第一章-酶學(xué)與酶工程

第一章酶學(xué)與酶工程

第一節(jié)酶工程概述1、酶學(xué)發(fā)展歷史

新陳代謝是生命活動(dòng)的基礎(chǔ),是生命活動(dòng)最重要的特征。約公元前21世紀(jì)夏禹時(shí)代,人們就會(huì)釀酒。公元前12世紀(jì)周代已能制作飴糖和用豆類做醬。

1810年JasephGaylussac發(fā)現(xiàn)酵母可將糖轉(zhuǎn)化為酒精。1833年P(guān)ayen和Persoz從麥芽得到淀粉酶制劑(diastase),其意思是“分離”。首先發(fā)現(xiàn)了酶。1878年,Kuhne才給酶一個(gè)統(tǒng)一的名詞,叫Enzyme,希臘文意思是“在酵母中”。1903年，Herlri提出了酶與底物作用的中間復(fù)合物學(xué)說。

1913年Michaelis和Mentern導(dǎo)出了米氏方程,酶由定性到定量,奠定了酶學(xué)發(fā)展的里程碑。

1926年美國(guó)科學(xué)家Sumner從刀豆提取出了脲酶并獲得結(jié)晶,證明脲酶具有蛋白質(zhì)性質(zhì)。奠定了現(xiàn)代酶學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)的基礎(chǔ)。薩姆納,J.B.美國(guó)生物化學(xué)家1946年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

1958年，Koshland提出了“誘導(dǎo)契合”理論，以解釋酶的催化理論和專一性。1965年P(guān)hillips首次用X射線晶體衍射技術(shù)闡明了雞蛋清溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)。80年代初Cech和Altman分別發(fā)現(xiàn)了核酶(ribozyme),開辟了酶學(xué)研究的新領(lǐng)域,1989年共同獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

切赫T.R.Cech（1947－）奧爾特曼S.Altman(1939-)

1986年Schultz與Lerner等人研制成功抗體酶(abzyme),這一研究成果對(duì)酶學(xué)研究具有重要的理論意義和廣泛的應(yīng)用前景。它集生物學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)于一身，采用單克隆、多克隆、基因工程、蛋白質(zhì)工程等高新技術(shù)，開創(chuàng)了催化劑研究和生產(chǎn)的嶄新領(lǐng)域。Boyer和walker闡明了ATP合酶(ATPsynthase)合成與分解ATP的分子機(jī)制,于1997年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。ATP合酶的結(jié)構(gòu)（引自Lodish等1999）現(xiàn)已鑒定出4000多種酶,數(shù)百種酶已得到結(jié)晶。這些問題的提出和解決，都與酶學(xué)知識(shí)和理論的掌握有直接的關(guān)系。

2、酶工程簡(jiǎn)介

（1）酶工程的產(chǎn)生（2）酶工程的歷史(3)酶工程研究?jī)?nèi)容

（1）酶工程的產(chǎn)生

生物工程學(xué)(biotechnology)也叫生物技術(shù)或生物工藝學(xué),是20世紀(jì)70年代初在分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一個(gè)新興技術(shù)領(lǐng)域。酶工程(enzymeengineering)是生物工程的主要內(nèi)容之一。是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合、發(fā)展而成的一門新的技術(shù)科學(xué)。是酶學(xué)、微生物學(xué)的基本原理與化學(xué)工程有機(jī)結(jié)合而產(chǎn)生的邊緣科學(xué)技術(shù)。（2）酶工程的歷史1894年，日本科學(xué)家首次從米曲霉中提煉出淀粉酶，治療消化不良，開創(chuàng)人類有目的地生產(chǎn)和應(yīng)用酶制劑的先例。1908年,德國(guó)科學(xué)家羅門等利用胰酶(胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶的混合物)，用于皮革的鞣制。1917年,法國(guó)人用枯草桿菌產(chǎn)生的淀粉酶作紡織工業(yè)上的退漿劑。1949年,日本采用深層培養(yǎng)法生產(chǎn)α-淀粉酶獲得成功,使酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用進(jìn)入工業(yè)化階段。1959年,葡萄糖淀粉酶催化淀粉生產(chǎn)葡萄糖新工藝研究成功,大大地促進(jìn)了酶在工業(yè)上應(yīng)用的前景。1953年，德國(guó)科學(xué)家首先將聚氨基苯乙烯樹脂重氮化，然后將淀粉酶等與這種載體結(jié)合，制成了固定化淀粉酶。1971年，第一次國(guó)際酶工程學(xué)術(shù)會(huì)議在美國(guó)召開，會(huì)議的主題就是固定化酶的研制和應(yīng)用。

20世紀(jì)70年代大規(guī)模開展了固定化細(xì)胞、輔酶共固定、增殖細(xì)胞固定、動(dòng)植物細(xì)胞固定等研究。建立多種類型的酶反應(yīng)器,酶工程蓬勃發(fā)展。近20年來，酶分子修飾技術(shù)、酶的化學(xué)合成以及酶的人工合成等方面的研究，也在積極地開展中，從而使酶工程更加顯示出廣闊而誘人的前景。當(dāng)然酶工程的研究不是孤立的,而是與各個(gè)學(xué)科相互關(guān)聯(lián)、相互滲透、相互促進(jìn)的。(3)酶工程的內(nèi)容

酶工程主要指酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用及其相應(yīng)的研究，由以下部分組成:①

酶的生產(chǎn)；②

酶的分離純化；③

酶的固定化；④

酶分子的改造和修飾⑤

酶抑制劑的研究⑥

生物反應(yīng)器。化學(xué)酶工程和生物酶工程

化學(xué)酶工程指自然酶、化學(xué)修飾酶、固定化酶及化學(xué)人工酶的研究和應(yīng)用

生物酶工程是酶學(xué)和以基因重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物,主要包括3個(gè)方面:①

用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶(克隆酶)②

修飾酶基因產(chǎn)生遺傳修飾酶(突變酶)③設(shè)計(jì)新的酶基因合成自然界沒有的新酶

全世界著名的酶制劑企業(yè)有：丹麥Novozymes公司、美國(guó)杰能科國(guó)際公司（Genencor)。

我國(guó)酶制劑工業(yè)誕生于1965年?，F(xiàn)有100多家生產(chǎn)廠，最大的是無錫酶制劑廠。萬噸以上企業(yè)有10家。品種有20多種，應(yīng)用在食品、飼料、制革、洗滌劑、紡織、釀造、造紙、醫(yī)藥等許多行業(yè)。

使用的酶制劑類型:一類是水解酶類淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、乳糖酶等,占有市場(chǎng)銷售額的75%以上。約有60%以上的酶制劑已用基因改良菌株生產(chǎn),ＮＯＶＯ公司使用的菌種有80%是基因重組菌株。

二類是非水解酶主要是分析試劑用酶、醫(yī)藥工業(yè)用酶、淀粉加工用酶、乳制品工業(yè)用酶第二節(jié)酶的分類、組成、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用機(jī)制

一、酶的分類（一）酶的命名法1、習(xí)慣命名法(1)依據(jù)底物來命名（絕大多數(shù)酶）：蛋白酶、淀粉酶；(2)依據(jù)催化反應(yīng)的性質(zhì)命名：水解酶、轉(zhuǎn)氨酶；(3)結(jié)合底物和催化反應(yīng)的性質(zhì)命名：琥珀酸脫氫酶；(4)有時(shí)加上酶的來源：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶。（二）國(guó)際系統(tǒng)命名基本原則：明確標(biāo)明酶的底物及催化反應(yīng)的性質(zhì)（底物為水時(shí)可略去不寫）。舉例：

谷丙轉(zhuǎn)氨酶的系統(tǒng)名稱：丙氨酸:

-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶

丙氨酸：α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶（三）國(guó)際系統(tǒng)分類法及編號(hào)（EC編號(hào)）（1）按反應(yīng)性質(zhì)分六大類，用1、2、3、4、5、6表示：氧、轉(zhuǎn)、水、裂、異、合；1：氧化還原酶2：轉(zhuǎn)移酶3：水解酶

4：裂合酶5：異構(gòu)酶6：合成酶(連接酶)（2）根據(jù)底物中被作用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)，將每一大類分為若干個(gè)亞類，編號(hào)用1、2、3等；（3）每個(gè)亞類又可分為若干個(gè)亞一亞類，用編號(hào)1、2、3表示。乙醇脫氫酶EC，第一個(gè)數(shù)字表示大類：氧化還原酶類第二個(gè)數(shù)字表示反應(yīng)基團(tuán)：醇基第三個(gè)數(shù)字表示電子受體：NAD+第四個(gè)數(shù)字表示此酶底物：乙醇。前面三個(gè)編號(hào)表明這個(gè)酶的特性：反應(yīng)性質(zhì)、底物性質(zhì)（鍵的類型）及電子或基團(tuán)的受體，第四個(gè)編號(hào)用于區(qū)分不同的底物。

酶的編號(hào)由4個(gè)數(shù)字組成，中間以“·”隔開。第一個(gè)數(shù)字表示大類，第二個(gè)數(shù)字表示亞類，第三個(gè)表示亞-亞類，第四個(gè)數(shù)字表示在亞-亞類中的編號(hào)。二、酶的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

（一）酶的化學(xué)本質(zhì)

酶除了少數(shù)有催化活性的RNA分子外,幾乎所有的酶都是蛋白質(zhì)。具有蛋白質(zhì)的典型性質(zhì)。同時(shí)具有自身的特性。

（二）

酶的化學(xué)組成單純酶類(simpleenzyme)：僅由蛋白質(zhì)組成，不含其它物質(zhì)，如脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等。綴合酶類（conjugatedenzyme)：全酶=脫輔酶+輔因子，二者存在酶才有催化作用；如超氧化物歧化酶（Cu2＋、Zn2＋）、乳酸脫氫酶（NAD+）

輔酶：與酶蛋白結(jié)合較松，可透析除去。如NAD+

，NADP+

輔基：共價(jià)鍵，與酶蛋白結(jié)合較緊，透析不可除去。如細(xì)胞色素氧化酶的鐵卟啉金屬離子：Fe2+、

Zn2+、Cu+、Cu2+、Mn3+、Mg2+

、K+、Na+

、Co2+等。有機(jī)化合物：NAD+

，NADP+

，F(xiàn)AD，生物素，卟啉等酶的輔因子主要有金屬離子和有機(jī)化合物，并且根據(jù)與脫輔酶結(jié)合的松緊程度不同可分為兩類，即輔酶和輔基。（一）

單體酶（二）

寡聚酶（三）

多酶復(fù)合體根據(jù)酶蛋白分子特點(diǎn)1.

單體酶一般是由一條肽鏈組成，大多是催化水解反應(yīng)的酶。

牛胰RNase124a.a單鏈雞卵清溶菌酶129a.a單鏈

2.寡聚酶由兩個(gè)或兩個(gè)以上亞基組成的酶，亞基可以相同或不同，一般是偶數(shù)，亞基間以非共價(jià)鍵結(jié)合。亞基一般無活性,必須相互結(jié)合才有活性。如乳酸脫氫酶等。3.多酶復(fù)合體由幾個(gè)酶靠非共價(jià)鍵結(jié)合而成，其中每一個(gè)酶催化一個(gè)反應(yīng)，所有反應(yīng)依次進(jìn)行，構(gòu)成一個(gè)代謝途徑或代謝途徑的一部分。大腸桿菌丙酮酸脫氫酶復(fù)合體由三種酶組成：①丙酮酸脫氫酶（E1）②二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰基酶（E2）③二氫硫辛酸脫氫酶（E3）（二）酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1.有四級(jí)空間結(jié)構(gòu)形式，寡聚酶必須具有正確的四級(jí)結(jié)構(gòu)才有活性。2、具有活性的酶都是球蛋白,即被廣泛折疊、結(jié)構(gòu)緊密的多肽鏈,其氨基酸親水基團(tuán)在外表,而疏水基團(tuán)向內(nèi)。三、酶的作用機(jī)制

（一）結(jié)合部位Bindingsite酶分子中與底物結(jié)合的部位或區(qū)域一般稱為結(jié)合部位。（二）催化部位catalyticsite

酶分子中促使底物發(fā)生化學(xué)變化的部位稱為催化部位。酶的活性中心的概念通常將酶的結(jié)合部位和催化部位總稱為酶的活性部位或活性中心。結(jié)合部位決定酶的專一性，催化部位決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)。酶的活性中心包括底物結(jié)合部位（決定酶的專一性）、催化部位（直接參與催化反應(yīng)，形成產(chǎn)物）酶的作用機(jī)制

酶結(jié)合底物分子,形成酶-底物復(fù)合物。酶活性部位的活性殘基與底物分子結(jié)合,轉(zhuǎn)變?yōu)檫^渡態(tài),然后生成產(chǎn)物,釋放到溶液中。游離的酶與另一分子底物結(jié)合后,開始它的又一次循環(huán)。（一）兩種模型

1、鎖和鑰匙模型(lock-and-keymodel)1894年EmilFischer

德國(guó)科學(xué)家。他發(fā)現(xiàn)了苯肼，對(duì)糖類、嘌呤類有機(jī)化合物的研究取得了突出的成就，因而榮獲1902年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

認(rèn)為整個(gè)酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對(duì)應(yīng)一把鎖一樣。2、誘導(dǎo)契合模型(induced-fitmodel)1958年由Koshland提出。

認(rèn)為酶表面并沒有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀。隨后的X衍射分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持這一假說,比較滿意地說明了酶的專一性。(1)

酶有其原來的形狀,不一定一開始就是底物的模板。(2)

底物能誘導(dǎo)酶蛋白分子形狀發(fā)生一定的變化。(3)

酶分子發(fā)生變化后就能與底物互補(bǔ)楔合。(4)

在酶反應(yīng)過程中,活性中心構(gòu)象的變化是可逆的誘導(dǎo)契合學(xué)說認(rèn)為:

酶的活性部位在結(jié)構(gòu)上是柔性的而非剛性的也就是說不固定的,即具可逆性和彈性。（二）酶的作用機(jī)制1、

酸堿催化酶分子的一些功能基團(tuán)起瞬時(shí)質(zhì)子供體或質(zhì)子受體的作用。分為狹義的酸堿催化和廣義的酸堿催化。狹義的酸堿催化劑即是H+與OH-廣義的酸堿是指能供給質(zhì)子(H+)與接受質(zhì)子的物質(zhì)?？勺鳛閺V義酸堿的功能基團(tuán)：氨基、羧基、巰基、酚羥基、咪唑基。影響酸堿催化反應(yīng)速度的兩個(gè)因素：⑴酸或堿的強(qiáng)度。組氨酸咪唑基的解離常數(shù)為6，在pH6附近（中性溶液）有一半以質(zhì)子供體（酸）形式存在，另一半以質(zhì)子受體（堿）形式存在。⑵給出質(zhì)子或結(jié)合質(zhì)子的速度。其中，咪唑基給出質(zhì)子和結(jié)合質(zhì)子的速度十分迅速，是酶的催化反應(yīng)中最有效、最活潑的一個(gè)功能基團(tuán)。2、共價(jià)催化酶的某些親核基團(tuán)，能迅速與底物形成共價(jià)中間復(fù)合物，降低反應(yīng)的活化能，使反應(yīng)加速。酶親核基團(tuán)：Ser-OH，Cys-SH，His-咪唑基等底物親電中心：磷酰基（-P=O），酰基（-C=O），糖基（Glc-C-）3、鄰近效應(yīng)及定向效應(yīng)

鄰近效應(yīng)

底物的反應(yīng)基團(tuán)與酶的催化基團(tuán)越靠近,其反應(yīng)速度越快。定向效應(yīng)

催化基團(tuán)與底物的反應(yīng)基團(tuán)之間的正確取位，從而提高酶催化反應(yīng)速度的效應(yīng)。4、變形或張力

當(dāng)特異底物與酶結(jié)合時(shí),酶蛋白發(fā)生一定構(gòu)象變化,與底物發(fā)生誘導(dǎo)契合。酶使底物分子中的敏感鍵發(fā)生變形或張力。底物形變，利于形成ES復(fù)合物。進(jìn)一步轉(zhuǎn)換成過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，大大降低活化能。5、酶的活性中心為疏水區(qū)域

酶的活性中心常為酶分子的凹穴。此處常為非極性或疏水性的氨基酸殘基。介電常數(shù)低,并排出極性高的水分子。這使得底物分子的反應(yīng)鍵和酶的催化基團(tuán)之間易發(fā)生反應(yīng),有助于加速酶催化反應(yīng)。6、多元催化和協(xié)同效應(yīng)

多個(gè)基元催化反應(yīng)配合在一起共同起作用。

上面介紹了實(shí)現(xiàn)酶反應(yīng)高效率的幾個(gè)因素,但是并不能指出那一種因素可以影響所有酶的全部催化活性。更可能的情況是：不同的酶,起主要影響的因素可能是不同的,各自都有其特點(diǎn),可以受一種或幾種因素的影響。第三節(jié)酶作為催化劑的顯著特點(diǎn)

酶與化學(xué)催化劑比較具有顯著的特性。最重要的有三方面:一、高催化效率二、強(qiáng)專一性三、酶活性可以調(diào)控

一、高催化效率

催化能力，酶加快反應(yīng)速度可高達(dá)108-1020倍。

酶促反應(yīng)速度相當(dāng)高,而酶催化的最適條件幾乎都為溫和的溫度和非極端pH。以NH3為例：固氮酶：25℃、中性pH。工業(yè)：700~900K、10~90MPa（一）酶專一性類型1、結(jié)構(gòu)專一性（1）絕對(duì)專一性酶對(duì)底物的要求非常嚴(yán)格，只能對(duì)某一種底物的某一種反應(yīng)起催化作用。

脲酶只能催化尿素水解,而對(duì)尿素的各種衍生物或尿素的其它反應(yīng)不起作用。（2）相對(duì)專一性：對(duì)底物專一性降低，可作用一類結(jié)構(gòu)相近的底物。

二、酶的專一性★基團(tuán)專一性除了對(duì)鍵有要求，還對(duì)于鍵的一端的基團(tuán)要求嚴(yán)格。例如：α-D-葡萄糖苷酶不但要求α-糖苷鍵,并且要求α-糖苷鍵的一端必須有葡萄糖殘基,而對(duì)鍵的另一端R基團(tuán)則要求不嚴(yán),因此它可催化含有α-葡萄糖苷的蔗糖或麥芽糖水解,但不能使含有β-葡萄糖苷的纖維二糖水解?！镦I專一性：作用于一定的鍵,但對(duì)鍵兩端的基團(tuán)并無嚴(yán)格要求。這類酶對(duì)底物結(jié)構(gòu)的要求低。酯酶催化酯鍵的水解,而對(duì)底物R-C中的R及R’基團(tuán)都沒有嚴(yán)格的要求,即能催化水解甘油酯類、簡(jiǎn)單脂類,也能催化丙酰、乙酰膽堿等。

2.立體異構(gòu)專一性

有些酶不僅對(duì)底物化學(xué)結(jié)構(gòu)有要求,而且對(duì)底物分子的立體構(gòu)型也有要求,稱作立體異構(gòu)專一性。立體異構(gòu)專一性又分兩類:(1)旋光異構(gòu)專一性當(dāng)?shù)孜锞哂行庑詴r(shí),酶只能作用于其中的一種。它是酶反應(yīng)中相當(dāng)普遍的現(xiàn)象。例如：

L-氨基酸氧化酶只能催化L-氨基酸氧化,而對(duì)D-氨基酸無作用。(2)幾何（順反）異構(gòu)專一性

酶對(duì)底物的幾何構(gòu)型有嚴(yán)格的要求稱之為幾何異構(gòu)專一性。

例如：延胡索酸酶只能催化反丁烯二酸（即延胡索酸），而不能催化順丁烯二酸的水合作用。三、調(diào)節(jié)性

酶活性的調(diào)節(jié)控制主要有下列7種方式1.酶濃度的調(diào)節(jié)兩種方式：誘導(dǎo)或抑制酶的合成；調(diào)節(jié)酶的降解

例如：β-半乳糖苷酶的合成。2.激素調(diào)節(jié)

例：乳糖合成酶

乳糖合成酶由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基組成，可以催化乳糖合成反應(yīng)：

EUDP-半乳糖+葡萄糖乳糖+UDP調(diào)節(jié)亞基合成是受激素控制的。3.共價(jià)修飾調(diào)節(jié)

在一種酶分子上,共價(jià)地引入或去掉一個(gè)基團(tuán)從而改變酶的活性例：磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化

4.限制性蛋白水解作用與酶活力調(diào)控高特異性的共價(jià)修飾調(diào)節(jié)系統(tǒng)例：酶原激活、血液凝固、補(bǔ)體激活5.抑制劑的調(diào)節(jié)例：胰臟的胰蛋白酶抑肽酶,磷酸變位酶2,3-二磷酸甘油酸6.反饋調(diào)節(jié)許多小分子物質(zhì)的合成是由一連串的反應(yīng)組成的。催化此物質(zhì)生成的第一步反應(yīng)的酶,往往可以被它的終端產(chǎn)物所抑制,這種對(duì)自我合成的抑制叫反饋抑制。例：異亮氨酸抑制第一個(gè)酶一蘇氨酸脫氨酶7.金屬離子和其他小分子化合物的調(diào)節(jié)

第四節(jié)

影響酶活性的因素

一、酶速度

酶催化反應(yīng)的速率通常稱作酶速度(velocity)。酶速度通常以酶促反應(yīng)的初速度為準(zhǔn)(底物消耗≤5%）。因?yàn)榈孜餄舛冉档?、酶部分失活、產(chǎn)物抑制和逆反應(yīng)等因素，會(huì)使反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。幾個(gè)概念酶的活力單位：表示酶活力大小所用的兩個(gè)國(guó)際單位1IU：在最適反應(yīng)條件下，每分鐘催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，稱一個(gè)IU。1Kat：在最適反應(yīng)條件下，每秒鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，稱Kat單位

1Kat＝60×106IU；1IU＝1/60μKat＝16.7nKat最適條件：最適溫度（25℃或37℃）,最適pH、最適緩沖液離子強(qiáng)度、最適底物濃度。底物濃度要求：（1）通常很大，使酶飽和；（2）底物消耗≤5%。酶活力(或總活力):樣品中酶的總單位比活力:是每毫克蛋白質(zhì)中酶單位的數(shù)量(U/mg)。

比活力=活力U/mg蛋白=總活力U/總蛋白mg

影響酶活力的因素1、底物濃度酶速度對(duì)底物濃度([S])的依賴關(guān)系的正常模式是：在低的底物濃度下,[S]增加1倍,將導(dǎo)致起始速度(Vo)也增加1倍。在較高底物濃度下,酶被飽和,進(jìn)一步增高[S],只導(dǎo)致Vo的微小變化。進(jìn)一步加入底物對(duì)酶速度也將不發(fā)生影響。Vo對(duì)[S]的關(guān)系圖形稱為雙曲線(hyperboliccurve)2、酶濃度在底物濃度飽和的情況下(即所有酶分子都與底物結(jié)合),酶濃度的加倍將導(dǎo)致Vo的加倍。Vo與酶濃度的關(guān)系圖為直線圖形。

3、溫度的影響一方面是溫度升高,酶促反應(yīng)速度加快。另一方面,溫度升高,導(dǎo)致酶活性降低甚至喪失。大多數(shù)酶都有一個(gè)最適溫度。在最適溫度條件下,反應(yīng)速度最大。最適溫度不是酶的特征物理常數(shù),也不是固定值,而與酶作用時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)。生物不同生長(zhǎng)階段有不同的最適溫度。4、pH

每個(gè)酶都有最適pH,在此pH下催化反應(yīng)的速率是它的最高值。（1）最適pH有時(shí)因底物種類、濃度及緩沖液成分不同而不同。（2）酶的最適pH并不是一個(gè)常數(shù),只是在一定條件下才有意義。pH影響酶活力的原因可能有以下幾個(gè)方面:(A)過酸,過堿會(huì)影響酶蛋白的構(gòu)象,甚至使酶失活。(B)

影響底物分子的解離。(C)pH影響酶分子的解離,而這些基團(tuán)的離子化狀態(tài)與酶的專一性及酶分子中心活力中心的構(gòu)象有關(guān)。第五節(jié)酶動(dòng)力學(xué)和抑制作用一、米-曼氏模式

1、Michaelis-Menten方程的建立

米氏方程

2、米氏常數(shù)的意義

Km：米氏常數(shù)，物理意義為反應(yīng)速率為最大速率Vmax一半時(shí)底物的濃度，單位與底物濃度同（1）Km是酶的一個(gè)特性常數(shù)，Km大小只與酶性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。當(dāng)?shù)孜锎_定，反應(yīng)溫度，pH及離子強(qiáng)度一定時(shí)，Km值為常數(shù)，可用來鑒別酶。

Km一般在1×10-6~10-1mol/L之間不同的酶Km值不同，測(cè)定Km要在相同測(cè)定條件（pH、溫度、離子強(qiáng)度）下進(jìn)行。（2）Km值可用于判斷酶的專一性和天然產(chǎn)物，若一個(gè)酶有幾種底物就有幾個(gè)Km值，其中Km值最小的底物稱為該酶的最適底物，又稱天然底物。（3）可近似表示酶與底物親和力的大小。真正表示酶與底物親和力為Ks=k2/k1

(注Km=k2+k3/k1)（4）已知Km可由[S]計(jì)算v，或由v計(jì)算[S]。

二、Lineweaver-Burk作圖y=ax+b縱軸截距：1/Vmax；橫軸截距：-1/Km；斜率：Km/Vmax。其他三種作圖法0[S]Hanes-Woolf

作圖法Eadie-Hofstee作圖法

（v對(duì)v/[S]作圖法）Vmax對(duì)Km作圖法表2－1四種作圖法特征比較作圖方式斜率縱軸截距橫軸截距1/v～1/[S]Km/Vmax1/Vmax-1/Km[S]/v～[S]1/VmaxKm/Vmax-Kmv～v/[S]-KmVmaxVmax/KmVmax～Kmv/[S]v[S]三、酶的抑制作用

抑制作用：酶的必需基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)改變而引起酶活力降低或喪失，但不引起酶蛋白變性。凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。意義：研究酶的抑制劑，可以研究酶的結(jié)構(gòu)與功能、酶催化機(jī)制，進(jìn)行藥物、農(nóng)藥的設(shè)計(jì)與篩選。（一）抑制作用的類型：

1.

不可逆抑制作用Irreversibleinhibition2.

可逆性抑制作用Reversibleinhibition

1)

競(jìng)爭(zhēng)性抑制

Competitiveinhibition2)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制

Non-competitiveinhibition

3)反競(jìng)爭(zhēng)性抑制Uncompetitiveinhibition

非專一性不可逆抑制劑不可逆抑制劑專一性不可逆抑制劑有機(jī)磷化合物、有機(jī)汞有機(jī)砷化合物、重金屬鹽、烷化試劑氰化物、硫化物和CO、青霉素Ks型抑制劑Kcat型抑制劑1、不可逆抑制作用

這類抑制劑通常以共價(jià)鍵與酶蛋白中的基團(tuán)結(jié)合，從而使酶活性降低，甚至喪失。不能用透析、超濾等物理方法除去這些抑制劑，使酶活性恢復(fù)。非專一性不可逆抑制劑

概念：抑制劑作用于酶的一類或幾類基團(tuán)，這些基團(tuán)中包含了酶的必需基團(tuán)，從而引起酶失活。類型：

①有機(jī)磷化合物②有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物③重金屬鹽④烷化試劑⑤氰化物、硫化物和CO⑥青霉素有機(jī)磷化合物

很多農(nóng)藥是有機(jī)磷化合物，它們能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，與酶分子活性部位的絲氨酸羥基共價(jià)結(jié)合而使酶失活。這類化合物強(qiáng)烈地抑制膽堿酯酶活力，使乙酰膽堿不能水解成乙酸和膽堿，導(dǎo)致乙酰膽堿積累，引起神經(jīng)中毒癥狀。所以這類化合物又稱為神經(jīng)毒劑。用解磷定（碘化醛肟甲基吡啶）或氯磷定（氯化醛肟甲基吡啶）能把酶上的毒劑奪取下來，使酶恢復(fù)活力，達(dá)到解毒的作用。

有機(jī)磷化合物解磷定的解毒機(jī)理有機(jī)汞化合物

有機(jī)汞化合物能與酶的巰基結(jié)合而使酶失活。過量的半胱氨酸或還原型谷胱甘肽能解毒。

有機(jī)砷化合物

有機(jī)砷化合物能與酶的巰基結(jié)合而使酶失活。BAL（二巰基丙醇）能解毒。

路易斯毒氣重金屬鹽

Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+在高濃度時(shí)能使酶蛋白變性，低濃度時(shí)抑制某些酶的活力?？捎媒饘衮蟿〦DTA、半胱氨酸等螯合除去重金屬離子。

烷化試劑含有一個(gè)活潑的鹵素離子，能夠修飾酶分子中的許多基團(tuán)，如巰基、氨基、羧基、咪唑基及硫醚基等。烷化試劑氰化物、硫化物和CO

氰化物能與細(xì)胞色素氧化酶中的Fe2+結(jié)合，使酶失活不能呼吸。CO與血紅蛋白結(jié)合阻止氧運(yùn)輸。硫化物能與多種含金屬的酶形成較為穩(wěn)定的絡(luò)合物，使酶失活。

糖肽轉(zhuǎn)肽酶在細(xì)菌細(xì)胞壁合成中使肽聚糖鏈交聯(lián)。青霉素與糖肽轉(zhuǎn)肽酶的絲氨酸羥基結(jié)合，使細(xì)菌細(xì)胞壁不能合成。

青霉素

青霉素的抗菌機(jī)理Ks型抑制劑Kcat型抑制劑專一性不可逆抑制劑

Ks型不可逆抑制劑

此類抑制劑是根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的，具有一個(gè)與底物相似的可以與酶結(jié)合的基團(tuán)，可直接結(jié)合于酶的活性部位，同時(shí)還帶有一個(gè)活潑的化學(xué)基團(tuán)，能與酶分子中的必需基團(tuán)反應(yīng)進(jìn)行化學(xué)修飾，從而抑制酶活性。因抑制是通過對(duì)酶的親和力來對(duì)酶進(jìn)行修飾標(biāo)記的，故稱為親和標(biāo)記試劑。例：胰蛋白酶的Ks型不可逆抑制劑2-甲苯磺酰-L-賴氨酰氯甲烷（TPLK）

例：胰蛋白酶的Ks型不可逆抑制劑（TPLK）胰蛋白酶的人工底物胰蛋白酶的Ks型抑制劑Kcat型不可逆抑制劑特點(diǎn)

該類抑制劑是根據(jù)酶的催化過程設(shè)計(jì)的。它不但具有天然底物類似的結(jié)構(gòu)，且本身也是酶的底物，能與酶結(jié)合發(fā)生類似于底物的變化，但其分子中還有一個(gè)潛伏的反應(yīng)基團(tuán)。當(dāng)酶對(duì)它進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，這個(gè)潛伏反應(yīng)基團(tuán)被暴露或活化，并立即與酶活性中心某基團(tuán)或酶的輔基呈不可逆結(jié)合，使酶不可逆失活。此類抑制劑是專一性極高的不可逆抑制劑，亦稱酶的自殺性底物（suisidesubstrate）。例：迫降靈以FMN或FAD為輔酶的單胺氧化酶的抑制作用。例：以FMN或FAD為輔酶的單胺氧化酶的Kcat型不可逆抑制劑迫降靈加成反應(yīng)迫降靈是一種單胺氧化酶的自殺性底物，是治療高血壓的良藥。由于迫降靈能抑制單胺氧化酶，也就能抑制一些血管舒張劑（如組胺）的氧化，因而有降血壓的作用。2.

可逆性抑制作用

抑制劑通常以非共價(jià)鍵與酶可逆性結(jié)合，使酶的活性降低或喪失；抑制劑可用透析、超濾等方法除去。類型

競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制

１）競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用+IEIE+SE+PES反應(yīng)模式定義抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似，能與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心，從而阻礙酶底物復(fù)合物的形成，使酶的活性降低。這種抑制作用稱為競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。

*特點(diǎn)充分的高底物濃度可以將結(jié)合到活性部位的抑制劑分子競(jìng)爭(zhēng)地排出，因此酶的Vmax不變，但在競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在下，酶對(duì)其底物的親和力降低，因此Km增大。I與S結(jié)構(gòu)類似，競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心；竟?fàn)幮砸种?/p>

某些抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。

竟?fàn)幮砸种仆ǔ？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競(jìng)爭(zhēng)能力來消除。S競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制圖示I例:丙二酸對(duì)琥珀酸脫氫酶的抑制作用

②競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用動(dòng)力學(xué)方程的討論

A、與標(biāo)準(zhǔn)米氏方程比較B、當(dāng)[I]→0時(shí)，方程還原成米氏方程。

[I]→∞時(shí)，交于y軸C、取方程的倒數(shù)，進(jìn)行雙倒數(shù)作圖

2)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制底物和抑制劑同時(shí)和酶結(jié)合,兩者沒有競(jìng)爭(zhēng)作用。

酶活力降低

如Leu是精氨酸酶非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。

非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制作用（noncompetitivereversibleinhibition）

E+S→ESESIE+I→EIESI特點(diǎn)抑制劑與酶活性中心外的必需基團(tuán)結(jié)合，底物與抑制劑之間無競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系；抑制程度取決于抑制劑的濃度；非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的效應(yīng)不能由增高底物濃度而克服，所以Vmax降低，酶對(duì)底物的親和力不變，因此Km不變。

非競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶可同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，即底物和抑制劑沒有競(jìng)爭(zhēng)作用。酶與抑制劑結(jié)合后，還可與底物結(jié)合；酶與底物結(jié)合后，也可再結(jié)合抑制劑，但是三元的中間產(chǎn)物不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物，所以酶活性降低。

非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與酶活性中心以外的基團(tuán)結(jié)合。這類抑制作用不會(huì)因提高底物濃度而減弱非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制圖示非競(jìng)爭(zhēng)②非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用動(dòng)力學(xué)方程討論A、與米氏方程比較B、當(dāng)[I]→0[I]→∞C、取方程倒數(shù)，進(jìn)行雙倒數(shù)作圖3)反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的反應(yīng)式反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的雙倒數(shù)作圖法反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在時(shí)，Vmax

降低，Km

亦降低。各種可逆性抑制作用的比較

結(jié)合部位

KmVmax無競(jìng)爭(zhēng)劑

KmVmax競(jìng)爭(zhēng)性抑制

E 增大不變

非競(jìng)爭(zhēng)性抑制

E,ES 不變 減小反競(jìng)爭(zhēng)性抑制

ES 減小 減小

可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鑒別1.物理方法用透析、超濾和凝膠過濾等方法是否能除去抑制劑來鑒別可逆抑制作用和不可逆抑制作用。2.動(dòng)力學(xué)方法在測(cè)定酶活力系統(tǒng)中加入一定量的抑制劑，測(cè)定酶反應(yīng)的初速度，以初速度和酶濃度作圖。3酶抑制劑的應(yīng)用保健藥物

美容藥物

農(nóng)用藥物

醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用二氫葉酸合成酶對(duì)氨基苯甲酸二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸合成酶二氫葉酸還原酶轉(zhuǎn)肽酶痛風(fēng)病藥物作用機(jī)理藥物被抑制的酶治療機(jī)理概要磺胺二氫葉酸合成酶抗菌。苯甲酸類似物；核酸合成障礙。氨基蝶呤，氨甲蝶呤二氫葉酸還原酶抗白血病。FH4合成障礙；核酸合成障礙。青霉素，β-氟代-D-丙氨酸細(xì)菌轉(zhuǎn)肽酶抗菌。酶的自殺底物；胞壁合成障礙。5-氟尿嘧啶(尿嘧啶類似物）尿苷磷酸化酶抗癌。酶的自殺底物；腫瘤細(xì)胞不能合成核酸。5-氟脫氧尿苷酸胸苷酸合成酶抗癌。酶的自殺底物；腫瘤細(xì)胞不能合成DNA。一些藥物對(duì)酶的抑制效應(yīng)藥物被抑制的酶治療機(jī)理概要?jiǎng)e嘌呤醇黃嘌呤氧化酶抗痛風(fēng)。酶的自殺底物；抑制尿酸生成。優(yōu)降寧線粒體單胺氧化酶降血壓。降低去甲腎上腺素在血管上積累。開搏通(巰基甲脯氨酸)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶降血壓。自殺性底物；抑制血管緊張素Ⅱ的生成。阿卡波糖α-葡萄糖苷酶治療糖尿病。酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑；降低血糖。一些藥物對(duì)酶的抑制效應(yīng)酪氨酸酶（微生物產(chǎn)黑色素的關(guān)鍵酶）L-多巴（DOPA）黑色素酪氨酸酶抑制劑（曲酸）酪氨酸肉毒素的小分子抑制劑肉毒素是由兩個(gè)肽鏈構(gòu)成的，一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈。重鏈靶向并結(jié)合到神經(jīng)末梢的表面受體。這樣肉毒素就可進(jìn)入神經(jīng)末梢內(nèi)部。一旦進(jìn)入，輕鏈就與重鏈分離，切斷控制神經(jīng)肌肉功能的特異蛋白。這些蛋白的破壞有效阻止了引起肌肉收縮的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，而肌肉收縮是呼吸所必需的。肉毒素侵入神經(jīng)末梢的結(jié)果就是導(dǎo)致癱瘓，最終導(dǎo)致窒息和死亡。農(nóng)業(yè)領(lǐng)域

膽堿酯酶:膽堿酯酶催化膽堿酯生成乙酰膽堿（神經(jīng)系統(tǒng)受體），缺乏受體造成昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，痙攣而死。

第六節(jié)蛋白質(zhì)、酶和重組蛋白質(zhì)的分離純化一、蛋白質(zhì)純化的一般考慮

根據(jù)酶的使用目的確定純化策略制備方法的經(jīng)濟(jì)性。分離純化用的原料來源要方便,成本要低;效率高，步驟簡(jiǎn)單。（一般純化步驟不超過5步）條件要盡可能十分溫和，防止酶變性失活。

建立靈敏、特異、精確的檢測(cè)手段,評(píng)估純化方法

二、防止酶變性失活的方法盡可能在低溫下進(jìn)行分離純化，尤其是有機(jī)溶劑存在時(shí)。盡量避免局部過酸過堿。防止泡沫的形成。加入巰基試劑（如巰基乙醇，二硫蘇糖醇等），避免酶被氧化。加入蛋白酶抑制劑，防止內(nèi)源性蛋白酶的降解。（一）材料的選擇天然材料：早期酶制劑多是從動(dòng)植物中提取。但動(dòng)植物原料生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、成本高，又受地理、氣候和季節(jié)等因素影響?；蚬こ滩牧希簩?duì)于天然不易得到的蛋白，目前通過工程菌或工程細(xì)胞表達(dá)而獲得。工業(yè)用酶多采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)。三、酶的分離和純化植物、動(dòng)物、微生物細(xì)胞的特性比較微生物發(fā)酵

目前工業(yè)應(yīng)用酶大多數(shù)來自微生物，這是因?yàn)橐晕⑸餅樯a(chǎn)原料有許多優(yōu)點(diǎn)。微生物種類繁多；產(chǎn)酶微生物多；一種微生物可以產(chǎn)多種酶；微生物繁殖快、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)方便；微生物易改造，可通過多種手段進(jìn)行育種。酶的發(fā)酵生產(chǎn)酶的生產(chǎn)菌——先決條件，直接影響發(fā)酵的生產(chǎn)成本。對(duì)生產(chǎn)菌的要求：非病源菌，同時(shí)在系統(tǒng)發(fā)育上與病原菌無關(guān)，不產(chǎn)毒素及其他生理活性物質(zhì)；產(chǎn)酶量高，最好分泌胞外酶；生產(chǎn)菌穩(wěn)定，不易變異、退化、不易感染噬菌體；容易培養(yǎng)，能利用廉價(jià)原料，發(fā)酵周期短。生產(chǎn)菌的獲得采樣—分離—篩選—誘變；采樣：在富含該酶作用底物的場(chǎng)所采樣；在與酶活性最適條件相同的環(huán)境采樣；富集培養(yǎng)：投其所好，取其所抗。分離：平板劃線法、直接稀釋法.篩選：初篩、復(fù)篩；向菌種中心購(gòu)買或索取。中國(guó)國(guó)家級(jí)菌種保藏管理中心（7個(gè)）名稱及成立年份依托單位中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所(ACCC)—1980中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院(CICC)—1979中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)藥品生物制品檢定所(CMCC)—1979中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)獸醫(yī)藥品檢定所(CVCC)—1979中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院(CFCC)—1985中國(guó)抗菌素菌種保藏管理中心中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所(CACC)—1979中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心中國(guó)科學(xué)院微生物研究所(CCGMC)—1979國(guó)外菌種中心AmericanTypeCultureCollection

JapanCollectionofMicroorganismshttp://www.jcm.riken.go.jpTheUnitedKingdomNationalCulturecollectionhttp://www.ukncc.co.ukDeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenhttp://www.dsmz.deATCC美國(guó)菌種中心，最大的菌種中心,有病毒、細(xì)菌、真菌、細(xì)胞等不同的微生物JCM日本微生物菌種中心英國(guó)國(guó)家菌種中心，Over70,000micro-organismsandcelllinesareavailable.德國(guó)微生物與細(xì)胞收集中心主要產(chǎn)酶菌大腸桿菌：應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶菌，一般分泌胞內(nèi)酶。因?yàn)槠溥z傳背景清楚而廣泛應(yīng)用于遺傳工程改造微生物的宿主，被改造成表達(dá)優(yōu)良性狀的“工程菌”。也常在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用于生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、門冬氨酸酶、限制性核酸內(nèi)切酶等?？莶輻U菌：工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶菌之一，淀粉酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酯酶等的產(chǎn)酶菌。啤酒酵母：工業(yè)上廣泛應(yīng)用，主要產(chǎn)轉(zhuǎn)化酶、醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶等。曲霉（黑曲霉和黃曲霉）：糖化酶、蛋白酶、果膠酶、氨基?；?、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基酰化酶、脂肪酶等多種酶。提高酶產(chǎn)量的方法條件控制：優(yōu)化發(fā)酵條件，包括培養(yǎng)基：碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子、pH值、溫度、溶解氧、發(fā)酵周期等；添加誘導(dǎo)物、降低阻遏物濃度。遺傳控制：物理、化學(xué)法誘變育種；基因重組構(gòu)建工程菌。提高產(chǎn)酶量的措施1、添加誘導(dǎo)物能使某些酶的生物合成開始或加速進(jìn)行的物質(zhì)。酶的作用底物：（誘導(dǎo)酶）大腸桿菌在含乳糖的培養(yǎng)基中能大量合成β-半乳糖苷酶酶的反應(yīng)產(chǎn)物：纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶的生物合成。酶作用底物的類似物：異丙基-β-硫代半乳糖苷對(duì)β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)效果比乳糖高幾百倍。進(jìn)一步研究和開發(fā)廉價(jià)的誘導(dǎo)物具有重要的意義和應(yīng)用前景2、控制阻遏物的濃度產(chǎn)物阻遏：由酶催化作用的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物引起的阻遏作用。分解代謝物阻遏：有分解代謝物（如葡萄糖或其他容易利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過分解代謝而產(chǎn)生的物質(zhì)）引起的阻遏作用。無機(jī)磷酸﹥1.0mmol/L﹤1.0mmol/L堿性磷酸酶合成受阻堿性磷酸酶大量合成控制碳源濃度、添加一定量的環(huán)腺苷酸減少解除阻遏物是能夠引起某些酶的生物合成停止或者減速的物質(zhì)。3、添加表面活性劑細(xì)胞膜高度的選擇透性表面活性劑增加細(xì)胞的透過性利于胞外酶分泌酶產(chǎn)量↑4、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶，但作用機(jī)理未闡明清楚的物質(zhì)。同步合成型(或稱生長(zhǎng)偶聯(lián)型）

酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)行的一種酶生物合成模式。該類型酶的生物合成速度與細(xì)胞生長(zhǎng)速度緊密聯(lián)系，又稱為生長(zhǎng)偶聯(lián)型。

大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導(dǎo)酶也按照此種模式進(jìn)行生物合成。所對(duì)應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定，一般其壽命只有十幾分鐘。

細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細(xì)胞濃度活細(xì)胞濃度胞外酶濃度胞內(nèi)酶濃度酶生物合成的模式中期合成型：該類型的酶在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間以后才開始，而在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶的生物合成也隨之停止。細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml酶生物合成的模式例如，枯草桿菌堿性磷酸酶（Alkalinephophatase，EC)。無機(jī)磷酸反饋?zhàn)瓒粑锛?xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在細(xì)胞生長(zhǎng)的開始階段,培養(yǎng)基中的磷阻遏酶的合成，當(dāng)磷幾乎被細(xì)胞用完以后，酶才開始大量生成。又由于該酶所對(duì)應(yīng)的mRNA不穩(wěn)定，其壽命只有30min左右，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的生物合成隨之停止。

該類型酶的生物合成受到產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒糇饔没蚍纸獯x物阻遏作用，所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性差。延續(xù)合成型（或稱部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型）

酶的生物合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長(zhǎng)時(shí)間。

屬于該類型的酶可以是組成酶，也可以是誘導(dǎo)酶。

所對(duì)應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定。細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導(dǎo)物以含有葡萄糖的果膠為誘導(dǎo)物酶生物合成的模式滯后合成型（或稱非生長(zhǎng)偶聯(lián)型）

酶在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或者進(jìn)入平衡期以后才開始其生物合成并大量積累。又稱為非生長(zhǎng)偶聯(lián)型。原因：受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用。隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，阻遏物幾乎被細(xì)胞用完而使阻遏解除后，酶才開始大量合成。若培養(yǎng)基中不存在阻遏物，該酶的合成可以轉(zhuǎn)為延續(xù)合成型。該類型酶所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性很好。黑曲霉羧基蛋白酶生物合成放線菌素D對(duì)產(chǎn)酶的影響細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml酶濃度U/ml酶濃度U/ml30℃22℃不加加入不加加入酶生物合成的模式理想的酶合成模式mRNA的穩(wěn)定性好：可以在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，繼續(xù)合成其所對(duì)應(yīng)的酶；差：隨著細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期而停止酶的生物合成不受其阻遏：可以伴隨著細(xì)胞生長(zhǎng)而開始酶的合成；受其阻遏：在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間甚至在平衡期后，酶才開始合成并大量積累。培養(yǎng)基中存在的某些物質(zhì)理想的酶合成模式最理想的合成模式應(yīng)是延續(xù)合成型因?yàn)閷儆谘永m(xù)合成型的酶，在發(fā)酵過程中沒有生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞一開始生長(zhǎng)就有酶產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶還可以繼續(xù)合成一段較長(zhǎng)的時(shí)間。同步合成型：提高其對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，適當(dāng)降低發(fā)酵溫度是可取的措施；滯后合成型：設(shè)法降低培養(yǎng)基中阻遏物的濃度，盡量減少甚至解除產(chǎn)物阻遏或分解代謝物阻遏作用，使酶的生物合成提早開始；中期合成型：在提高mRNA的穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面下功夫，使其生物合成的開始時(shí)間提前，并盡量延遲其生物合成停止的時(shí)間。（二）細(xì)胞破碎細(xì)胞壁的主要成分：細(xì)菌：肽聚糖：N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸真菌和酵母：萄聚糖，甘露聚糖藻類：纖絲狀多糖類細(xì)胞破碎的方法：1）機(jī)械法2）物理法3）化學(xué)法4）生物法（酶解）