AM真菌孢子的分離方法

AM真菌孢子的分離方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康模悍蛛x獲得AM真菌孢子實(shí)驗(yàn)原理：利用不用蔗糖密度梯度離心，體視顯微鏡下人工獲得am真菌抱子實(shí)驗(yàn)材料：AM真菌宿主植物根系（或野外植物根系及土壤）、大口徑培養(yǎng)皿若干、組織破碎機(jī)、5ml低速離心機(jī)、38微米及左右的篩子一套、密布尼龍網(wǎng)、9英寸吸管、鑷子等常規(guī)器具若干。實(shí)驗(yàn)步驟：1.AM真菌共生的根樣或土壤釆集從溫室種植的盆栽培養(yǎng)植物（圓錐形杯，深根類植物，圓盆）中提取抱子時(shí)，在所有各種類型的盆栽根系中，將根系完整取出，從根系一側(cè)，從頂部到底部，用鋒利的刀具，切下一個(gè)餅狀的根系須根。也可在野外土壤中，采集野生植物根系，采集后要注意保鮮，保證宿主植物的根系足夠量和不能發(fā)霉變質(zhì)，野外植物樣品也同時(shí)采集適量的根系間土壤，這種根系土壤是緊臨根的土壤，不能距離根系太遠(yuǎn)，而且不同季節(jié)土壤中的抱子數(shù)量是不一樣的。無論是培養(yǎng)植物根樣，還是野外植物根樣急土壤，都要經(jīng)過組織破碎機(jī)處理，因?yàn)槌鼼igaspora以外，所有其他屬的AMF種都會(huì)產(chǎn)生根內(nèi)抱子。2?菌根的組織破碎將根樣置于高速組織破碎機(jī)中，高速破碎約5秒鐘。破碎根系，釋放抱子，并使抱子與附著在根或土壤中菌絲體分離（尤其是帶有厚壁菌絲的菌種）。較長(zhǎng)的破碎時(shí)間不會(huì)影響抱子，但會(huì)破壞根系，挑取的抱子時(shí)，可能會(huì)有更多細(xì)小的植物組織碎屑。大多數(shù)沙子殘留在組織破碎機(jī)中，將破碎后的混合物倒入雙層篩子上，底部篩網(wǎng)的孔徑為38、45或53ym（這三種篩網(wǎng)中的任何一種對(duì)大多數(shù)抱子都適用，盡管有些小的透明球狀種類需要38ym篩網(wǎng)，約400目）。頂部篩孔通常500ym,它可濾得細(xì)根，許多碎屑和非常大的抱子或種皮，但也有較大的抱子偶爾出現(xiàn)在這層，將這些物質(zhì)都轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿上進(jìn)行鏡檢。

3.不同篩子過濾物處理通常，由于植物碎屑較多，我們不通過離心的方法處理頂部篩子濾出物。將其洗凈，轉(zhuǎn)移到一個(gè)大的培養(yǎng)皿（petridish）中，并通過體視顯微鏡觀察，以確認(rèn)沒有抱子存在后，丟棄。底部篩子上的物質(zhì)用橡膠淀帚（rubberpoliceman）收集在一個(gè)50毫升的燒杯中，然后轉(zhuǎn)移到裝有20-60％的蔗糖（價(jià)格便宜）和水的梯度的50毫升試管或離心管中。在臺(tái)式離心機(jī)中離心（約960xg）2-3分鐘。離心結(jié)束時(shí)，土壤和其他肉眼可見的顆粒在管底部沉淀。孢子和細(xì)小的有機(jī)碎屑懸浮在蔗糖溶液中（混合）。蔗糖使用后倒入收集瓶中，可以回收利用的。橡膠淀帚（rubberpoliceman低速離心機(jī)不同濃度蔗糖溶液儲(chǔ)存罐 蔗糖梯度離心管

橡膠淀帚（rubberpoliceman低速離心機(jī)不同濃度蔗糖溶液儲(chǔ)存罐 蔗糖梯度離心管將離心的得到清液迅速倒入更小的篩孔的篩子中，篩子可以是泰勒（Tyler）生產(chǎn)的商用不銹鋼篩，也可以是自制兩種篩網(wǎng)：（1）用塑料瓶制成，去掉瓶底塑料蓋將尼龍網(wǎng)固定一在端；（2）尼龍網(wǎng)粘貼在厚壁PVC管邊緣。小網(wǎng)眼篩子的收集物在自來水下洗滌1-2分鐘，之后轉(zhuǎn)移到玻璃培養(yǎng)皿中。使用自制的9英寸玻璃移液管手工，體視顯微鏡下挑取孢子，將其與有機(jī)碎屑分開。（9英寸的吸液管可以用酒精燈燒烤普通玻璃移液管，進(jìn)行了抽拉制作而成。制作的時(shí)候注意酒精噴燈安全操作）。抱子挑出后，最多可以在4°C下保存30天（每周檢查是否發(fā)霉的抱子，發(fā)現(xiàn)后立即清除）。右圖是長(zhǎng)滿Gigasporagigant盆栽培養(yǎng)物中50毫升提取物的圖像，其豐富的抱子，大到足以被肉眼看見（明亮的綠色圓點(diǎn)），并與小的根碎片混合。下圖顯示了，從淡水濕地根際rhizosphere樣品的誘集培養(yǎng)培養(yǎng)物（左圖）和從誘集培養(yǎng)中手工挑取的孢子（右圖）。看到從該提取物中分離出的不同物種的復(fù)合照片。

最后（也是最費(fèi)力的）步驟是分離鑒定每種形態(tài)型的孢子（以固定