大遼河入海口柱狀沉積物微生物種群的垂直分布及影響因素

大遼河入?？谥鶢畛练e物微生物種群的垂直分布及影響因素

1沉積物微生物群落分布特征大遼河水系由漢江、太子河和大遼河組成，最后從港口入海，全長(zhǎng)94公里。大遼河流區(qū)地勢(shì)密集，工農(nóng)業(yè)相對(duì)發(fā)達(dá)。結(jié)果表明，大規(guī)模處理的工農(nóng)業(yè)和城市化進(jìn)程對(duì)大遼河的水體造成了嚴(yán)重污染。根據(jù)最近的研究，在大遼河水系的水相和沉積物相中發(fā)現(xiàn)了一定含量的多環(huán)芳烴、石油烴、有機(jī)氯農(nóng)藥和其他化學(xué)品。這些污染物對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅（郭偉等，2007；王浩正等，2007；guiretal.，2008）。沉積物是河流中化學(xué)和生物材料高度聚集的地區(qū)。沉積物中微生物的生物降解和生物轉(zhuǎn)化對(duì)水體的物質(zhì)循環(huán)過(guò)程中的生物反應(yīng)具有重要影響（朱耶特，1997；朱耶特，2001）。了解沉積物中微生物群落的分布特征，了解污染的歷史，闡明污染物的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化規(guī)律，對(duì)生物修復(fù)污染系統(tǒng)具有重要意義。國(guó)內(nèi)外科學(xué)家也對(duì)不同區(qū)域海上和水庫(kù)等水生沉積物的微生物分布特征進(jìn)行了相關(guān)研究，但對(duì)大遼河大陸河沉積物的微生物分布特征研究較少（朱耶特，2001；盧舍特，2003；楊曼特爾，2003；曲建燕等，2005；李濤等，2008）。采用plfa法（大遼河水系典型河流沉積物的生物分布特征進(jìn)行了研究，但未報(bào)道大遼河入海口周圍沉積物的生物分布特征。由于沉積物環(huán)境微生物的復(fù)雜性,傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)方法很難對(duì)其群落構(gòu)成及分布特征進(jìn)行有效分析.目前,基于16SrDNA的微生物群落多態(tài)性分析技術(shù),如末端限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析(簡(jiǎn)稱T-RFLP)、變性梯度凝膠電泳(簡(jiǎn)稱DGGE)、寡核苷酸探針熒光原位雜交(FluorescenceinSituHybridization,FISH)等,已經(jīng)成為研究海洋、湖泊及河流沉積物微生物特征的重要手段(Brossaetal.,1998;Koizumietal.,2003;Chanetal.,2005;Buhringetal.,2005).FISH方法主要是利用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針與環(huán)境樣品中的微生物原位雜交,并通過(guò)激光共聚集掃描顯微鏡或表面熒光顯微鏡觀察,進(jìn)行特異微生物的檢測(cè)分析.該方法具有操作簡(jiǎn)單、儀器要求低、定量及定性程度高等優(yōu)點(diǎn),多用于廢水處理系統(tǒng)、飲用水凈化系統(tǒng)及土壤中特異微生物的檢測(cè),針對(duì)沉積物中微生物的群落分析的應(yīng)用還比較少(Amannetal.,2000;Wagneretal.,2002).本研究中針對(duì)大遼河入海口柱狀沉積物,首次采用FISH技術(shù)對(duì)沉積物中微生物數(shù)量及群落垂直分布特征進(jìn)行分析,并考察沉積物理化特性對(duì)微生物分布的影響,旨在揭示該區(qū)域微生物垂直分布規(guī)律及形成機(jī)制.2材料和方法表面活性劑2.1單元采集和分析2007年8月采用柱芯采樣器在大遼河入?？?北緯40°40′57″東經(jīng)122°12′16.1″)位置采集深度為43.5cm的柱狀沉積物,并按2cm(0～10cm深度)和3cm(10～43.5cm深度)間隔切割成17個(gè)單元,轉(zhuǎn)移到無(wú)菌樣品盒中,4℃下保存待分析.2.2熒光染料合成本研究使用的寡核苷酸探針包括:EUB338(I-III),NON338和ARCH915(FITC標(biāo)記,大連寶生物工程有限公司合成),ALF1b、BET42a和GAM42a(CY3標(biāo)記,上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成),具體見(jiàn)表1.熒光染料采用5-(4,6-二氯三吖嗪)氨基熒光染料(5-(4,6-dichlorotriazinyl)aminofluorescein,DTAF).2.3dnaaf的制備沉積物中微生物的DTAF染色及FISH檢測(cè)簡(jiǎn)要步驟如下.①樣品的預(yù)處理:取沉積物樣品用4%多聚甲醛在4℃下固定4～6h;然后用1×PBS緩沖液洗滌3次,在4℃、12000r·min-1條件下離心;取0.1mL樣品于涂有粘附劑的載玻片上,室溫下自然風(fēng)干;將風(fēng)干后的樣品,分別在50%、80%及100%的乙醇中室溫下脫水3min,自然風(fēng)干.②雜交及染色:在脫水后的樣品上滴加8μL雜交液,再在雜交液上均勻地滴加2μL探針溶液,為了防止雜交液的蒸發(fā),在暗盒中放入用2×SSC淋濕的沙布,以保證濕度,46℃雜交8h;DTAF配制成終濃度為0.1mg·mL-1的溶液,滴加20μLDTAF溶液于脫水后的樣品上,在黑暗、65℃條件下染色60min.③探針/DTAF的洗脫:將雜交后的玻片從濕盒中取出,放入含有50mL預(yù)熱的洗脫液中,在48℃下浸泡20min;然后在室溫下,用2×SSC清洗10min,風(fēng)干;再用1×PBS清洗5min,風(fēng)干,最后用重蒸水清洗2～3次,每次5min,風(fēng)干.將風(fēng)干后的玻片用指甲油封片,-20℃保存待鏡檢.雜交液組分:0.01%SDS(w/v,0.01gSDS溶解到100mL水中);Tris-HCL(pH=7.2,終濃度為20mmol·L-1);20%～35%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))去離子甲酰胺(DAF)(根據(jù)探針不同而進(jìn)行調(diào)整)和0.9mol·L-1NaCl.洗脫液組分:0.01%(w/v)SDS;Tris-HCL(pH=7.2,終濃度為20mmol·L-1)和102mmol·L-1NaCl.20×SSC組分:0.3mol·L-1檸檬酸三鈉和3mol·L-1NaCl.2.4染色細(xì)菌數(shù)量FISH的結(jié)果采用激光共聚焦掃描顯微鏡LSM-510(Carlzeiss,Jena,Germany)檢測(cè),FITC標(biāo)記探針雜交的樣品采用488nm的激光激發(fā);而Cy3標(biāo)記探針雜交的樣品采用543nm的激光激發(fā);DTAF染色樣品采用543nm的激光激發(fā).細(xì)菌數(shù)量計(jì)算公式為:N=B×M×D/V(1)式中,N為單位體積的細(xì)菌數(shù)量;B為顯微鏡視野細(xì)菌平均數(shù)量;M為樣品體積與視野體積的比值;D為樣品稀釋倍數(shù);V為雜交樣品體積.沉積物粒徑分析采用Shimadzu,SALD-3001激光粒度分析儀(Japan),有機(jī)碳分析采用HighTOCΠ(GermanyElementa),冷蒸氣-原子熒光光譜法測(cè)定(XGY-1011A型,中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院物化探所實(shí)驗(yàn)工廠).3結(jié)果結(jié)果3.1fish方法檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量的情況對(duì)柱狀沉積物樣品進(jìn)行單元切割后,分別用DTAF熒光染料染色及EUB338寡核苷酸探針雜交方法對(duì)不同深度沉積物細(xì)胞總數(shù)及細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖1所示.用DTAF染色計(jì)得的微生物細(xì)胞總數(shù)與EUB338探針雜交計(jì)得的細(xì)菌總數(shù)呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì).在0～5cm處,微生物細(xì)胞數(shù)量最多,達(dá)到20.1×108cell·cm-3;此后數(shù)量迅速下降,在11.5cm處降到最低為7.9×108cell·cm-3,之后其數(shù)量變化不大;只是在23.5～29.5cm處數(shù)量略有增加達(dá)到13.3×108～15.2×108cell·cm-3.FISH方法檢測(cè)出細(xì)菌數(shù)量在2～4cm處最高,達(dá)到14.4×108個(gè)·cm-3;10～13cm處最低,只有5.1×108個(gè)·cm-3.細(xì)菌檢出率(detectionfrequency)(細(xì)菌檢出量與DTAF計(jì)得細(xì)胞總數(shù)之比)平均值為75.4%.41～43.5cm處細(xì)菌檢出率高達(dá)96.3%,分析可能是探針與該點(diǎn)沉積物中無(wú)機(jī)顆粒結(jié)合造成假陽(yáng)性結(jié)果所致.除該點(diǎn)外,細(xì)菌檢出率為62%～85%.可見(jiàn),沉積物中主要以細(xì)菌為主.3.2細(xì)菌數(shù)量與含砂量的關(guān)系沉積物中微生物的種群及數(shù)量分布是沉積環(huán)境長(zhǎng)期演變的結(jié)果,受到諸多因素的影響,如沉積物的粒度構(gòu)成、有機(jī)質(zhì)含量、污染水平及污染物種類等.鑒于實(shí)驗(yàn)條件限制,本研究中并未能夠全面分析沉積物各項(xiàng)理化特性指標(biāo);但根據(jù)本課題前期研究成果發(fā)現(xiàn),大遼河沉積物受到有機(jī)物和重金屬,特別是汞污染較重,故測(cè)定了該柱狀沉積物中總有機(jī)碳(TOC)、有機(jī)質(zhì)、粒度構(gòu)成及重金屬汞含量垂直分布(見(jiàn)表1),并考察了這些理化特性與細(xì)菌數(shù)量之間的關(guān)系,結(jié)果如圖2、3和4所示.統(tǒng)計(jì)分析表明,沉積物中細(xì)菌數(shù)量與粘土質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)(圖2),與含砂量呈負(fù)相關(guān)(Pearson系數(shù)分別為0.513和0.493).分析可能原因有:粘土含量高,有機(jī)質(zhì)容易附著和沉積;本研究發(fā)現(xiàn)粘土含量與TOC及有機(jī)質(zhì)之間均呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系(Pearson系數(shù)分別為0.566和0.567)也佐證了這一點(diǎn),有機(jī)質(zhì)的增加為微生物生長(zhǎng)提供了必要的碳源和能源,促進(jìn)了細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖.此外,粘土作為粘性介質(zhì)更容易吸附和附著微生物,而含砂量高的沉積物特性恰好與此相反.細(xì)菌數(shù)量與TOC及有機(jī)質(zhì)含量之間不嚴(yán)格相關(guān),但總體看來(lái),當(dāng)TOC含量明顯增加時(shí),細(xì)菌數(shù)量也相對(duì)較高(圖3).細(xì)菌數(shù)量隨汞含量變化不明顯,分析可能是沉積物中汞含量相對(duì)較低(0.05～0.12mg·kg-1),尚未對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生顯著抑制作用.3.3不同深度、不同組織形態(tài)微生物群落特征及古細(xì)菌數(shù)量變形桿菌是最多種多樣的細(xì)菌類群,有380多個(gè)屬和1300個(gè)種,分為5個(gè)亞群,分別為α-、β-、γ-、δ-和ε-變形菌綱,其中α-、β-和γ-變形桿菌是細(xì)菌的主要類群.通過(guò)沉積物樣品與ALF1b、BET42a和GAM42a寡核苷酸熒光探針進(jìn)行原位雜交,考察了柱狀樣沉積物不同深度細(xì)菌亞群的分布;古細(xì)菌是有別于細(xì)菌的另一類重要的微生物類群,采用ARCH915基因探針考察了古細(xì)菌分布狀況,結(jié)果如圖5所示.圖5a～5c表明,α-、β-和γ-變形桿菌在沉積物柱狀樣中普遍存在,但在不同深度分布各不相同.α-變形桿菌數(shù)量在12.1×107～29.0×107個(gè)·cm-3之間,在0～35cm之間其數(shù)量比較穩(wěn)定,為9.5×107～23.1×107個(gè)·cm-3;在35～38cm深度處,α-變形桿菌數(shù)量最高,達(dá)到29.0×107個(gè)·cm-3.不同深度處β-變形桿菌數(shù)量變化不大,穩(wěn)定在6.5×107～15.4×107個(gè)cm-3之間.γ-變形桿菌數(shù)量在10.9×107～34.6×107個(gè)·cm-3之間,在表層1cm深度處,γ-變形桿菌數(shù)量最高,達(dá)到34.6×107個(gè)·cm-3;38.5cm深度處數(shù)量最低只有10.9×107個(gè)·cm-3.總體看來(lái),γ-變形桿菌數(shù)量隨深度的增加而略有降低.α-、β-和γ-變形桿菌占細(xì)菌總量的百分比分別為9.5%～36.0%、7.0%～20.0%和12.4%～43.8%,可見(jiàn),γ-變形桿菌是該沉積物中的一類優(yōu)勢(shì)細(xì)菌亞群.三者之和占微生物細(xì)胞總檢出量的25.0%～65.6%.圖5d表明,柱狀沉積物不同深度均存在一定量的古細(xì)菌,其數(shù)量為1.5×107～11.2×107個(gè)·cm-3.在0～5cm深度處,古細(xì)菌檢出數(shù)量較少,僅為2.2×107～2.4×107個(gè)·cm-3;在7～42cm之間,古細(xì)菌檢出數(shù)量較表層沉積物明顯增加,但隨深度增加有一定程度波動(dòng);在35.5cm處古細(xì)菌檢出數(shù)量最高,達(dá)到11.2×107cm-3.古細(xì)菌檢出量占細(xì)胞總檢出量的1.0%～11.8%.古細(xì)菌多在厭氧、嗜鹽、硫酸鹽還原等極端環(huán)境條件下生存,在本研究中古細(xì)菌在不同深度沉積物中的普遍存在,可能是由于入海河口沉積物受到較強(qiáng)的水力沖刷、生物或物理擾動(dòng)而使沉積物發(fā)生返混所致.沉積物不同深度微生物組成結(jié)構(gòu)如圖6所示.從圖中可以看出,除了4種探針檢測(cè)到的微生物類群外,還存在一定數(shù)量的其它微生物,這部分未檢測(cè)出的微生物占微生物細(xì)胞總數(shù)的23%～73%.可見(jiàn),本研究中采用的幾種探針并不能夠完全反映沉積物中微生物的群落分布信息,沉積物中可能還有其他優(yōu)勢(shì)微生物的存在,有必要結(jié)合更多的探針或其它微生物群落多態(tài)性研究方法做進(jìn)一步分析.4不同地域及特征水體沉積物細(xì)菌群落分布在本研究中,60%以上DTAF檢出細(xì)胞能夠與EUB338探針雜交,說(shuō)明沉積物中以細(xì)菌為主,該結(jié)果與國(guó)際上相關(guān)研究結(jié)果比較接近.Wobus等(2003)對(duì)德國(guó)Saxony水庫(kù)沉積物的微生物分布進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn),EUB338檢測(cè)出的細(xì)菌占DAPI(4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽)染色計(jì)得細(xì)胞總數(shù)的40%～80%.Rusch等(2003)采用FISH方法研究了中大西洋灣陸架砂質(zhì)區(qū)的沉積物中微生物分布,發(fā)現(xiàn)45%～56%的DAPI染色微生物屬于真細(xì)菌,真菌不足2%.從沉積物中微生物數(shù)量的垂直分布情況看,該柱狀沉積物表層微生物數(shù)量略高,DTAF染色計(jì)得的細(xì)胞總數(shù)范圍為7.9×108～20.1×108個(gè)·cm-3,符合文獻(xiàn)報(bào)道的沉積物微生物數(shù)量范圍(108～1011個(gè)·cm-3)(Brossaetal.,1998;Wobusetal.,2003).不同地域及特征水體,其沉積物數(shù)量垂直分布特征也不盡相同.屈建航等(2001)研究了官?gòu)d水庫(kù)沉積物不同深度細(xì)菌分布特征,得到了與本研究不同的結(jié)果;發(fā)現(xiàn)細(xì)菌數(shù)量垂直變化較大,中層(35cm)數(shù)量較高,上層(5cm)其次,下層(69cm)最少.德國(guó)Saxony水庫(kù)沉積物的微生物分布研究顯示,不同水庫(kù)、不同深度及不同取樣時(shí)間對(duì)沉積物微生物數(shù)量影響不大,處于不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的4個(gè)水庫(kù)沉積物微生物數(shù)量范圍為(1～6)×109個(gè)·mL-1,表層沉積物0～1cm處微生物的數(shù)量最多,為1×1010～1×1011個(gè)·g-1(Wobusetal.,2003).Brossa等(1998)對(duì)德國(guó)北海岸Wadden海某一海濱柱狀沉積物微生物采用FISH方法進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),表層1cm處含砂量高,微生物數(shù)量少,為6×108～8×108個(gè)·cm-3,在1.5cm砂泥界面,微生物數(shù)量增加到2.5×109個(gè)·cm-3.從沉積物中微生物的類群分布看,不同深度均檢測(cè)到一定含量的α-、β-和γ-變形桿菌,其中γ-變形桿菌為沉積物的優(yōu)勢(shì)菌,占細(xì)胞總檢出量的9.8%～40.8%.雖然國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明,變形桿菌是沉積物主要微生物類群,但不同特征沉積物占優(yōu)勢(shì)的變形桿菌類群有所不同.與本研究相似,太平洋結(jié)核區(qū)深海柱狀沉積物優(yōu)勢(shì)菌為γ-變形桿菌,官?gòu)d水庫(kù)沉積物優(yōu)勢(shì)菌為β-或γ-變形桿菌(屈建航等,2001;Xuetal.,2005).Wobus等(2003)對(duì)德國(guó)Saxony不同水庫(kù)沉積物的微生物分布進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),對(duì)于正常營(yíng)養(yǎng)水平的水庫(kù)沉積物,β-變形桿菌豐度最高,但其數(shù)量隨深度增加而有所下降;對(duì)于處于富營(yíng)養(yǎng)化的水庫(kù)沉積物,以γ-變形桿菌為優(yōu)勢(shì)菌(24%),認(rèn)為可能與腐殖質(zhì)含量高有關(guān).Schwarza等(2007)采用T-RFLP分析了處于缺氧狀態(tài)的深海湖Kinneret湖微生物多態(tài)性,發(fā)現(xiàn)沉積物以變