血凝時(shí)間與凝血酶時(shí)間的相關(guān)性研究

血凝時(shí)間與凝血酶時(shí)間的相關(guān)性研究

經(jīng)典的凝血理論認(rèn)為，凝血過(guò)程有兩種方式。以往認(rèn)為內(nèi)在途徑的啟動(dòng)環(huán)節(jié)——接觸激活系統(tǒng)并不參與體內(nèi)凝血過(guò)程。目前較為盛行的凝血學(xué)說(shuō)是兩階段學(xué)說(shuō),即組織因子途徑(外在途徑)負(fù)責(zé)凝血過(guò)程的啟動(dòng),截短的內(nèi)在途徑負(fù)責(zé)凝血過(guò)程的放大。在凝血瀑布形成過(guò)程中,凝血酶正反饋?zhàn)饔檬顷P(guān)鍵因素,而其中一個(gè)重要反饋點(diǎn)XI因子是兩條途徑的銜接點(diǎn)。激活部分凝血活酶時(shí)間(APTT)和凝血酶原時(shí)間(PT)均為臨床上檢測(cè)經(jīng)典內(nèi)、外凝血途徑的常用試驗(yàn)。為尋求一個(gè)試驗(yàn)同時(shí)反映凝血過(guò)程的兩個(gè)階段的方法,近年我們已利用玉米胰蛋白酶抑制物(CTI)抑制凝血因子X(jué)IIa(FXIIa),證明用稀釋的凝血活酶時(shí)間可反映兩階段凝血過(guò)程。但是,對(duì)影響FXIIa受抑稀釋凝血活酶時(shí)間(FXIIai-DTT)試驗(yàn)各種因素及其臨床意義尚不清楚。本研究旨在了解各種抗凝劑、各種制備血漿和某些影響纖溶過(guò)程藥物對(duì)試驗(yàn)的影響,并觀察FXIIai-DTT與PT、APTT的相關(guān)性。材料和方法1.cti、抑肽酶和羧基芐胺乏因子VIII血漿、APTT試劑盒、兔腦凝血活酶(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所),CTI(美國(guó)EnzymeResearchLab),抑肽酶(北京東亞免疫技術(shù)研究所),對(duì)羧基芐胺(湖南洞庭制藥廠)。2.不同抗凝劑治療ppp的制備(1)所有試驗(yàn)均用一次性塑料注射器抽取空腹靜脈血液。按9份體積全血與1份體積0.13mol/L枸櫞酸三鈉比例混勻抗凝,3500r/min離心20min,吸取上層液即貧血小板血漿(PPP),用1.5mlEppendorf管分裝,即用或凍存于-70℃冰箱備用。(2)正常血漿:在30份靜脈血(本院健康學(xué)生和教師提供)0.13mol/L枸櫞酸三鈉抗凝、離心,提取PPP,即成正常單個(gè)血漿。取等同正常單個(gè)血漿進(jìn)行混合,即成正?；旌涎獫{。(3)儲(chǔ)存血漿和硫酸鋇吸附血漿:按參考文獻(xiàn)制成。(4)不同抗凝劑制備血漿:另抽5名健康成人靜脈血,每份血分別等同注入含0.13mol/L枸櫞酸三鈉,0.1mol/L草酸鈉,1%EDTA-Na2溶液和20U/ml肝素;4支試管中抗凝劑與靜脈血體積比為1∶9,混勻抗凝、離心,提取PPP,每種均為5份。(5)患者血漿:血漿標(biāo)本33份取自湘雅醫(yī)院住院患者,其中急性心肌梗死(AMI)經(jīng)冠脈造影確診的18份,急性缺血性腦卒中(AIS)經(jīng)CT掃描確診的15份。血標(biāo)本均在發(fā)病24h內(nèi)采取,抗凝為0.13mol/L枸櫞酸三鈉,血漿制備方法與正常血漿相同。3.凝血活酶pt(1)APTT:按廠家試劑盒附說(shuō)明書(shū)操作。(2)PT:按參考文獻(xiàn)進(jìn)行。(3)FXIIai-DTT:同PT測(cè)定。但凝血活酶濃度僅為正常血漿PT試驗(yàn)1‰,即1∶1000倍稀釋。試驗(yàn)前先向待測(cè)血漿中加入CTI(終濃度為25μ/ml)以抑制FXIIa活性。4.數(shù)據(jù)處理因素組間比較血漿凝固時(shí)間數(shù)據(jù)用ˉx±sxˉ±s表示,不同處理因素組間比較采用方差分析,若F>0.05,則以q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。對(duì)FXIIai-DTT與PT、APTT間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果1.i-dtt、pt、aptt的s30份健康成人枸櫞酸三鈉抗凝所提取的PPP,分別測(cè)定PT、APTT和FXIIai-DTT凝固時(shí)間。FXIIai-DTT(81.3±8.9)s,PT(12.9±1.7)s,APTT(37.1±3.5)s。FXIIai-DTT與PT、APTT間的相關(guān)系數(shù)分別為0.83和0.87(均P<0.01)。說(shuō)明在不同個(gè)體間無(wú)論是PT還是APTT的變化,均可相應(yīng)出現(xiàn)FXIIai-DTT變化,即FXIIai-DTT的長(zhǎng)短可反映PT、APTT的長(zhǎng)短。2.u3000酸鈉凝固時(shí)間5份健康人血采用不同抗凝劑提取PPP血漿,所測(cè)的FXIIai-DTT、PT和APTT見(jiàn)表1。結(jié)果表明4種抗凝劑對(duì)3項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)產(chǎn)生的影響均不相同。2U/ml肝素對(duì)血漿凝固影響作用最強(qiáng),無(wú)論對(duì)PT還是對(duì)APTT和FXIIai-DTT,其凝固時(shí)間均明顯長(zhǎng)于其他3種抗凝劑,1%EDTA-Na2影響強(qiáng)度次之;0.1mol/L草酸鈉影響又較0.13mol/L枸櫞酸三鈉的時(shí)間明顯延長(zhǎng)。但除0.1mol/L草酸鈉和0.13mol/L枸櫞酸三鈉抗凝血的PT差異不明顯(P>0.05)外,3種抗凝劑所測(cè)得的其余指標(biāo)差異均有顯著意義(均P<0.01)。從臨床實(shí)用性考慮,0.13mol/L枸櫞酸三鈉作為抗凝劑較為合適。3.不同阻凝劑含量的血漿中凝血因子的檢測(cè)結(jié)果正常混合血漿按不同體積比例分別與硫酸鋇吸附血漿、儲(chǔ)存血漿和乏FVIII血漿混合,測(cè)得FXIIai-DTT與PT、APTT的結(jié)果(表2)顯示,隨著3種不同凝血因子缺乏血漿比例含量的增大,血漿中凝血因子隨之減少,血漿凝固所需時(shí)間延長(zhǎng)。但3種不同乏凝血因子血漿的檢測(cè)結(jié)果則不相同,其中PT延長(zhǎng)以硫酸鋇吸附血漿影響最為顯著,儲(chǔ)存血漿次之,乏FVIII血漿幾乎無(wú)影響;而APTT則均呈劑量關(guān)系延長(zhǎng)。無(wú)論P(yáng)T還是APTT延長(zhǎng),或者兩者都延長(zhǎng)時(shí),可發(fā)現(xiàn)FXIIai-DTT也延長(zhǎng)。說(shuō)明血漿中凝血因子含量的減少,可在FXIIai-DTT試驗(yàn)中得以反映。此外本試驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)儲(chǔ)存血漿和乏FVIII血漿比例在20%或以下時(shí),其血漿凝固時(shí)間可正常,證明正常血漿中凝血因子有足夠的生理貯備。4.羧基芐胺化合物類(lèi)化合物pge對(duì)pge-tt、pt和aptt變化在枸櫞酸三鈉制備的混合血漿中分別加入抑肽酶(終濃度為200U/ml)和對(duì)羧基芐胺(終濃度為0.1g/ml),測(cè)定FXIIai-DTT、PT和APTT變化,結(jié)果(表3)顯示,抑肽酶和對(duì)羧基芐胺對(duì)PT、APTT影響不明顯(P>0.05),但使FXIIai-DTT延長(zhǎng)(P<0.01)。5.凝固時(shí)間相關(guān)指標(biāo)18份AMI和15份AIS患者血漿3項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果(表4)顯示,AMI和AIS患者血漿凝固時(shí)間較混合血漿加快,表現(xiàn)為FXIIai-DTT、PT及APTT均縮短,其相關(guān)性具有顯著性差異(均P<0.05)。說(shuō)明其血漿中凝血因子的活性或含量比正?；旌涎獫{高。重新設(shè)計(jì)凝血因子漿凝血過(guò)程,見(jiàn)表1臨床上以APTT和PT分別檢測(cè)內(nèi)、外途徑凝血過(guò)程中凝血因子含量及功能變化,但并不能反映體內(nèi)生理凝血全過(guò)程。臨床和試驗(yàn)均表明,接觸系統(tǒng)(由高分子量激肽原、前激肽釋放酶與XII因子組成)蛋白缺乏或缺陷在體內(nèi)并不引起出血表現(xiàn),相反這3個(gè)蛋白的純合子缺乏患者存在血栓傾向。APTT試驗(yàn)中,加入外源性帶負(fù)電荷的硅藻土或白陶土,可通過(guò)接觸系統(tǒng)活化而致系列凝血因子的激活,產(chǎn)生血漿凝固,臨床常以該試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)判斷FVIII、FIX和FXI缺乏或嚴(yán)重的功能障礙。PT試驗(yàn)則以加入大量的組織因子(不同來(lái)源的凝血活酶)而致外在途徑的凝血因子激活,產(chǎn)生血漿凝固。實(shí)際上,在生理情況下,血管壁損傷引起少量組織因子激活即可啟動(dòng)凝血過(guò)程,已證明生理凝血是通過(guò)凝血酶正反饋活動(dòng)進(jìn)行的。即起始的微量凝血酶除可激活血小板外,還可激活FXI、FVIII、FV等,通過(guò)內(nèi)在途徑維持放大凝血過(guò)程,使凝血酶足量生成而導(dǎo)致血液凝固。近來(lái)的資料證實(shí),凝血酶對(duì)FXI的激活具有重要意義。FXIIai-DTT試驗(yàn)即以此為依據(jù)而設(shè)計(jì),它不僅反映了低濃度組織因子對(duì)外在途徑的啟動(dòng),而且反映微量凝血酶通過(guò)“截短”的內(nèi)在途徑(由FXI起始)的放大,因此該試驗(yàn)可反映參與兩條經(jīng)典凝血途徑的凝血因子的功能狀態(tài)。我們?cè)鴪?bào)道FXIIai-DTT試驗(yàn)?zāi)軌蚍从衬^(guò)程的兩階段變化。本研究不但進(jìn)一步支持FXIIai-DTT試驗(yàn)的結(jié)論,而且FXIIai-DTT與PT和APTT間存在著一定的正相關(guān)關(guān)系(r=0.83,P<0.01)。此外,不同個(gè)體間3項(xiàng)指標(biāo)值有差異,而同一個(gè)體的血樣本在不同時(shí)間所測(cè)得的值也不同,但是FXIIai-DTT的變化則與APTT、PT變化相一致。由于在體外FV和FVIII的穩(wěn)定性差,易失活,要求APTT血漿標(biāo)本必須在4h內(nèi)檢測(cè)。因此進(jìn)行FXIIai-DTT也應(yīng)盡快在短時(shí)間內(nèi)完成。4種抗凝劑制備血漿所測(cè)得FXIIai-DTT均延長(zhǎng)且明顯不同。枸櫞酸三鈉、草酸鈉和EDTA均是Ca2+的絡(luò)合劑,其中EDTA可與Ca2+形成一種不溶性復(fù)合物,具有強(qiáng)的Ca2+絡(luò)合能力。除此之外,EDTA還具有滅活FV的作用,因而血漿凝固時(shí)間較草酸鈉和枸櫞酸鈉要長(zhǎng)。而草酸鈉結(jié)合Ca2+的能力較EDTA弱,但較枸櫞酸三鈉強(qiáng),因此枸櫞酸鈉制備血漿的凝固時(shí)間最短。凝血酶是參與凝血后期反應(yīng)的關(guān)鍵酶,肝素通過(guò)與抗凝血酶Ⅲ結(jié)合,可抑制凝血酶和絲氨酸蛋白酶(FXa、FIXa、FXIa)及血小板活化功能,而致血漿凝固時(shí)間明顯延長(zhǎng)(本試驗(yàn)為10min內(nèi)不凝固)。從4種抗凝劑所得的結(jié)果說(shuō)明FXIIai-DTT可反映血漿中凝血抑制物的狀態(tài)。缺乏不同的凝血因子血漿FXIIai-DTT延長(zhǎng),也證明FXIIai-DTT是一種具有反映凝血因子含量或功能狀態(tài)的試驗(yàn)方法。在乏FVIII血漿中,隨著其缺乏比例增高,APTT和FXIIai-DTT也相應(yīng)地延長(zhǎng)。因此認(rèn)為FXIIai-DTT與APTT一樣,也可作為檢測(cè)血友病的一種試驗(yàn)方法應(yīng)用于臨床。在用硫酸鋇吸附血漿中FII、FVII、FIX和FX后,由于主要的外在和共同凝血途徑受到影響,因而FXIIai-DTT與PT均延長(zhǎng)的相關(guān)性更為密切,FXIIai-DTT可反映出外凝血途徑受影響。在儲(chǔ)存血漿中,由于血漿貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致血漿中FV和FVIII的失活,FXIIai-DTT延長(zhǎng)與APTT的相關(guān)性更大,因?yàn)橘A存血漿缺乏內(nèi)源性凝血途徑的凝血因子FVIII和共同途徑中的FV,說(shuō)明FXIIai-DTT的變化也可反映內(nèi)在凝血途徑的變化。但需要強(qiáng)調(diào)的是,血漿中的凝血因子濃度或活性需要低到一定程度時(shí),FXIIai-DTT才會(huì)與APTT和PT一樣出現(xiàn)變化。這是因?yàn)檎Ｑ獫{凝固并非全部凝血因子參與,即正常生理情況下,血漿中的凝血因子有較多的貯備,因此在一定范圍內(nèi)隨著血漿的稀釋,某些檢測(cè)凝血因子的試驗(yàn)會(huì)表現(xiàn)“正?！薄Ｓ嘘P(guān)抑肽酶和對(duì)羧基芐胺致FXIIai-DTT延長(zhǎng),而對(duì)PT和APTT無(wú)明顯影響的現(xiàn)象,其機(jī)理尚不清楚,可能與抑肽酶能競(jìng)爭(zhēng)抑制FVIIa-TF復(fù)合物有關(guān)。但是纖溶系統(tǒng)與凝血系統(tǒng)存