電泳+DNA體外重組技術(shù)1st

DNA體外重組技術(shù)

生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所概念

是在分子水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法取得感興趣的目的基因，在體外與載體DNA分子重組，然后將

重組分子轉(zhuǎn)入受體細胞，并篩選出能表達重組DNA的活細胞，加以純化、擴增，成為克隆。步驟

1.分離或合成感興趣的目的基因及載體分2.構(gòu)建、改造作為載體的DNA切3.目的基因與載體DNA在體外重組接4.重組DNA引入受體細胞轉(zhuǎn)5.陽性重組子的篩選、鑒定、擴增篩replicationtranslationtranscriptionreplicationtranscriptiontranslation一、目的基因的獲得

1.從染色體DNA中直接分離2.人工合成3.由mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA4.從基因組文庫中篩選目的基因5.PCR獲得二、載體的選擇

1.能在宿主細胞中獨立復(fù)制，并能攜帶重組DNA

片段一同擴增；2.有合適的限制性酶切位點便于進行克隆；3.有一定的篩選標記，易于識別和篩選；4.載體分子應(yīng)盡量小，可插入較大的外源DNA而不影響復(fù)制；5.表達型載體應(yīng)配備與宿主細胞相適應(yīng)的啟動子、前導(dǎo)序列、增強子等調(diào)控元件；6.生物安全性好。。

可將外源DNA攜帶進入宿主細胞的DNA稱為載體。常用載體質(zhì)粒病毒

噬菌體三、連接

用DNA連接酶將目的基因與載體連接

重組子。EcoRIEcoRI四、轉(zhuǎn)化把以質(zhì)粒為載體的重組DNA，在一定條件下引入受體細胞的過程稱轉(zhuǎn)化。以噬菌體或病毒構(gòu)建的重組DNA引入受體細胞的過程稱轉(zhuǎn)染。接受了重組DNA的受體菌稱為轉(zhuǎn)化子或重組體。轉(zhuǎn)化的方法感受態(tài)細胞及其特點注意事項五、篩選

在轉(zhuǎn)化過程中,并非每個宿主細胞都被轉(zhuǎn)化；即使獲得轉(zhuǎn)化的細胞,也并非都含目的基因，可能含有自身成環(huán)的載體分子、一個載體與兩個外源DNA形成的重組子、或插入的非目的基因與載體形成的重組子等。因此轉(zhuǎn)化后須在不同層次,不同水平上進行篩選，以區(qū)別轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子，以及鑒定所需的特異性重組子。Pseudo-positivepositive(一)根據(jù)重組子的遺傳學(xué)特性篩選(平板篩選)1.插入失活

2.插入表達

3.營養(yǎng)素依賴表型

4.α-互補(藍白斑篩選法)(二)限制酶圖譜篩選(電泳篩選法)(三)核酸雜交篩選(四)免疫化學(xué)篩選篩選方法分子生物學(xué)實驗安排第一次實驗：質(zhì)粒提取、鑒定（pGEX-2TK-SP1

/pUC18）。第二次實驗：酶切質(zhì)粒，回收目的片段，將目的基因與載體連接。第三次實驗：制備感受態(tài)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli及表型篩選。質(zhì)粒概念：細菌染色體之外、能夠獨立復(fù)制、可賦予宿主細胞一定生物學(xué)性狀的共價閉環(huán)雙鏈DNA。特性:

雙鏈、閉合環(huán)狀DNA，1-200kb；常含有編碼某些酶的基因。分型：嚴緊型與松弛型。構(gòu)型：超螺旋型SC結(jié)構(gòu)致密跑得快電泳時最快。開環(huán)型OC體積最大,不易從膠孔中穿過。線型LC居中。分離:將質(zhì)粒與細菌的染色體DNA、RNA、蛋白等分離。

堿裂解法、煮沸法、去污劑法等。實驗一質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA的原理基于質(zhì)粒DNA與染色體DNA變性與復(fù)性的差異。

分子大小構(gòu)型pH12.6pH4.8質(zhì)粒DNA小環(huán)狀變性不完全復(fù)性染色體DNA大環(huán)狀完全變性不能復(fù)性操作流程質(zhì)粒提取見實驗教材p89質(zhì)粒鑒定瓊脂糖凝膠電泳灌膠：膠中加入熒光染料(SYBRGreenI)加樣：質(zhì)粒+上樣緩沖液混勻電泳結(jié)果觀察：UV燈下電泳技術(shù)電泳的基本原理帶電顆粒在電場作用下向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象，稱為電泳。帶正電荷的粒子向負極移動，帶負電荷的粒子向正極移動。是生化與分子生物學(xué)的重要研究方法之一，可用于樣品分離、物質(zhì)純度分析和分子量的測定等。一.定義帶有電荷的生物分子在電場作用下可發(fā)生移動。由于混合物各組分所帶電荷性質(zhì)、數(shù)量以及分子量各不相同，在同一電場作用下，各組分的泳動方向和速度也各有差異，所以在一定時間內(nèi)，它們移動距離不同，從而可達到分離鑒定的目的。二.基本原理在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時間內(nèi)它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進行分離、分析和鑒定的基本原理。

-+泳動度設(shè)一帶電粒子在電場中所受的力為F，則

F=QE（Q為粒子所帶電荷，E為電場強度）根據(jù)Stoke定律，一球形分子在溶液中運動所受的阻力F’為：F’=6πrηv（v為分子移動速度；r為分子半徑；η為介質(zhì)黏度）

當分子達到動態(tài)平衡時，

F=F’

即QE=6πrηv

移項得v/E=Q/6πrηv/E表示單位電場強度時粒子運動速度，稱為遷移率，也稱電泳速度，以表示。因此上式也可表示為：

=Q/6πrη

從上式可得到以下結(jié)論帶電粒子在電場中的移動與:

粒子大小有關(guān)，顆粒直徑愈小愈快粒子的電荷有關(guān)，電荷愈多愈快粒子的形狀有關(guān)，愈接近球形愈快三、影響遷移率的因素1.電場強度電場強度是指每厘米的電位降凝膠兩端距離20厘米，電壓降200伏特，電場強度為10伏特/厘米電場強度越高電泳速度越快2.溶液的PH值

PH值決定帶電顆粒的解離程度，決定物質(zhì)所帶凈電荷的多少3.溶液的離子強度緩沖液的離子強度越高，電泳速度越慢一般在0.02-0.24.電滲現(xiàn)象在電場中液體對固體支持物的相對移動紙或纖維素帶負電荷，使其接觸的水溶液帶正電荷，向負極移動。應(yīng)盡量避免選用有電滲作用的支持物四、電泳的分類按電泳的原理來分，可分為二類：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。其裝置復(fù)雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應(yīng)用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。支持物物理性質(zhì):濾紙及其他纖維素薄膜電泳、凝膠電泳、粉末電泳、線絲電泳支持物裝置形式分類：平板式電泳、垂直板式電泳、連續(xù)電泳、圓盤電泳按pH的連續(xù)性分類：連續(xù)pH電泳、非連續(xù)pH電泳瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acry-lamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，簡稱Bis