實驗二基因的PCR擴增技術

實驗二基因的PCR擴增技術一、實驗目的1、學習PCR反應的基本原理與實驗技術2、從BCG基因組DNA中PCR擴增Rv1791（PE19）基因二、基本原理1、PCR類似于DNA的天然復制過程。2、將待擴增的DNA片段與其兩側互補的兩段寡核苷酸引物，經變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增倍數可達2n倍。3、DNA的變性和復性1）加熱或強酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。2）解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復,這稱DNA復性,也叫退火。三、實驗材料BCG基因組DNA10′PCR反應緩沖液、4′dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、引物（P1、P2）、超純水SWPCR反應管、移液器、PCR儀、離心機四、實驗步驟引物設計準備PCR反應溶液PCR擴增反應結果檢測Rv1791-F：ATGAATTCAGGAAGACAGCATGTCGTTC（EcoRI）Rv1791-R：ATCTCGAGTGTTCCCCCTCTCCTTCAG（XhoI）（二）準備PCR反應溶液10×PCR反應緩沖液2.5μl4×dNTPs2.0μl引物P11μl（10nM）引物P21μl模板DNA2μlTaqDNA聚合酶0.2μl用無菌去離子水至25μl↓用手指輕彈PCR反應管管底部，使溶液混勻↓在臺式離心機中離心2秒以集中溶液于管底（三）PCR擴增反應在PCR儀中設計如下反應程序：94°C、5min；94°C、30sec，61°C、40sec，72°C、30sec，30個循環(huán)；72°C、5min將已混勻的PCR（四）結果檢測本PCR擴增的產物DNA片段長度為300bp，適合于在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。從每個反應管中取5ulPCR產物進行電泳檢測。五、實驗結果與分析本組實驗序號為41號。Rv1791（PE19）基因的分子量在250bp-500bp之間，符合已知數據DNA分子量是300bp，PCR擴增成功。本組實驗PCR擴增的DNA量較少，可能原因有實驗一時提取的DNA含量較少，DNA未與PCR反應溶液混合均勻。六、思考題影響PCR結果的因素。解:1.外部因素對實驗結果的影響：不同PCR儀品牌與型號在溫度控制性能上的不同直接影響了三種溫度平臺的溫度的準確性和不均一性，因而影響了整個PCR反應的實驗結果。另外，升溫速度的不同，溫度下降梯度的不均一性，溫度過低，溫度過沖，也是重要的因素。最差的情況，一個本該陽性的結果卻可能得出陰性的結果。對于實時PCR，熒光信號輸出和產量/溶解曲線，直接與溫度控制有關系，而這些結果很可能是戲劇性的。2.PCR儀器之間的差別對實驗結果的影響：沒有任何兩臺PCR儀器的溫度控制是一模一樣的。相對于預設的溫度模塊溫度總是偏高或偏低，就是同一模塊不同的孔之間，溫度有時也會不一樣，相差可能達幾攝氏度之多。一些PCR儀溫度控制性能的不足造成的后果是：當PCR儀的模塊溫度在升溫時，溫度過沖或不足，不能準確的達到預設的平臺溫度。3.溫度控制技術的差別對實驗結果的影響：使PCR儀模塊的溫度達到并保持在某一溫度有很多方式。每一種方式都有優(yōu)點和缺點。另外，這些技術被運用控制的水平對于溫度控制的水準是很重要的，且有很大不同。大多數PCR儀器的溫度控制性能是很差的。在單一或多傳感器控制機制上的不同顯而易見的引起了溫度的不均一性。4.儀器老化對實驗結果的影響：雖然PCR儀沒有任何的機械或可移動部件，但是那并不意味著它不會磨損。電子器件的性能會隨著時間的延長而老化，并由于過度的使用而加速老化。Peltier器件的失效或磨損會引起模塊的熱斑或冷斑，通常PCR儀器不能識別這種由于機械磨損，模塊延展和收縮效應引起的溫控性能的不同。因此，為掌握這些情況，實時監(jiān)測PCR儀的溫度控制性能是重要的。出于同樣的原因,PCR儀溫控性能的失常通常是實驗失敗或毀壞循環(huán)反應的重要原因。

5.實驗室認證：根據以上的論點，很多實驗室