。用180-80型火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定消解溶液的吸光度值,并以濃度直讀方式測(cè)定定容溶液中鈣元素的含量,用試劑空白調(diào)零。鈣含量按GB12398-90中的有關(guān)公式進(jìn)行計(jì)算。1.4組織社會(huì)學(xué)取雙側(cè)跖骨頭,30%甲酸脫鈣,梯度酒精脫水,浸蠟,包埋,連續(xù)切片,進(jìn)行HE染色和Masson染色,然后觀察組織學(xué)特點(diǎn)。1.5統(tǒng)計(jì)方法2結(jié)果2.1實(shí)驗(yàn)側(cè)異形菌在不同固定時(shí)間后彈性模量和骨鈣含量之間的差別實(shí)驗(yàn)側(cè)間、實(shí)驗(yàn)側(cè)和對(duì)照側(cè)間、對(duì)照側(cè)和對(duì)照組間、對(duì)照側(cè)間比較結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)側(cè)脛腓骨在不同固定時(shí)間,最大負(fù)荷之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);實(shí)驗(yàn)側(cè)和對(duì)照側(cè)間最大載荷之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對(duì)照側(cè)和對(duì)照組間、對(duì)照側(cè)間最大載荷之間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)側(cè)脛腓骨在不同固定時(shí)間,彈性模量之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);實(shí)驗(yàn)側(cè)和對(duì)照側(cè)間彈性模量之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對(duì)照側(cè)和對(duì)照組間、對(duì)照側(cè)間彈性模量之間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)側(cè)脛腓骨在不同固定時(shí)間,骨鈣含量之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);實(shí)驗(yàn)側(cè)和對(duì)照側(cè)間骨鈣含量之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對(duì)照側(cè)和對(duì)照組間、對(duì)照側(cè)間骨鈣含量之間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.2驗(yàn)側(cè)與對(duì)側(cè)骨皮質(zhì)空白組和對(duì)照側(cè)跖骨頭骨皮質(zhì)較厚,孔隙較少,骨小梁排列緊密,結(jié)構(gòu)正常。而實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)側(cè)相比骨皮質(zhì)較薄,孔隙增多,骨小梁稀疏、纖細(xì)并有多處斷裂,小梁間吻合減少,骺板下區(qū)空曠,髓腔擴(kuò)大,破骨細(xì)胞數(shù)增多。新生成的膠原經(jīng)Masson染色為綠色,可見(jiàn)隨著廢用時(shí)間的延長(zhǎng),新生膠原的量也在減少(見(jiàn)圖1~2)。3骨組織的力學(xué)特性廢用性骨質(zhì)疏松在臨床上十分常見(jiàn),深入研究這一現(xiàn)象,可以找到更好的治療方法,對(duì)研究骨結(jié)構(gòu)代謝也很有意義。建立動(dòng)物模型有利于研究工作的展開(kāi)與深入。有效的動(dòng)物模型首先應(yīng)能夠模擬病變過(guò)程、病理改變和疾病轉(zhuǎn)歸。早在1638年伽利略(Galileo)就提出重力對(duì)決定骨骼的大小和形態(tài)有很重要的作用。Roux和Meyer通過(guò)研究,提出機(jī)械外力決定了骨骼的結(jié)構(gòu)的論述。JuliusWolff提出了骨骼的功能適應(yīng)學(xué)說(shuō),他利用數(shù)學(xué)定律限定了骨骼的形成和機(jī)械應(yīng)力之間的關(guān)系——Wolff的骨骼改適定律(Wolff’slawofbonetransformation),即骨小梁的厚度與數(shù)量,也即骨骼質(zhì)量的分布,應(yīng)與機(jī)械應(yīng)力的量化分布相一致,而且骨小梁必須是被軸向的壓縮或牽拉。Frost著眼于骨適應(yīng)于機(jī)械應(yīng)力的機(jī)制,提出了“力學(xué)穩(wěn)定性理論”。Frost認(rèn)為骨的構(gòu)建(骨改變它的形態(tài)以適應(yīng)其負(fù)載環(huán)境的過(guò)程)與改建(骨被吸收或在原位被新骨取代的過(guò)程)過(guò)程是由一個(gè)反饋系統(tǒng)所控制的,這個(gè)系統(tǒng)中機(jī)械應(yīng)變的變化驅(qū)動(dòng)著這兩個(gè)過(guò)程,并相應(yīng)地調(diào)整骨的結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)代病理學(xué)、生理學(xué)和分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),日?；顒?dòng)中的肌肉收縮產(chǎn)生的外力作用,使骨組織產(chǎn)生變形和微缺損。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)在骨組織中,骨細(xì)胞陷窩-骨小管系統(tǒng)形成無(wú)處不達(dá)的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),該系統(tǒng)是骨組織的力學(xué)感受器。外力作用使骨組織的變形和微缺損引起骨小管內(nèi)液的流動(dòng),產(chǎn)生剪切應(yīng)力和流動(dòng)電壓,作用于骨細(xì)胞突起表面的刷狀微絲使其產(chǎn)生電位變化或激活其表面感受器,進(jìn)而使骨細(xì)胞內(nèi)發(fā)生連鎖的生物學(xué)反應(yīng),合成生物化學(xué)信號(hào)指令,通過(guò)間隙連接傳遞到骨表面的骨襯細(xì)胞,使其合成和分泌有關(guān)因子。進(jìn)而激活骨塑建或骨重建等骨生物調(diào)節(jié)機(jī)制,通過(guò)自我更新來(lái)修復(fù)微缺損或通過(guò)自我調(diào)整來(lái)適應(yīng)新的力學(xué)環(huán)境。在本研究中,我們將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一側(cè)后肢用石膏管型固定并縛于軀干上,負(fù)重減少。而且由于該肢體用石膏管型固定后無(wú)法活動(dòng),肌肉就不能產(chǎn)生有效的生理性收縮,相應(yīng)的骨在生理上最主要的應(yīng)力刺激就會(huì)明顯減少,骨所處的生物力學(xué)環(huán)境就發(fā)生了變化。根據(jù)Wolff定律,骨量就要相應(yīng)的進(jìn)行調(diào)整,其生物力學(xué)性質(zhì)就要發(fā)生變化。骨生物力學(xué)基本特性的綜合表現(xiàn)特性就是應(yīng)力和應(yīng)變的關(guān)系。在外力的作用下,骨的應(yīng)變是隨應(yīng)力變化而改變的。它們的關(guān)系可分為兩個(gè)階段:彈性階段和塑性階段。在彈性階段,應(yīng)力-應(yīng)變曲線的斜率稱為彈性模量,用來(lái)測(cè)量骨組織的內(nèi)硬度。這一指標(biāo)主要反映了骨組織的材料特性,與材料的量的大小無(wú)關(guān)。在本研究中結(jié)果顯示,各固定時(shí)期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受固定肢體(實(shí)驗(yàn)側(cè))骨的彈性模量,都與對(duì)側(cè)沒(méi)有固定繼續(xù)承重并正常活動(dòng)的肢體(對(duì)照側(cè))以及對(duì)照組有很大差別。脛骨骨鈣含量也有相類(lèi)似的結(jié)果,即隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)側(cè)鈣含量減少,而對(duì)照側(cè)和對(duì)照組的差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)側(cè)肢體被固定之后,失去了正常骨結(jié)構(gòu)代謝所需要的肌肉牽拉應(yīng)力和重力的刺激。骨組織承受的應(yīng)力低于骨重建閾值,骨重建機(jī)制激活,使骨吸收量大于骨形成量,骨單位骨量平衡為負(fù),骨總量減少。而對(duì)照側(cè)肢體仍能正?；顒?dòng),其骨組織所受到的應(yīng)力刺激變化沒(méi)有實(shí)驗(yàn)側(cè)那樣極端、明顯。實(shí)驗(yàn)側(cè)骨組織礦鹽沉積減少,膠原結(jié)構(gòu)疏松、紊亂,骨小梁稀疏,皮質(zhì)骨單位減少,從而骨組織的材料力學(xué)特性發(fā)生變化。骨組織彈性模量的變化表明,實(shí)驗(yàn)側(cè)骨組織在受到與對(duì)照側(cè)相同的外界應(yīng)力作用時(shí),發(fā)生的應(yīng)變要大于對(duì)照側(cè),也就是說(shuō),實(shí)驗(yàn)側(cè)骨組織更容易變形。而對(duì)照側(cè)和對(duì)照組的肢體處于正常的負(fù)重狀態(tài),骨受到的應(yīng)力刺激相似,骨改建活動(dòng)沒(méi)有明顯異常變化,反映到彈性模量和鈣含量上差別也就不顯著。本研究的組織形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn),隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)側(cè)骨皮質(zhì)變薄,孔隙增多,骨小梁稀疏、纖細(xì)并有多處斷裂,小梁間吻合減少,骺板下區(qū)空曠,髓腔擴(kuò)大,破骨細(xì)胞數(shù)增多,新生成的膠原的量也在減少。骨組織中主要成分是I型膠原、基質(zhì)粘多糖、鈣化物。膠原形成后會(huì)逐漸老化,老化的膠原排列更規(guī)律、更致密,交鏈增加,從而使膠原電荷特性的改變,引起染色的變化。成熟骨的Masson三色染色,膠原著鮮紅色,新生骨在成熟過(guò)程中著綠色至紅-綠相間。Masson三色對(duì)骨組織膠原的染色反應(yīng)和膠原成熟程度有關(guān),因此可以用來(lái)評(píng)價(jià)骨質(zhì)的成熟程度,特別是在廢用性骨質(zhì)疏松形成過(guò)程中。同樣也可以用此染色觀察骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活動(dòng)狀況,在這些細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)的綠色著染膠原系新生部分,明顯不同于已成熟的外圍部紅色膠原,細(xì)胞周?chē)G染區(qū)域的大小,代表著這些細(xì)胞新近的活動(dòng)程度。膠原纖維的力學(xué)特性以其正常結(jié)構(gòu)為物質(zhì)基礎(chǔ)。形成膠原纖維的任一環(huán)節(jié)發(fā)生改變都可引起膠原合成減少或結(jié)構(gòu)變異,從而引起膠原纖維的力學(xué)特征發(fā)生異常。實(shí)現(xiàn)廢用性骨質(zhì)疏松有效的方法為避免骨骼的負(fù)重。本研究應(yīng)用石膏繃帶固定造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一側(cè)肢體制動(dòng),被固定的肢體活動(dòng)時(shí),石膏管型替代該肢體承擔(dān)體重,相當(dāng)于沒(méi)有體重這一應(yīng)力施加于骨骼上。而且關(guān)節(jié)固定肌肉就不能產(chǎn)生有效的生理性收縮,對(duì)骨的應(yīng)力刺激減少,從而造成了骨質(zhì)疏松。這種構(gòu)建廢用性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的方法是本研究的特色。這種方法簡(jiǎn)便、有效、易于實(shí)現(xiàn)。該廢用性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型可以了解骨、關(guān)節(jié)軟骨、肌肉、神經(jīng)和血管等組織的變化?？稍诓鸪潭ê蠡謴?fù)活動(dòng),構(gòu)建廢用性骨質(zhì)疏松逆轉(zhuǎn)模型。通過(guò)本研究可以認(rèn)識(shí)到在生理情況下,骨代