bdlsc移植對(duì)大鼠肝組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-smad信號(hào)通路的影響

bdlsc移植對(duì)大鼠肝組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子--smad信號(hào)通路的影響

0upa在肝纖維化中的作用骨髓源性肝干的血漿（cds）來(lái)源豐富，具有很強(qiáng)的抗殖能力，具有很強(qiáng)的肝系細(xì)胞分化能力，是肝系統(tǒng)疾病理想的靶細(xì)胞。尿激酶原激生物（uromorniza）對(duì)降低肝臟疾病的抗生素質(zhì)化和肝臟纖維化起著重要作用。建議將肝干、upa基因治療結(jié)合起來(lái)，28.善安參與壞死組織和降低纖維的空間，促進(jìn)ugc參與肝組織的培育、移植和分化，重建正常的肝組織結(jié)構(gòu)。它被認(rèn)為是肝組織形態(tài)和功能恢復(fù)的最重要因素之一。smad3和smad7是tgf-1后下游的信號(hào)轉(zhuǎn)移因素之一。在本研究中，通過(guò)人類(lèi)父母的父母權(quán)基因（adupa），轉(zhuǎn)移到肝纖維大鼠體內(nèi)，評(píng)估轉(zhuǎn)移到肝纖維大鼠體內(nèi)的影響，以及tgf對(duì)硫氨酸鈉感染的影響。1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染純系Fisher344♂大鼠10只,♀大鼠36只,體質(zhì)量150-180g,購(gòu)自中科院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司.其中♂大鼠僅用于提取骨髓干細(xì)胞,是供體大鼠,而♀大鼠是受體大鼠.TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司.TaqDNA聚合酶購(gòu)自大連TaKaRa寶生物有限公司.TGF-β1、Smad7兔多克隆抗體和Smad3羊多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司.1.2肝組織病理學(xué)檢測(cè)人pAduPA重組腺病毒質(zhì)粒由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院林勇博士惠贈(zèng).利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在293細(xì)胞中包裝和擴(kuò)增,用氯化銫梯度離心純化,AduPA最終病毒滴度可達(dá)3×1012μfu/L.采用淋巴分離液進(jìn)行密度梯度離心法分離膽總管結(jié)扎后10d大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞,使用含5%的大鼠淤膽血清的病理?xiàng)l件培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)BDLSC.應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)肝干細(xì)胞標(biāo)志表達(dá).將♀大鼠隨機(jī)分為4組,每組9只.(1)正常組:皮下注射等量橄欖油;(2)模型組:予40%CCl4(CCl4∶橄欖油=2∶3,3mL/kg)皮下注射,3d注射1次,首劑加倍,共注射18次,并經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水;(3)BDLSC組:造模方法與模型組相同,于實(shí)驗(yàn)第4周經(jīng)尾靜脈輸入2×106BDLSC;(4)BDLSC-uPA組:造模方法與模型組相同.AduPA以感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,MOI)500轉(zhuǎn)染BDLSC,72h后收集BDLSC溶于生理鹽水,于實(shí)驗(yàn)第4周經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入2×106轉(zhuǎn)基因BDLSC.細(xì)胞移植后應(yīng)用免疫抑制劑他克莫司灌胃,0.1mg/(kgd).各組大鼠于第8周處死,留取血清及肝組織.以甲醛固定矢狀肝組織切片,常規(guī)石蠟包埋.制備5μm厚肝組織切片用于HE染色.取各組大鼠血清1.5mL,使用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能指標(biāo)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartateaminotransferase,AST)、總膽紅素(totalbilirubin,TBIL)和白蛋白(albumin,ALB).將石蠟切片脫蠟至水,微波抗原修復(fù)10min,加3%H2O2后于室溫下孵育20min;加正常封閉羊血清,室溫下孵育20min;棄去羊血清,加入一抗(TGF-β1:1∶200),于4℃中過(guò)夜;次日加對(duì)應(yīng)二抗,37℃中孵育45min;DAB顯色,顯微鏡下觀(guān)察適時(shí)終止反應(yīng),蘇木素復(fù)染,脫水封片.每個(gè)動(dòng)物隨機(jī)選取3張石蠟切片重復(fù)實(shí)驗(yàn),每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野,應(yīng)用Image-Proplus5.1圖像分析軟件計(jì)算每個(gè)視野的陽(yáng)性染色百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì).統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以mean±SD表示,采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素ANOVA或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析.P<0.05為顯著性界值.各組大鼠肝組織切片HE染色結(jié)果顯示:模型組肝組織呈廣泛而嚴(yán)重的肝細(xì)胞脂肪變性壞死,門(mén)脈及中央靜脈周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn),匯管區(qū)擴(kuò)大,大量纖維組織增生,假小葉形成,而B(niǎo)DLSC-uPA組肝細(xì)胞變性壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生明顯減輕(圖1).大鼠血清肝功能檢測(cè)結(jié)果顯示:與正常組相比,肝纖維化模型組血清ALT、AST和TBIL水平均顯著升高,ALB水平顯著下降(P<0.05);與模型組相比,BDLSC-uPA組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平均有不同程度的降低,ALB水平升高(P<0.05,表1).Westernblot結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)灰度掃描并與內(nèi)參照(β-actin)比較分析顯示:與模型組(0.8202±0.0636)和BDLSC組(0.2936±0.0548)相比,BDLSC-uPA組的肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)量(0.1849±0.0456)均明顯減低(P<0.05,圖2).免疫組織化學(xué)分析顯示TGF-β1蛋白表達(dá)與Westernblot結(jié)果一致,BDLSC-uPA組的TGF-β1染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(9%±3%)較模型組(51%±6%)和BDLSC組(19%±5%)明顯減少(P<0.05,圖3).而大鼠肝組織Smad3、7蛋白表達(dá)量在各實(shí)驗(yàn)組均無(wú)明顯差異(P>0.05,圖2).結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因移植BDLSC能明顯抑制CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝TGF-β1基因表達(dá)升高,但對(duì)Smad3、Smad7蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響.3肝損傷模型肝纖維化是肝臟對(duì)慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng),以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)在肝內(nèi)過(guò)多沉積為主要特征.由uPA、纖溶酶及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)構(gòu)成的級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)是調(diào)節(jié)ECM沉積的主要途徑.我們將肝干細(xì)胞與uPA基因治療聯(lián)合應(yīng)用時(shí),uPA參與清除壞死組織及降解纖維間隔,促進(jìn)BDLSC種植、重建正常的肝組織結(jié)構(gòu).同時(shí)BDLSC作為uPA的載體細(xì)胞,避免了單純uPA基因治療的免疫原性和毒性.本研究中,我們采用CCl4建立大鼠肝纖維化模型,一方面由于CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化在病理上與人相似,另一方面,CCl4造成一定程度的肝損傷和肝纖維化,有利于BDLSC在肝臟的種植.Terai等將綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細(xì)胞經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入CCl4肝纖維化小鼠模型中,4wk后發(fā)現(xiàn)受體肝臟中有26%供體來(lái)源細(xì)胞,種植率遠(yuǎn)高于其他肝損傷動(dòng)物模型.我們組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn),模型組大鼠肝組織中可見(jiàn)大量肝細(xì)胞變性壞死,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),匯管區(qū)擴(kuò)大;BDLSC-uPA組的大鼠肝組織結(jié)締組織增生程度減輕,纖維間隔變細(xì),假小葉形成不明顯.同時(shí),BDLSC-uPA組大鼠的血清ALT、AST和TBIL水平均有不同程度的降低,ALB水平升高,上述結(jié)果均提示轉(zhuǎn)基因BDLSC移植能明顯減輕大鼠肝纖維化的程度,在一定程度上改善了纖維化大鼠肝功能,抑制了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展.某些學(xué)者發(fā)現(xiàn),輸入體內(nèi)的干細(xì)胞發(fā)揮上述作用并非通過(guò)直接地替代受損細(xì)胞,而是啟動(dòng)了內(nèi)源性的肝再生,從而修復(fù)肝組織.TGF-β1是最重要的促肝纖維化因子之一他促進(jìn)肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell,HSC)活化和ECM合成,抑制肝細(xì)胞再生,并以自分泌和旁分泌的方式上調(diào)TGF-β1表達(dá),加速肝纖維化的發(fā)展.TGF-β1對(duì)HSC的作用信號(hào)主要通過(guò)其受體和下游信號(hào)分子Smads蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo).Smads是TGF-β生長(zhǎng)因子超家族細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的基本組成成分,成員有Smad1-Smad8.TGFβ與受體結(jié)合后誘導(dǎo)Smad2和Smad3磷酸化,并與Smad4形成異寡聚體復(fù)合物,轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄反應(yīng).Smad7能通過(guò)阻斷Smad2、Smad3和Smad4的結(jié)合,對(duì)Smad的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用.基于此,我們檢測(cè)了各組大鼠肝組織中TGF-β1和Smad3、Smad7基因表達(dá).Westernblot檢測(cè)和免疫組織化學(xué)分析均顯示,BDLSC-uPA組的TGF-β1基因表達(dá)較模型組明顯降低,但對(duì)Smad3、Smad7表達(dá)的影響卻不明顯.這與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果相似.Zhao等研究推測(cè)骨髓干細(xì)胞可能分泌一些細(xì)胞因子,如神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)HSC的凋亡,下調(diào)TGF-β1的表達(dá).我們的結(jié)果提示轉(zhuǎn)基因BDLSC抗肝纖維化機(jī)制也可能部分與BDLSC抑制TGF-β1的表達(dá)有關(guān).總之,我們的研究證實(shí)uPA基因修飾BDLSC移植可能部分通過(guò)抑制TGF-β1蛋白表達(dá),從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用.1.2.1adu-32a的包裝和分銷(xiāo)1.2.2sdlc篩選、擴(kuò)展和評(píng)估1.2.3模型和組1.2.4病理人類(lèi)學(xué)試驗(yàn)1.2.5細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)定提取各組肝組織總蛋白分別標(biāo)準(zhǔn)定量后,各取20μg于10%SDS電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜.使用5%BSA/TBST封閉1h,加入一抗(TGF-β11∶200、Smad31∶200、Smad71∶1000、β-actin1∶1000稀釋),于4℃中孵育過(guò)夜.次日用TBST洗滌后,與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000稀釋)在室溫下孵育2h,TBST洗滌.用SuperSignal?westPic化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè),膠片曝光,經(jīng)顯影、定影后結(jié)果掃描入計(jì)算機(jī).2結(jié)果2.1肝組織的肝染色2.2血液清學(xué)2.3轉(zhuǎn)移大豆移植對(duì)大鼠肝組織tgf-i-smod信號(hào)通道的影響1.1材料表面1.2.6網(wǎng)絡(luò)分析1.2.7細(xì)胞治療與細(xì)胞治療的結(jié)合■背景資料近年發(fā)現(xiàn)骨髓中某些干細(xì)胞具有向肝系細(xì)胞分化的潛能,分離骨髓源性肝干細(xì)胞(BDLSC),用于肝病的治療研究受到廣泛重視.尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)在降解纖維、逆轉(zhuǎn)肝纖維化中起重要作用.■同行評(píng)議者單云峰,副主任醫(yī)師,溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽外科■研發(fā)前沿基因治療與細(xì)胞治療的結(jié)合是目前研究的熱點(diǎn).■相關(guān)報(bào)道Zhao等研究推測(cè)骨髓干細(xì)胞可能分泌一些細(xì)胞因子,如神經(jīng)生長(zhǎng)因子,誘導(dǎo)HSC的凋亡,下調(diào)TGF-β1的表達(dá).■創(chuàng)新盤(pán)點(diǎn)本研究發(fā)現(xiàn)BDLSC-uPA組大鼠肝臟結(jié)締組織增生程度減輕,肝