細胞培養(yǎng)及其污染控制

細胞培養(yǎng)及其污染控制CellCultureAndContaminationControl2005.05.15CellandTissueCulture細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識

體外培養(yǎng)(invitroculture)細胞培養(yǎng)(cellculture)器官培養(yǎng)(organculture)組織培養(yǎng)(tissueculture)體外培養(yǎng):將活體結(jié)構(gòu)成分從體內(nèi)取出，放在模擬體內(nèi)環(huán)境的體外環(huán)境中，在無菌，適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的方法。消化，培養(yǎng)傳代～10代40～50代染色體明顯改變，失去接觸抑制行為，可無限制的傳下去！細胞系（CellLine）“危機”“危機”原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）細胞污染及其控制Introduction概念：凡混入細胞培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應(yīng)視為污染微生物污染：真菌、細菌、支原體和病毒細胞間交互污染：非同種的其它細胞化學(xué)污染:影響細胞生存的非細胞所需的化學(xué)成分細胞污染微生物污染及檢測BiologicalContamination容易發(fā)現(xiàn)的生物污染：細菌、真菌污染。不容易被發(fā)現(xiàn)的生物污染：病毒、支原體和其它細胞系的污染。細菌污染BiologicalContamination無抗生素污染易被發(fā)現(xiàn)，抗生素存在易造成隱性污染

培養(yǎng)液pH值改變，溶液變渾濁細菌增值迅速，消耗大量營養(yǎng)，產(chǎn)生毒素抑制細胞生長，并導(dǎo)致細胞崩解死亡。最難發(fā)現(xiàn)和清除嚴格的宿主性自限性對實驗人員是一個潛在的危險因素Biological

Contamination

病毒污染病毒污染支原體（“雜草”）BiologicalContamination污染嚴重難發(fā)現(xiàn)難去除顯微鏡看不到不引起培養(yǎng)液渾濁和PH改變營養(yǎng)要求高不容易用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法檢測到不能通過過濾清除大多數(shù)抗生素對其無效

支原體檢測方法BiologicalContamination方法敏感性優(yōu)點缺點直接DNA染色(如Hoechst33258)低快速，便宜需要熒光顯微鏡結(jié)果不易解釋指示細胞上間接DNA染色(如

Vero)中放大污染結(jié)果易解釋費時免疫熒光單克隆抗體易操作靈敏需要熒光顯微鏡肉湯和瓊脂培養(yǎng)高靈敏慢需要專業(yè)解釋ELISA中快速檢查種類有限PCR中-高特異性強快速需要PCR設(shè)備支原體污染（Bisbenzimide染色檢測）

真菌污染真菌的種類很多，污染培養(yǎng)細胞的多為毛霉菌、孢子霉、白念珠菌，酵母菌等，很容易通過孢子傳播。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成肉眼可見的白色或淺黃色漂浮物，短期內(nèi)培養(yǎng)液不渾濁。顯微鏡下觀察可見在細胞之間有縱橫交錯穿行的絲狀、管狀及樹狀菌絲。常規(guī)抗生素、紫外線和酒精滅菌對真菌的作用有限，效果較差。真菌污染大部分是人帶進去的BiologicalContamination酵母菌污染霉菌污染

難于發(fā)現(xiàn)若出現(xiàn)傳代細胞的生長速度異常，考慮交叉污染同一時間只傳同一種細胞每種細胞要有單獨的培養(yǎng)液建立細胞庫，每三個月更換一次細胞BiologicalContamination細胞系交叉污染HeLacellscaneasilyinvadeotherculturesduringroutinelabtransferproceduresandhadcontaminatedmanyothercelllinesusedinresearchbythelate1960s.空氣空氣是微生物傳播的最主要途徑在操作間交談、咳嗽空氣消毒不充分頻繁進出培養(yǎng)操作場地與外界隔離不嚴不戴口罩

ContaminationControl微生物污染的途徑空氣流動變強，污染空氣侵入操作間，造成污染一般培養(yǎng)室環(huán)境中含菌數(shù)應(yīng)小于1～5個/m3

！器材及培養(yǎng)液

各種培養(yǎng)器皿及培養(yǎng)液滅菌不徹底CO2培養(yǎng)箱沒有定期消毒實驗操作問題實驗操作無菌觀念不強、動作不準確使用污染的器械封瓶時不嚴血清有些血清在生產(chǎn)時就已被支原體或病毒等污染

體外培養(yǎng)的細胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中加入的抗生素抗污染能力很有限，故細胞一旦發(fā)生污染多數(shù)無法挽救！

輕者：細胞生長緩慢，變得粗糙，輪廓增強，胞質(zhì)出現(xiàn)較多的顆粒狀物質(zhì)。用這類帶菌狀態(tài)的細胞做實驗，可能會影響實驗結(jié)果的真實性。

重者：細胞停止生長，大面積脫壁，崩解、死亡，直接導(dǎo)致實驗失敗。

BiologicalContamination微生物污染對細胞的影響微生物污染的防治ContaminationControl良好的無菌操作合理利用抗生素建立細胞庫保持工作區(qū)清潔良好的規(guī)章制度細胞污染的檢測樹立“預(yù)防為主”的思想所有玻璃器皿和培養(yǎng)液與試劑的配制應(yīng)嚴格無菌；避免溢出、濺出和氣溶膠；吸入或吸出液體時避免傾倒；吸入或吸出液體時，不要觸碰細胞培養(yǎng)瓶的瓶口；液體應(yīng)分裝并置4～8℃保存；每種細胞應(yīng)使用單獨的培養(yǎng)液；

切記細胞培養(yǎng)時應(yīng)避免交談良好的無菌操作ContaminationControlContaminationControl實驗前制定好實驗計劃和操作程序，備齊各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會；超凈工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果；

—些操作用具如移液器、廢液缸、試管等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒；

良好的無菌操作過度依賴抗生素會使人們忽略無菌操作