缺氧誘導(dǎo)因子-1在大鼠血栓閉塞性脈管炎模型中的表達(dá)及意義

缺氧誘導(dǎo)因子-1在大鼠血栓閉塞性脈管炎模型中的表達(dá)及意義

動脈硬化性鎖靜脈炎（tao）是常見的出血性缺血性疾病之一，主要表現(xiàn)為全身非感染性動脈炎。本課題旨在研究缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)在大鼠血栓閉塞性脈管炎模型中的表達(dá)規(guī)律并探討其臨床意義。1材料和方法1.1氧基雙環(huán)因子水分酶系統(tǒng)成分酶Wistar大鼠35只,雄性,體重400g～550g,山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室提供;月桂酸,北京市旭東化工廠;缺氧誘導(dǎo)因子-1α酶聯(lián)免疫試劑盒,上海西塘生物科技有限公司。缺氧誘導(dǎo)因子-1α免疫組化試劑盒,武漢博士德公司。1.2方法1.2.1大鼠血栓閉塞性脈管炎模型的制備Wister大鼠35只,隨機(jī)分為假手術(shù)組及1d、3d、1周、2周、3周、4周造模組,每組5只。術(shù)前均留取血清標(biāo)本,參照文獻(xiàn)方法稍加改進(jìn),制作大鼠血栓閉塞性脈管炎模型。術(shù)畢給予青霉素40×104U腹腔注射,預(yù)防感染。按照造模時(shí)間分批處死,假手術(shù)組于4周時(shí)處死,處死前留取術(shù)后血清標(biāo)本,并取左右后肢造模處周圍肌肉組織。1.2.2血清hif-1檢測采用ELISA法檢測術(shù)前與術(shù)后血清中缺氧誘導(dǎo)因子-1α濃度,按照試劑盒說明書進(jìn)行。1.2.3小鼠骨髓中he免疫組化SABC法檢測各組造模側(cè)肢體血管及肌肉組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)情況,健側(cè)肢體作為對照,操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。HIF-1α蛋白以細(xì)胞核或胞漿中有棕黃色顆粒為陽性,無反應(yīng)為陰性,在400倍視野下采用CooledCCD采集圖像,使用IPP軟件測量表達(dá)平均灰度值。平均灰度值范圍0～255,其值越低,蛋白表達(dá)越高,其值越高,蛋白表達(dá)越低。1.3統(tǒng)計(jì)處理計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。采用方差分析,兩兩比較采用LSD法。SPSS13.0處理分析。2結(jié)果2.1周、3周、4周組各造模組大鼠均出現(xiàn)左后肢缺血表現(xiàn),依造模時(shí)間增加而逐漸加重,1d組、3d組均有左后肢缺血、腫脹、足趾發(fā)黑表現(xiàn)。1周組缺血表現(xiàn)加重、壞死范圍擴(kuò)大至踝部。2周組出現(xiàn)干性壞疽、壞死范圍至膝部,局部炎癥反應(yīng)明顯,3周、4周組有壞死肢體脫落表現(xiàn),嚴(yán)重者有肢體干性壞疽,甚至肢體脫落。組織病理切片示:炎癥反應(yīng)明顯,炎癥細(xì)胞聚集,肌肉組織失去正常紋理結(jié)構(gòu),2周、3周、4周組股動脈內(nèi)可見節(jié)段性閉塞,廣泛血管內(nèi)血栓形成,并伴有大量新生毛細(xì)血管。大鼠體征變化及病理切片結(jié)果證實(shí),大鼠血栓閉塞性脈管炎模型建立成功。2.2造模前后血清中hof-1表達(dá)水平比較所有造模組大鼠術(shù)后血清HIF-1α表達(dá)均高于術(shù)前,造模1d組、3d組、1周組、2周組、3周組、4周組、術(shù)后血清HIF-1α表達(dá)水平分別與術(shù)前比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),假手術(shù)組造模前后HIF-1α血清表達(dá)水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,各造模組術(shù)后血清HIF-1α表達(dá)在1d組迅速升高,3d時(shí)略降低,后逐漸下降,但均高于假手術(shù)組水平,其中1d與3d之間、1周與2周之間、3周與4周之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余造模組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1。2.3平均粒度值比較HIF-1α蛋白在假手術(shù)組雙側(cè)及造模組健側(cè)肌肉中低表達(dá),造模組患側(cè)肌肉組織中高表達(dá),各造模組患側(cè)HIF-1α蛋白表達(dá)的平均灰度值較健側(cè)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中1d組、3d組平均灰度值最低,兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,較其他造模組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),1周組、2周組表達(dá)水平組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,較其他造模組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),3周組、4周組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,較其他造模組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2。3血管造影在血管生理和臨床應(yīng)用中的應(yīng)用TAO是一種以中小動脈節(jié)段性、非化膿性炎癥和腔內(nèi)血栓形成特征的疾病,是青壯年肢體缺血的主要原因之一,其發(fā)病特點(diǎn)、病理變化和臨床特點(diǎn)均有別于動脈粥樣硬化和其他免疫性動脈炎,但組織的缺血缺氧是其發(fā)病機(jī)制中最重要的一環(huán)。缺氧誘導(dǎo)因子-1α作為目前發(fā)現(xiàn)的唯一在低氧條件下發(fā)揮作用的調(diào)控亞基,可促進(jìn)多種血管生成因子的表達(dá),促進(jìn)生理及病理性血管的生成,組織缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠TAO模型,初步探討HIF-1α在其發(fā)病過程中的表達(dá)規(guī)律,以期為臨床診斷治療提供簡便有效的量化指標(biāo)。TAO動物模型的復(fù)制和研究是本研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)與基礎(chǔ)。TAO動物模型制作方法最早報(bào)道是Ashida采用向大鼠股動脈注射月桂酸鈉的方法。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),注射后嚴(yán)格壓迫穿刺點(diǎn),確認(rèn)無出血之后即可縫合皮膚,無需OB膠封閉穿刺點(diǎn),預(yù)實(shí)驗(yàn)及正式試驗(yàn)中均未發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動物造模肢體出血及死亡現(xiàn)象,此為本實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)之處。Tarak等認(rèn)為,肢體對動脈阻塞作出適應(yīng)性反應(yīng)中,最重要的是動脈生成中,側(cè)支循環(huán)重建和血管內(nèi)血流量增加。本研究證實(shí),大鼠血栓閉塞性脈管炎模型中,缺血早期HIF-1α在血清和肌肉組織中均迅速升高,隨著病情的進(jìn)展而逐漸降低,一周后表達(dá)水平與早期已有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但仍高于正常,此時(shí)組織中可見新生毛細(xì)血管生成,側(cè)支循環(huán)建立,3周后血清中表達(dá)水平與正常水平已無差異,而肌肉組織中仍高于正常水平,但較早期已明顯降低。缺血早期低氧濃度促使HIF-1α高表達(dá),促進(jìn)了多種血管生成因子的表達(dá),有利于早期小血管生成以適應(yīng)缺血缺氧環(huán)境,但其中很多是病理性小血管,并伴有血栓形成,對改善組織供氧意義不大,但后期其表達(dá)持續(xù)降低,導(dǎo)致了VEGF等生成減少,未能生成大量有效的側(cè)支循環(huán),導(dǎo)致病情加重,最終組織大量壞死,導(dǎo)致干性壞疽甚至肢體脫落。本實(shí)驗(yàn)中3d與一周之間的HIF-1α下降關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)及促使其降低表達(dá)的原因還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。目前對于TAO患者的術(shù)前診斷和手術(shù)效果評價(jià),血管造影仍是“金標(biāo)準(zhǔn)”,但存在有創(chuàng)、價(jià)格不菲、不及時(shí)等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)揭示的HIF-1α表達(dá)水平變化與病情變化相關(guān)性可將其作為術(shù)前診斷及術(shù)后監(jiān)測、療效評判的簡便易行的方法之一,同時(shí),相