第二章.基因工程主要技術(shù)原理-電泳、雜交

第二章基因操作的主要技術(shù)原理第一節(jié)核酸的凝膠電泳第二節(jié)核酸分子雜交第三節(jié)PCR基因擴增第四節(jié)基因定點誘變第五節(jié)DNA核苷酸序列分析第六節(jié)研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法返回目錄1分子生物學主要技術(shù)密度梯度超速離心和電子顯微鏡技術(shù)DNA分子的切割與連接核酸分子雜交、凝膠電泳、DNA序列結(jié)構(gòu)分析以及基因的人工合成、基因定點突變和PCR擴增等多種新技術(shù)、新方法。DNA分子的切割與連接，是基因操作的核心部分返回第二章返回目錄2第一節(jié)核酸的凝膠電泳

1.基本原理

2.瓊脂糖凝膠電泳

3.脈沖電場凝膠電泳返回第二章返回目錄32.1.1原理電泳及遷移率核苷酸鏈多聚陰離子

在生理條件下，核酸分子的糖一磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態(tài)的。相同分子量的雙鏈DNA幾乎具有等量凈電荷無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的介質(zhì)降低了對流運動，故電泳的遷移率又是同分子的摩擦系數(shù)成反比的。已知摩擦系數(shù)是分子的大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)，分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異，所帶的凈電荷的多寡，便彼此分離開來。42.1.2瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖為線性多糖聚合物，紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。瓊脂糖溶液加熱到沸點后冷卻凝固，密度由濃度決定的。分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān):瓊脂糖凝膠分辨范圍為0．2～50kb之間.5不同濃度瓊脂糖凝膠的分辨能力凝膠類型及濃度

分離DNA片段的大小范圍（bp）

0.3％瓊脂糖50000～10000.7％瓊脂糖20000～10001.4％瓊脂糖6000～3004.0％瓊脂糖1000～10010％瓊脂糖500～2520％瓊脂糖50～16電泳裝置7凝膠電泳的優(yōu)點它不單是一種分析的手段，同時也可以用來制備和純化特定的DNA片段。在這方面，低熔點（LMP）的瓊脂糖凝膠較為方便。LMP瓊脂糖是一種熔點為62～65℃的瓊脂衍生物，它一旦熔解，便可在37℃下持續(xù)保持液體狀態(tài)達數(shù)小時之久，而在25℃下也可持續(xù)保持液體狀態(tài)約10分鐘。LMP瓊脂糖可以不經(jīng)電洗脫或破碎凝膠，即可用來回收DNA分子。8常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青及銀染色.溴酚蘭在堿性液體中

呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈蘭色，在1%和1.4%瓊脂糖中遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA相似.指示劑一般與蔗糖、甘油組成載樣緩沖液.作用有①增加樣品密度.②在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置.③使樣品呈色，加樣操作更方便

指示劑9溴化乙錠染色溴化乙錠（ethidiumbromide，簡稱EtBr），是一種具扁平分子的核酸染料，在一切可能的部位同DNA分子結(jié)合，卻不能同瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠結(jié)合并在300nm紫外光照射下放射出，可顯現(xiàn)凝膠中0.05ug的微量DNA

方法：加入凝膠中，凝膠浸泡重要的特性：熒光強度同DNA片段的大小或數(shù)量成正比。在包含有數(shù)種DNA片段的電泳譜帶中，每一條帶的熒光強度是隨著從最大的DNA片段到最小的DNA片段方向逐漸降低的。10電泳照片11銀染銀染色:銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色.也用于瓊脂糖凝膠染色.其靈敏度比EB高200倍.但銀染色后，DNA不宜回收12LMP瓊脂糖回收DNA分子將凝膠在65℃下加熱數(shù)分鐘，然后向液態(tài)瓊脂糖溶液中加入過量的酚液抽提DNA，這樣在離心所得的上清液中便含有除去了瓊脂糖的DNA分子。另外，一旦LMP瓊脂糖已經(jīng)熔化，并保持在37℃下，那么就可以直接進行一定的酶催反應(yīng)。據(jù)此，人們可以對業(yè)經(jīng)電泳分離的DNA酶切片段進行第二種酶切消化反應(yīng)。將這種混合物加到另一個凝膠槽上，待凝固之后，再進行第二次電泳1314變性膠電泳方法用途152.1.3脈沖電場凝膠電泳DNA大分子的分離：實驗表明，即便是濃度為0.1％～0.2％的瓊脂糖凝膠，亦不能分離分子量大于750kb的DNA大分子。原核生物，其染色體基因組DNA超過4000kb，哺乳動物DNA達數(shù)千kb。常規(guī)凝膠，超過一定大小范圍的所有的雙鏈DNA分子，都按相同速率遷移。因為它們在單向恒定電場的作用下，僅以“一端向前”的方式游動穿過整個膠板。

1984，Schwartz和Cantor：脈沖電場凝膠電泳（pulsed－fieldgelelectrophoresis，簡稱PFGE）技術(shù)，可分離整條染色體。大分子量DNA需更多次數(shù)更換構(gòu)型和方位，以便按新方向游動。遷移速率慢，可分離到107bpDNA大分子。16“電泳”思考題電泳的原理是什么請說出以下電泳用膠的區(qū)別：普通DNA分離、測序膠、Southern雜交比較分子量相同的三種不同構(gòu)型的DNA（直鏈線形、閉合環(huán)形、開鏈環(huán)形）在同一電場中的電泳遷移率比較溴化乙錠染色和銀染的區(qū)別說明電泳技術(shù)在基因工程中的作用返回第二章返回目錄17第二節(jié)核酸分子雜交

1.SouthernDNA印跡雜交

2.NorthernRNA印跡雜交

3.Western印跡雜交

4.菌落(或噬菌斑)雜交

5.斑點印跡雜交和狹線印跡雜交返回第二章返回目錄182.2.1Southernblot根據(jù)毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當?shù)臑V膜上，然后通過同標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由E．Southern于1975年首先設(shè)計出來的，故又叫做SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。

19Southernblot原理模式變性膠電泳×轉(zhuǎn)膜放射性探針雜交放射自顯影回收DNA漂洗20Southernblot轉(zhuǎn)移裝置圖緩沖液玻璃板21Southernblot自顯影圖樣22探針標記探針-單鏈探針：

末端標記Klenow:標記3’端，補平和置換反應(yīng)T4polymerase:標記3’端3’-5’外切活性強，特別適用于3’突出末端Kinase:標記5’端正反應(yīng)32P→5’-OHNNNN→5’pNNNN

交換反應(yīng)過量ATP使5’-p→ADPthen32P→5’末端轉(zhuǎn)移酶標記3’DNA片段，Oligo,隨機DNAssDNA模板，通用引物，合成ss