細(xì)菌crisprcas免疫機(jī)制研究進(jìn)展

細(xì)菌crisprcas免疫機(jī)制研究進(jìn)展

大多數(shù)生物利用ra指南來(lái)保護(hù)自己的免受外源基因?qū)ψ陨砣郝浜蜕憝h(huán)境的破壞，例如真核生物的鈉干擾。通過(guò)對(duì)大量的真細(xì)菌以及古細(xì)菌的基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn):已測(cè)序的將近40%的真細(xì)菌以及幾乎所有古細(xì)菌的基因組內(nèi)都包含有多種非自身基因,這些基因成簇存在,并且被短的重復(fù)回文序列(CRISPR)所分割,這些間隔序列與重復(fù)序列一起構(gòu)成了細(xì)菌基因組的CRISPR位點(diǎn)。在研究中發(fā)現(xiàn),含有非自身基因的細(xì)菌及古細(xì)菌具有免疫記憶功能,可以特異性地抵抗噬菌體以及侵襲性質(zhì)粒的二次感染。1細(xì)菌crisp-cas免疫1.1rna的干擾細(xì)菌的這種抗感染機(jī)制是通過(guò)類(lèi)RNA干擾(RNAi)實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)包含特異性間隔序列的小RNA片段(crRNA)作用于具有互補(bǔ)核酸序列的入侵噬菌體或質(zhì)粒的基因,破壞入侵的基因序列,特異性地抵抗感染。crRNA的干擾不被噬菌體的防御系統(tǒng)所限制,可以抑制外源基因?qū)ψ陨砘蚪M的破壞,從而保持自身基因組的完整性。RNAi與crRNAs介導(dǎo)的免疫最主要的區(qū)別在于酶種類(lèi)不同。并且在RNAi中,核心雙鏈RNA的長(zhǎng)度為21~28個(gè)核苷酸長(zhǎng)度;crRNAs由間隔序列以及部分重復(fù)序列組成,只間隔序列就有23~47個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。真細(xì)菌以及古細(xì)菌的這種獲得性免疫與基因的水平轉(zhuǎn)移、類(lèi)RNA干擾機(jī)制以及前體crRNA(pre-crRNA)的體內(nèi)切割密切相關(guān)。在這些過(guò)程中牽涉到新的間隔基因的獲得、整合,pre-crRNA的切割,自身CRISPR位點(diǎn)的更新。這與CRISPR相關(guān)基因(cas)以及體內(nèi)的一些其他因子密切相關(guān)。1.2crispr位點(diǎn)的基因序列分析肺炎雙球菌毒力因子之間的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)揭開(kāi)了人類(lèi)對(duì)于基因水平轉(zhuǎn)移認(rèn)識(shí)的序幕?；虻乃睫D(zhuǎn)移是指通過(guò)質(zhì)粒、病毒以及轉(zhuǎn)位因子等的轉(zhuǎn)染而獲得非自身基因的過(guò)程。基因的水平轉(zhuǎn)移、突變以及快速的繁殖實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌基因組的多樣性?；虻乃睫D(zhuǎn)移可以使細(xì)菌獲得多個(gè)母本菌的突變,如:抗生素抗性基因(β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷修飾酶)等有益突變,但是轉(zhuǎn)位基因插入基因組的位置以及基因本身有時(shí)表現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌的毒害作用,從而導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。所以有益突變得以在菌群中傳播,而毒害基因伴隨著細(xì)菌的死亡而消失。通過(guò)細(xì)菌的基因組分析認(rèn)為,存在于40%真細(xì)菌以及幾乎所有古細(xì)菌的CRISPR位點(diǎn)中的間隔序列是通過(guò)基因的水平轉(zhuǎn)移獲得的。主要是通過(guò)整合病毒或者質(zhì)粒DNA的基因序列到CRISPR位點(diǎn),從而獲得新的間隔序列。同時(shí),由于這些基因的存在使得菌體免受噬菌體及侵襲性質(zhì)粒對(duì)自身遺傳物質(zhì)的破壞,并且CRISPR位點(diǎn)的存在不會(huì)對(duì)細(xì)菌本身造成傷害,所以這些有益突變得以在菌體中穩(wěn)定存在。CRISPR位點(diǎn)的第一個(gè)重復(fù)序列的上游定位有CRISPR前導(dǎo)序列(leadersequence),啟動(dòng)子可能位于前導(dǎo)序列內(nèi)。CRISPR位點(diǎn)其他部分進(jìn)行一次性全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄,然后在cas蛋白以及其他因子的參與下,將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物切割為多種不同的crRNA片段,每個(gè)crRNA片段包括特異性的間隔序列以及重復(fù)序列片段。crRNA中的特異性間隔序列作為有效靶向性RNA,與入侵核酸結(jié)合,導(dǎo)致入侵核酸被降解;在間隔序列上帶有一定長(zhǎng)度的重復(fù)序列片段,在免疫識(shí)別方面具有重要的作用。2pr的亞型及基因序列cas基因特異性存在于含有CRISPR位點(diǎn)的菌體基因組中,定位在CRISPR位點(diǎn)附近,它是一個(gè)較大的多態(tài)性家族,具有多種亞型。CRISPR的亞型是由CRISPR的重復(fù)序列、前導(dǎo)序列以及cas基因共同決定的,并且三者之間存在著共進(jìn)化現(xiàn)象。根據(jù)cas基因在CRISPR位點(diǎn)的存在情況,可以分為三類(lèi):核心基因、亞型特異性基因以及RAMP(repeat-associatedmysteriousprotein)超家族。cas基因編碼的蛋白質(zhì)是一個(gè)大的蛋白質(zhì)家族,這些蛋白質(zhì)分別攜帶有典型的核酸酶、解旋酶、聚合酶以及多核苷酸結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域。2.1cas1基因編碼的基因功能核心基因目前已鑒定出六種:cas1、2、3、4、5、6。核心cas基因并不存在于所有的具有CRISPR位點(diǎn)的細(xì)菌中,但是這些基因在所有的CRISPR亞型中都有分布。核心基因最常見(jiàn)的排列方式是cas3-cas4-cas1-cas2。cas1、cas2是最基本的成員,存在于所有含有CRISPR位點(diǎn)的細(xì)菌中。各種核心cas基因編碼的蛋白的功能已經(jīng)基本得到驗(yàn)證。Cas1具有核酸結(jié)合蛋白活性以及核酸內(nèi)切酶活性,可以利用DNA酶活性裂解入侵的DNA以及CRISPR位點(diǎn),最終將入侵序列整合到CRISPR位點(diǎn)。Cas2被認(rèn)為是一種序列特異性的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶,切割富含U的單鏈RNA。Cas3是一種DNA酶,并且同時(shí)是一種依賴(lài)于ATP的解旋酶,Cas3的ATP依賴(lài)性解旋酶被認(rèn)為是一種動(dòng)力蛋白,協(xié)助核酸酶活性實(shí)現(xiàn)對(duì)CRISPR相關(guān)抗病毒(cascade)-crRNA復(fù)合物上DNA的切割。Cas4類(lèi)似于核酸外切酶的RecB家族,并且包含有一個(gè)富含Cys的結(jié)構(gòu)域,具有結(jié)合DNA的功能。Cas5蛋白包含一個(gè)保守的N-末端區(qū)域,但是C-末端在不同的CRISPR/cas亞型中是不同的,它們的平均長(zhǎng)度是250個(gè)氨基酸。Cas6是一種核酸內(nèi)切酶,將前體crRNA切割為crRNA單元(在5′端包括一個(gè)8核苷酸的重復(fù)序列),Cas6突變證明,Tyr31、His46可能是一種切割重復(fù)RNA的常規(guī)單元,Lys52可能用于維持轉(zhuǎn)換狀態(tài)。2.2通過(guò)pse3的鐵氧化還原蛋白亞型特異性基因類(lèi)型有:cse(1~4、5e)、csy(1~4)、csn(1~2)、csd(1~2)cas5d、cst(1~2)、cas5t、csh(1~2)、cas5h、csa(1~5)、cas5a、csm(1~5)。這些基因大部分參與pre-crRNA的切割,其中少部分基因的結(jié)構(gòu)與功能已經(jīng)被證實(shí):csn2(Cas7)可能參與到新間隔序列的識(shí)別及整合;Cse3上存在一個(gè)鐵氧化還原蛋白樣的折疊,總體結(jié)構(gòu)與許多的RNA結(jié)合蛋白相似。它對(duì)于pre-crRNA的成熟切割來(lái)說(shuō)是必需的;Csy4可以通過(guò)活性位點(diǎn)上保守的絲氨酸以及組氨酸活性位點(diǎn)有選擇性地結(jié)合pre-cRNA,并且進(jìn)行切割產(chǎn)生成熟的crRNAs;Csa3的N-端結(jié)構(gòu)域功能目前尚未確定,但是被認(rèn)為具有調(diào)節(jié)CRISPR/cas的功能。RAMP超家族基因包括:cmr(1~6)、csx(1~7)。目前,該家族的基因功能尚不明確。這些Cas蛋白作為一個(gè)功能集合體,主要功能是維護(hù)CRISPR位點(diǎn)的重復(fù)序列、獲得新的間隔序列、保證前導(dǎo)區(qū)域及重復(fù)區(qū)域在基因組中的擴(kuò)增以及CRISPR/cas基因的水平轉(zhuǎn)移。大腸桿菌K12菌株中,pre-crRNA與Cse1-Cse2-Cse4-Cas5e-Cse3形成的Cascade復(fù)合物結(jié)合,Cse3的功能是將pre-crRNA切割加工成crRNA。同時(shí),Cas在菌種間甚至是菌株之間存在著明顯,一些個(gè)體在一個(gè)CRISPR位點(diǎn)有20種Cas,而一些只有4種,這在很大程度上決定了細(xì)菌獲得性免疫的多樣性。3rna酶csrena,cs1從大腸桿菌、銅綠假單胞菌以及古細(xì)菌焦酚火球菌純化的Cas蛋白可以切割pre-crRNA形成成熟的crRNAs。因此,特異性的Cas蛋白對(duì)于菌體中的RNA切割來(lái)說(shuō)是必須、高效的。多Cas復(fù)合體可以完成pre-crRNA的切割,但是對(duì)于一些CRISPR亞型,其Cas種類(lèi)較少,比如:TypeⅡ(Nmeni/CASS4)亞型系統(tǒng)缺少cse3、cas6或者是csy4,無(wú)法形成具有活性的切割復(fù)合物。化膿鏈球菌只有四種Cas,但是Deltcheva等證實(shí)化膿鏈球菌可以利用RNA酶Ⅲ處理CRISPR位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的pre-crRNA。RNA酶Ⅲ是一種保守的內(nèi)源性核酸酶,可以切割雙鏈RNA并且參與核糖體RNA的成熟。反義RNA(tracrRNA)在RNA酶Ⅲ參與的前體RNA的切割中有著重要的作用。tracrRNA是一些冗余的短RNA,包括CRISPR重復(fù)序列的互補(bǔ)區(qū)域。在體外,tracrRNA可以與pre-crRNA發(fā)生退火,成為雙鏈RNA,為RNA酶Ⅲ提供模板。在體內(nèi),RNA酶Ⅲ對(duì)前RNA的切割需要Csn1的參與。Csn1是CRISPR家族的特異性Cas蛋白質(zhì)之一,它的特點(diǎn)是單拷貝重復(fù)(有時(shí)是直接的,有時(shí)是顛倒的),出現(xiàn)在CRISPR位點(diǎn)第一個(gè)基因的上游。在嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)中,Csn1不是crRNA介導(dǎo)免疫的必要組成成分。Csn1通過(guò)分子錨定作用促進(jìn)tracrRNA與pre-crRNA的堿基配對(duì),為隨后RNA酶Ⅲ對(duì)pre-crRNA的識(shí)別以及切割提供條件;同時(shí)Csn1可能有助于保護(hù)tracrRNA以及pre-crRNA免受其他RNA酶的切割。tracrRNA對(duì)于處理pre-crRNA成為活性的crRNAs是一種被TypeⅡ(Nmeni/CASS4)cas亞型所共有的RNA成熟機(jī)制。但是,是否所有的TypeⅡCRISPR位點(diǎn)都需要RNA酶Ⅲ的參與,需要進(jìn)一步驗(yàn)證。總體說(shuō)來(lái),tracrRNA介導(dǎo)的pre-crRNA的切割賦予細(xì)菌一種新的crRNA成熟策略,對(duì)免疫方式的多樣性以及CRISPR位點(diǎn)復(fù)雜的分子機(jī)理提供了新的解釋。4crispr堿基配的結(jié)構(gòu)免疫系統(tǒng)必須能夠區(qū)別自身與非自身,以免引起自身免疫疾病。動(dòng)物的后天性免疫系統(tǒng)中,T、B淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)陰性選擇來(lái)保證對(duì)自身成分的免疫耐受,而不發(fā)生免疫攻擊。crRNAs是從CRISPR位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄切割而得到的,具有結(jié)合CRISPR位點(diǎn)的能力。因此,對(duì)于真細(xì)菌以及古細(xì)菌crRNAs介導(dǎo)的獲得性免疫,必須有一種機(jī)制來(lái)區(qū)分自身與非自身的核酸成分,以確保crRNAs不會(huì)進(jìn)攻細(xì)菌自身的基因組成分造成菌體的死亡。通過(guò)構(gòu)建表皮葡萄球菌(S.epidermidis)CRISPR位點(diǎn)的間隔重復(fù)序列以及這個(gè)序列上游以及下游的各200個(gè)堿基對(duì)的pC194重組質(zhì)粒pCRISPR(wt),然后轉(zhuǎn)染野生型以及CRISPR缺失型細(xì)胞。試驗(yàn)結(jié)果表明,crRNA的冗余序列(非間隔序列成分)與重復(fù)序列的堿基配對(duì)失配,可以導(dǎo)致crRNA干擾細(xì)菌自身基因組。通過(guò)對(duì)-5到-2位的堿基突變說(shuō)明:保護(hù)細(xì)菌基因組免受crRNA的干擾破壞,必須保證最低限度的-4、-3、-2位的配對(duì)。同時(shí),-4到-2位點(diǎn)的2個(gè)連續(xù)的堿基缺失或者是突變對(duì)于crRNA的干擾發(fā)生是必需的。-5到-2位點(diǎn)的堿基區(qū)域的對(duì)于保護(hù)細(xì)菌自身的CRISPR位點(diǎn)來(lái)說(shuō)是一個(gè)關(guān)鍵區(qū)域。crRNA和CRISPRDNA重復(fù)之間的堿基配對(duì)阻止了自身免疫的發(fā)生。CRISPR通過(guò)crRNAs的潛在堿基配對(duì),不僅僅是一個(gè)配對(duì)的特異性靶點(diǎn),同時(shí)還有是間隔序列的外部序列。間隔序列外的差異性配對(duì)在所有的CRISPR系統(tǒng)中都存在,表明這種機(jī)理是所有免疫路徑面對(duì)自身免疫與非自身免疫時(shí)的普遍運(yùn)用的機(jī)理。cas基因表現(xiàn)出高度多樣性。因此,不同的CRISPR/cas亞型存在不同的機(jī)理。CRISPR的間隔序列之間的堿基序列是不同的,但是間隔區(qū)域之外的重復(fù)序列對(duì)于特定的菌體來(lái)說(shuō)是固有的。因此,這種區(qū)別異己的機(jī)理可以廣泛的運(yùn)用到細(xì)菌的獲得性免疫中。對(duì)于干擾發(fā)生來(lái)說(shuō),沒(méi)有特異性的堿基配對(duì)要求,導(dǎo)致干擾發(fā)生的決定性因素是crRNA與CRISPRDNA的堿基配對(duì)失敗。5新的毒力因子水平轉(zhuǎn)移技術(shù)crRNA介導(dǎo)的干擾免疫可以干擾噬菌體以及侵襲性質(zhì)粒的