丹紅注射液對(duì)腎缺血再灌注損傷和細(xì)胞間粘附分子1表達(dá)的影響

丹紅注射液對(duì)腎缺血再灌注損傷和細(xì)胞間粘附分子1表達(dá)的影響

腎衰竭的再植下努力是腎衰竭的主要原因之一。因此減輕缺血再灌注損傷可改善移植腎腎功,提高腎移植患者生存率。研究表明,丹紅注射液對(duì)心肌以及腦組織的缺血再灌注損傷有保護(hù)作用,但是否對(duì)移植腎缺血再灌注損傷有保護(hù)作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腎移植模型,探討丹紅注射液對(duì)移植腎缺血再灌注損傷是保護(hù)作用及可能機(jī)制。1材料和方法1.1體fps以封閉群成年近交系SD雄性大鼠為供、受體(體重220～250g),SPF級(jí),由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證:SCXK(渝)2007-0001。1.2免疫組化試劑丹紅注射液為步長(zhǎng)倍通制藥有限公司產(chǎn)品(批號(hào)070713)。ICAM-1多克隆抗體(BA2189,博士德公司),SABC免疫組化試劑盒(SA1022,博士德公司)及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(北京中杉生物技術(shù)有限公司),石蠟切片機(jī)(Leica,Germany),離心機(jī),生物照相顯微鏡(Olypums-45,日本),全自動(dòng)生化分析儀,顯微外科手術(shù)器械若干,北航真彩色醫(yī)學(xué)圖像處理系統(tǒng)CM2000B。1.3腎活檢聯(lián)合麻醉全部操作在肉眼直視下進(jìn)行。供受體均在術(shù)前12h禁食,自由飲水。麻醉方法:10%水合氯醛3.5ml/kg體重腹腔注射麻醉,在術(shù)中大鼠如有蘇醒可適當(dāng)腹腔加注0.1ml水合氯醛。獲取供腎后用9/0醫(yī)用無(wú)損傷縫線(xiàn)作供腎腹主動(dòng)脈與受體腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合,供腎下腔靜脈與受體鼠左腎靜脈端端吻合,移植腎尿路重建采用帶膀胱瓣的輸尿管與受體鼠膀胱吻合。然后切除受體鼠右腎。1.4病例選擇及手術(shù)處理健康雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組,1組10只,2、3、4組為20只(分為供、受體2組,進(jìn)行原位腎移植手術(shù)),因麻醉意外、失血性休克、尿漏、尿道梗阻、感染、動(dòng)靜脈血栓等并發(fā)癥導(dǎo)致手術(shù)失敗或死亡者,均排除在本實(shí)驗(yàn)外。(各組根據(jù)成人日用量按體重劑量換算系數(shù)折算大鼠給藥劑量)①假手術(shù)組:剖開(kāi)腹腔后暴露腎臟,45min后關(guān)腹。于術(shù)前72、48、24h經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水2ml/kg。②移植缺血再灌注模型組:行原位腎移植手術(shù),術(shù)前處理和假手術(shù)組相同。③DH預(yù)處理組:行原位腎移植手術(shù),于術(shù)前72、48、24h尾靜脈注射丹紅注射液2ml/kg,術(shù)后不再注射。④DH治療組,行原位腎移植手術(shù),術(shù)后8、16h給予丹紅注射液2ml/kg。實(shí)驗(yàn)各組均于術(shù)后24h處死動(dòng)物。1.5測(cè)試項(xiàng)目1.5.1組織病理學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)完后取出大鼠腎臟組織,10%甲醛固定,脫水,石蠟包埋、切片,HE染色在及光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。腎小管間質(zhì)損害分級(jí)按Pallet氏評(píng)分:每高倍視野隨機(jī)選擇10個(gè)腎小管計(jì)分,腎小管明顯擴(kuò)張、細(xì)胞扁平或腫脹1分、刷狀緣損傷或脫落1分或2分,管型2分,小管腔內(nèi)有脫落的壞死細(xì)胞(未形成管形或碎片)1分,共取10個(gè)視野。1.5.2血清尿素氮、胱氨酸兩血碳氮的測(cè)定ureanitrogen,Bun)和肌酐(Serumcreatinine,Cr)的測(cè)定術(shù)后于24h經(jīng)下腔靜脈取血2ml,全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清尿素氮值、肌酐值。1.5.3抗體的檢測(cè)免疫組化按常規(guī)方法及試劑盒說(shuō)明操作,在顯微鏡下用DAB顯色,同時(shí)采用去掉第一抗體的方法作為陰性對(duì)照,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片,顯微鏡觀察。胞漿著色呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞,每張切片于陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域選取5個(gè)高倍(×400)無(wú)重疊視野,應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算平均吸收度值A(chǔ)并以此作為半定量參數(shù)反映ICAM-1表達(dá)。1.6數(shù)據(jù)處理和分析:指標(biāo)間分計(jì)量資料用表示,采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,多組間比較用方差分析,方差不齊的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn),指標(biāo)間做相關(guān)分析。P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異非常顯著。2結(jié)果2.1腎間質(zhì)水腫假手術(shù)組腎小球結(jié)構(gòu)正常,腎小管管腔清晰,間質(zhì)無(wú)充血水腫。缺血再灌注組腎小管明顯擴(kuò)張,上皮細(xì)胞呈空泡樣、顆粒樣變性并伴有壞死。腎小管內(nèi)見(jiàn)大量管型和壞死脫落細(xì)胞,部分細(xì)胞核固縮碎裂,胞質(zhì)濃縮,小管基底膜斷裂管腔阻塞,部分腎小管結(jié)構(gòu)毀損。腎小球內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞滲出,腎間質(zhì)水腫并有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。治療組與缺血再灌注組損傷程度相近。預(yù)處理組腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性和壞死程度較輕,腎小球結(jié)構(gòu)基本正常,腎間質(zhì)水腫較輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少。見(jiàn)圖2。2.2組患者丹紅注射液治療后評(píng)分比較見(jiàn)表1,與假手術(shù)組比較,各實(shí)驗(yàn)組評(píng)分增加(P<0.01)。與移植缺血再灌注組比較,丹紅注射液治療組評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),丹紅注射液預(yù)處理組評(píng)分較缺血再灌注組及丹紅注射液治療組評(píng)分顯著下降(P<0.01)。2.3已使用一定的程序,即營(yíng)造良好的氛圍。p>0.0.0見(jiàn)表2,與假手術(shù)組比較,各組血Bun,Cr檢測(cè)值顯著增高(P<0.01)。與移植缺血再灌注組比較,丹紅注射液治療組血Bun,Cr檢測(cè)值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),丹紅注射液預(yù)處理組血Bun,Cr檢測(cè)值顯著下降(P<0.01)。2.4兩組患者icam-1表達(dá)情況比較免疫組化染色后陽(yáng)性產(chǎn)物呈彌漫性的黃色、棕黃色顆粒,陽(yáng)性表達(dá)位于腎小管上皮細(xì)胞,以近曲小管上皮為主,腎小球未見(jiàn)表達(dá),見(jiàn)圖3,圖4,圖像分析后結(jié)果見(jiàn)表3。ICAM-1在假手術(shù)組表達(dá)極少。與假手術(shù)組比較,移植缺血再灌注組ICAM-1表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01);丹紅注射液治療組同移植缺血再灌注組比較ICAM-1表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05);同移植缺血再灌注組比較丹紅注射液預(yù)處理組ICAM-1表達(dá)明顯下降(P<0.01)。2.5相關(guān)分析移植缺血再灌注24h后腎小管評(píng)分與腎組織中細(xì)胞間黏附分子1表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.92,P<0.05)。3丹紅注射液治療慢性腎損害后的再灌注損害腎缺血再灌注損傷是導(dǎo)致急性腎功能衰竭及影響移植腎存活的重要因素,但發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明,目前認(rèn)為同活性氧、鈣超負(fù)荷、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮素以及細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)。因此尋找有效的抗腎缺血再灌注損傷藥物是研究熱點(diǎn)之一。丹紅注射液為丹參、紅花等提取物的中藥制劑,其主要成分為多種丹參酮、紅花黃素、紅花酮苷、原兒茶醛、丹參酚酸B等。研究表明,丹紅注射液具有抗氧化、防止血栓形成及擴(kuò)張血管等功效并對(duì)心、腦組織缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。但是否對(duì)移植腎缺血再灌注損傷有保護(hù)作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)予以丹紅注射液對(duì)腎移植大鼠進(jìn)行干預(yù),結(jié)果表明:缺血再灌注組Bun、Cr值較假手術(shù)組有明顯升高(P<0.01)。說(shuō)明缺血再灌注對(duì)移植腎造成了嚴(yán)重?fù)p害。丹紅注射液治療組與缺血再灌注組相比,Bun、Cr值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),提示移植術(shù)后再用藥難以在短時(shí)間內(nèi)減輕腎臟損傷。丹紅注射液預(yù)處理組與缺血再灌注組及治療組相比,Bun、Cr值明顯降低(P<0.01),說(shuō)明預(yù)防性使用丹紅注射液可改善腎功,減輕組織損傷。但Bun、Cr值仍高于假手術(shù)組(P<0.01),表明預(yù)處理后仍不能夠完全避免缺血再灌注損傷對(duì)腎臟造成的損害。眾多研究發(fā)現(xiàn)由粘附分子介導(dǎo)的白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互粘附是白細(xì)胞聚集、活化和釋放炎性介質(zhì)的關(guān)鍵,在缺血再灌注損傷中起著重要作用。ICAM-1是免疫球蛋白超家族粘附分子之一。ICAM-1同受體結(jié)合后可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間粘附作用和炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ICAM-1在假手術(shù)組少量表達(dá),而缺血再灌注組較假手術(shù)組ICAM-1表達(dá)有明顯升高(P<0.01),同時(shí)發(fā)現(xiàn)移植腎組織發(fā)生明顯病理變化,腎小管明顯擴(kuò)張,上皮細(xì)胞變性并伴有壞死。部分細(xì)胞核固縮碎裂,間質(zhì)水腫伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。I-CAM-1表達(dá)量與腎小管評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.01)。研究表明,ICAM-1增加可介導(dǎo)更多的白細(xì)胞活化并與內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定黏附,加重炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),使腎臟損傷加重。因此能有效抑制ICAM-1表達(dá)可減輕炎癥反應(yīng)對(duì)腎臟損傷。丹紅注射液治療組與缺血再灌注組相比,ICAM-1表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),移植腎病理?yè)p傷程度相似。說(shuō)明術(shù)后用藥不能抑制ICAM-1表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)。丹紅注射液預(yù)處理組與缺血再灌注組及治療組相比,ICAM-1明顯降低(P<0