肝郁脾虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建及病理生理改變

肝郁脾虛證動(dòng)物模型的構(gòu)建及病理生理改變

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論和技術(shù)手段的不斷創(chuàng)新，現(xiàn)代中醫(yī)現(xiàn)代化的發(fā)展日益明顯。人類疾病的形態(tài)模擬已成為研究中醫(yī)形態(tài)的重要手段和方法之一。中醫(yī)證候動(dòng)物模型的建立的意義不僅在于形式上的類比或概念上的移植,更重要的準(zhǔn)確把握證候概念的內(nèi)涵和外延,利用現(xiàn)代生物學(xué)理論和技術(shù)復(fù)制出具有中醫(yī)學(xué)理論屬性的證候動(dòng)物模型。本研究旨在分析肝郁脾虛證發(fā)病多因素特征的基礎(chǔ)上,運(yùn)用心身合一的、生物的復(fù)合多因素造模方法來(lái)建立抑郁癥肝郁脾虛證模型,以便建立更接近或符合中醫(yī)基礎(chǔ)理論、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性良、可驗(yàn)證性強(qiáng)的肝郁脾虛證動(dòng)物模型,為建立信度和效度較優(yōu)的肝郁脾虛證模型的作出初步嘗試。1材料和方法1.1藥物、藥品、片、儀器逍遙丸成分:柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)(炒)、茯苓、薄荷、生姜、炙甘草。購(gòu)于貴州省同濟(jì)堂藥業(yè)股份有限公司(生產(chǎn)廠家:河南省宛西制藥有限公司,批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字Z41021831,生產(chǎn)批號(hào):100708);酮康唑片(商品名稱:里素勞),規(guī)格:200mg/片,正常成人用量200mg/d,用蒸餾水配成10mg/mL,4℃冰箱保存(西安楊森制藥有限公司生產(chǎn),批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H10930212,生產(chǎn)批號(hào):100719589);地塞米松針劑:規(guī)格:1mL:5mg;(由貴州光正制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn);批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H52020793;生產(chǎn)批號(hào):100326)。1.2灌胃方式確定根據(jù)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法中不同動(dòng)物等效劑量折算方法,按照公斤體重劑量折算系數(shù)進(jìn)行人與大鼠劑量換算。實(shí)驗(yàn)造模后第29d開始采取灌胃方式給藥,連續(xù)28d;正常組,模型對(duì)照組正常進(jìn)水、進(jìn)食。1.3大鼠行為檢測(cè)清潔級(jí)SD雄性大鼠85只,體重200g±15g(由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供,經(jīng)重慶市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心質(zhì)檢合格并符合實(shí)驗(yàn)要求【動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK[渝]-2011-0005】),在3d的適應(yīng)性喂養(yǎng)之后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)篩選,將合格65只大鼠按統(tǒng)計(jì)學(xué)隨機(jī)表分為正常組與造模組。正常組8只,正常群養(yǎng),每天自由進(jìn)食和飲水;造模組57只,孤養(yǎng),用復(fù)合多因素方法復(fù)制動(dòng)物模型28d后,隨機(jī)分為4組:模型對(duì)照組9只、逍遙散組10只、地塞米松組10只、酮康唑組10只;地塞米松組從造模結(jié)束第29d開始腹腔注射針劑地塞米松14d,第43d后處死;第29d開始逍遙散組灌胃逍遙散、酮康唑組灌胃酮康唑組28d,正常組和模型對(duì)照組自由喂養(yǎng)。第57d后處死所有動(dòng)物。造模過(guò)程中,意外死亡及處死共18只大鼠,給藥過(guò)程中,無(wú)異常死亡。1.4cort、avp含量測(cè)定血漿CRH、ACTH、CORT、AVP放免試劑盒均由北京華英生物技術(shù)有限公司提供。采用放免法測(cè)定血漿CRH、ACTH、CORT、AVP含量,測(cè)定過(guò)程均嚴(yán)格要求按照提供試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作測(cè)量。具體步驟如下:分別在造模第1d、造模后第29d及給藥后第57d,上午9:00~12:00,將大鼠斷頭取血6mL左右,分別裝在加入肝素的EP管和普通管中。血液在冰浴試管中靜置0.5h,4℃3000r/min離心10min分離血漿,保存于-70℃冰箱待測(cè)。1.5儀器、儀器和檢測(cè)方法哺乳動(dòng)物手術(shù)器械(手術(shù)剪刀、鑷子、試管、量杯、量筒、12號(hào)圓頭灌胃針、5mL注射器等)、熱烘箱(HH.B11-500型)、電子天平(湖南儀器儀表總廠天平廠)、KDC-2044高速低溫冷凍離心儀(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)實(shí)業(yè)總公司中佳光電儀器分公司)、-90℃超低溫冰箱(三洋MDF-392,日本三洋電器株式會(huì)社)、GC-2012型γ放射免疫計(jì)數(shù)器(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)等。1.6大鼠、鼠籠、國(guó)家將大鼠在光線自然、安靜的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境里適應(yīng)性喂養(yǎng)適應(yīng)喂養(yǎng)7d,按文獻(xiàn)方法將10種刺激①禁食;②禁水;③晝夜顛倒;④冷水游泳;⑤熱烘;⑥夾尾;⑦電擊;⑧束縛;⑨傾斜鼠籠;⑩水平振蕩;隨機(jī)安排到28d內(nèi),1種/d,且相鄰2d不得重復(fù)1種刺激,每種刺激28d內(nèi)不超過(guò)4次,使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生。1.7動(dòng)物單次運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)自制敞箱為高45cm、底面邊長(zhǎng)為122cm,周壁和底面為黑色,且用白線將底面劃分為面積相等的16個(gè)正方形方格,將單只大鼠置于敞箱中央,以動(dòng)物穿越地面方格數(shù)作為水平運(yùn)動(dòng)得分(4爪均進(jìn)入的方格才計(jì)數(shù)、為1格,1格為1分,4爪中只要有1爪不在同一方格內(nèi)都不能計(jì)分);以直立次數(shù)為垂直活動(dòng)得分(兩前爪離開底面或攀附墻壁,直到兩爪均落地才算為一次垂直運(yùn)動(dòng),1次為1分),同時(shí)記錄大鼠洗臉及理毛次數(shù)(1次為1分)。每只動(dòng)物進(jìn)行1次測(cè)定,3min/次。評(píng)定時(shí)間分別在造模前、造模后和給藥治。1.8麥芽糖糖消耗實(shí)驗(yàn)用1%蔗糖水代替訓(xùn)練大鼠糖水喂養(yǎng),第4d禁水1d,第5d進(jìn)行糖水消耗實(shí)驗(yàn)。計(jì)算大鼠24h飲用1%蔗糖水劑量以及糖水消耗百分比值(糖水消耗量/糖水消耗量+飲用水消耗量)。1.9分析條件:單因素方差分析,正交試驗(yàn)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,結(jié)果用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1對(duì)大鼠體重、酮康唑模型的影響造模前,各組大鼠體重?zé)o顯著性差異(P>0.05);造模后,模型對(duì)照組、逍遙散組、酮康唑組和地塞米松組大鼠體重,與正常對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.01)。給藥后,逍遙散組、酮康唑組與正常對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.01),與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01);地塞米松組體重造模后體重增長(zhǎng)緩慢,與正常對(duì)照組比較有非常顯著性差異(P<0.01),與模型對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。2.2水平運(yùn)動(dòng)減少組模型造模前,各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分無(wú)顯著性差異(P>0.05);造模后,模型對(duì)照組、逍遙散組、酮康唑組、地塞米松組水平運(yùn)動(dòng)減少與正常對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.01);與模型對(duì)照組比較,無(wú)顯著性差異(P>0.05)。給藥后,逍遙散組、酮康唑組、地塞米松組與正常對(duì)照組比較,無(wú)顯著性差異(P>0.05),與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01);2.3對(duì)各模型對(duì)照組的比較造模前,各組大鼠垂直次數(shù)得分無(wú)顯著性差異(P>0.05);造模后,酮康唑組、地塞米松組大鼠垂直次數(shù)得分與正常對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.01);與模型對(duì)照組比較,無(wú)顯著性差異(P>0.05);逍遙散組與正常對(duì)照組比較,有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥后,逍遙散組、酮康唑組及地塞米松組與正常對(duì)照組比較,無(wú)顯著性差異(P>0.05),與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。2.4修飾次數(shù)評(píng)分造模前,各組大鼠修飾次數(shù)得分,除模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)之外,其它各組與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。造模后,模型對(duì)照組、逍遙散組、酮康唑組、地塞米松組大鼠修飾次數(shù)得分顯著降低,與正常對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.01)。給藥后,酮康唑組、地塞米松組和正常對(duì)照組比較,無(wú)顯著性差異(P>0.05),逍遙散組與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),逍遙散組、酮康唑組、地塞米松組與模型對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.01)。2.5兩組耗、地塞米松、模型對(duì)照組比較造模前,各組大鼠糖水消耗百分比無(wú)顯著性差異(P>0.05);造模后,模型對(duì)照組、酮康唑組大鼠糖水消耗與正常對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.01),逍遙散組、地塞米松組、模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);給藥后,模型對(duì)照組、地塞米松組,與正常對(duì)組比較有非常顯著性差異(P<0.01),逍遙散組、酮康唑組、正常對(duì)照組與模型對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.01)。2.6各組大鼠cort、acth、vap的比較地塞米松組與正常對(duì)照組比較,CRH有顯著性差異(P<0.01),模型對(duì)照組、逍遙散組和酮康唑組與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);酮康唑組、地塞米松組與模型對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.01),逍遙散組與模型對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較,CORT有非常顯著性差異(P<0.01);酮康唑組與模型對(duì)照組比較,CORT有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);地塞米松組、逍遙散組與模型對(duì)照組比較,CORT有非常顯著性差異(P<0.01)。模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較,ACTH有非常顯著性差異(P<0.01),地塞米松組與模型對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),逍遙散組、酮康唑組與模型對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.01)。模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較,AVP有顯著性差異(P<0.01);逍遙散組、酮康唑組、地塞米松組與模型對(duì)照組比較,AVP有非常顯著性差異(P<0.01)。3討論3.1不同模型的比較肝郁脾虛證是臨床上最常見的證型,有人統(tǒng)計(jì)五臟證候中肝郁證候占41.9%,因此,肝郁脾虛證動(dòng)物模型的研制成為近20年的熱點(diǎn)。先后有四氯化碳(CCl4)注射法、飲食偏嗜與CCl4注射結(jié)合造模、艾葉注射法、腎上腺皮下注射法、夾尾激怒模型、模具激怒模型、束縛捆綁模型、夾尾激怒合苦寒瀉下法、限食限動(dòng)加醋酸結(jié)腸內(nèi)注射法、慢性束縛應(yīng)激方法、慢性束縛+飲食失節(jié)+過(guò)度疲勞的復(fù)合因素復(fù)制法?？v觀以上回顧性研究發(fā)現(xiàn),肝郁脾虛證模型復(fù)制約有10余種,但是存在著明顯的認(rèn)識(shí)誤區(qū)、曲解或缺陷。首先,利用藥物毒性作用復(fù)制模型是建立在解剖器官“肝”等同于中醫(yī)“肝”這樣的假設(shè)基礎(chǔ)上,把肝細(xì)胞的實(shí)質(zhì)損害等同于肝郁脾虛證;其二,用物理機(jī)械刺激方法激怒大鼠顯然容易模擬,可是人類通常是受到社會(huì)、心理、生活等負(fù)性事件的激怒,有質(zhì)的不同和區(qū)別;其三,用束縛方法捆綁大鼠肢體限制運(yùn)動(dòng),不能模擬人類精神活動(dòng)受到限制的狀態(tài);其四,在對(duì)模型進(jìn)行藥物驗(yàn)證評(píng)價(jià)或干預(yù)時(shí),采用的方劑或藥物差異甚遠(yuǎn),使模型的效度和信度大為降低。應(yīng)該說(shuō)這些方法只是部分地模擬了人類肝郁脾虛證的發(fā)病機(jī)理和癥狀特征,不能準(zhǔn)確和真實(shí)地模擬肝郁脾虛證患者真實(shí)生活中所面臨的各種“困難”,產(chǎn)生“痛苦”、“無(wú)助”、“絕望”“情緒低落”等特征,與肝郁脾虛證發(fā)病機(jī)理不完全相符。3.2傳統(tǒng)模型的局限性肝郁脾虛證具有中醫(yī)學(xué)所有證候的共同特征,心身合一性、多靶點(diǎn)性、非全實(shí)質(zhì)性等,有病因、發(fā)病、病位、病性、體質(zhì)以及正邪博弈等多個(gè)自變量或因變量?，F(xiàn)代研究認(rèn)為,肝郁脾虛證是在負(fù)性生活事件的刺激下,以解決問題困難、情緒低落、悲觀絕望、焦慮恐懼為特點(diǎn),出現(xiàn)高級(jí)中樞神經(jīng)紊亂為前提,涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫、循環(huán)、血液、消化、運(yùn)動(dòng)等多系統(tǒng)的損害,因而臨床表現(xiàn)具有多樣性、差異性和個(gè)體化傾向。在人類與動(dòng)物的比附和中醫(yī)與西醫(yī)的關(guān)系中,這些因素使得在模型復(fù)制的過(guò)程中難以完全從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的理念直接獲得借鑒和引用,復(fù)制的難度可想而知。深刻領(lǐng)悟證候概念折射著中醫(yī)思維方式的特征,是解決肝郁脾虛癥候模型的前提,以不斷創(chuàng)新的造模方法來(lái)最大限度地模擬肝郁脾虛證候都屬于外延式的發(fā)展方式,忽視了概念內(nèi)涵式的發(fā)展方向,自然使地得分模型遠(yuǎn)離了肝郁脾虛證的本質(zhì)特征,因而很難建立起公允的動(dòng)物疾病模型或模型體系。肝郁脾虛癥候模型所面臨的難點(diǎn)是所有疾病模型的共性。但是,實(shí)驗(yàn)發(fā)展證明這些困難是非根本性的,復(fù)制肝郁脾虛癥候模型是可行的。3.3crh、cort和hpa軸抑制劑參與的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果肝郁脾虛證發(fā)病重要機(jī)制之一與HPA軸功能亢進(jìn)高度相關(guān)。持續(xù)的應(yīng)激使體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的糖皮質(zhì)激素(GC),它與海馬內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合后,損傷海馬及藍(lán)斑等處,從而使肝郁脾虛證癥患者發(fā)生情緒低落、興趣喪失、絕望無(wú)助、困倦乏力等等癥狀;另一方面,海馬作為情緒整合和學(xué)習(xí)記憶的高級(jí)中樞,容易發(fā)生認(rèn)知障礙、睡眠障礙等。肝郁脾虛證持續(xù)的應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致海馬神經(jīng)元萎縮、凋亡及神經(jīng)再生減少等一系列的可塑性損傷,使其對(duì)HPA軸的抑制作用減弱。同時(shí),患者存在GR數(shù)量和功能的下調(diào),造成GC對(duì)HPA軸負(fù)反饋?zhàn)饔脺p弱,使其功能更為亢進(jìn),而形成惡性循環(huán)。實(shí)驗(yàn)研究表明,模型對(duì)照組與正常對(duì)照組、逍遙散組、酮康唑組地塞米松組比較,CRH顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義或顯著性差異(P<0.05,P<0.01);模型對(duì)照組與正常對(duì)照組、逍遙散組、酮康唑組、地塞米松組比較,CORT顯著升高,有顯著性差異(P<0.01)。同時(shí),模型對(duì)照組與正常對(duì)照組、逍遙散組、酮康唑組和地塞米松組比較,ACTH含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義或有非常顯著性差異(P<0.05,P<0.01);模型對(duì)照組與正常對(duì)照組、逍遙散組、酮康唑組和地塞米松組比較,AVP含量降低,有顯著性差異(P<0.01)。肝郁脾虛證的基本反應(yīng)之一為下丘腦-垂體-腎上腺軸的強(qiáng)烈興奮。因?yàn)閰⑴cHPA軸調(diào)節(jié)主要激素有CRH和,CRH分泌增加,必然導(dǎo)致ACTH、CORT和HPA軸功能亢進(jìn);再者,丘腦AVP分泌減少,直接導(dǎo)致中樞對(duì)HPA軸的抑制減退。逍遙散是治療肝郁脾虛證的經(jīng)典方劑。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型大鼠經(jīng)逍遙散治療后,CORT、ACTH、CRH都有改善(P<0.05,P<0.01),AVP明顯增加(P<0.01)。根據(jù)以方驗(yàn)證推理,此模型接近肝郁脾虛證候,說(shuō)明拮抗HPA軸是逍遙散重要藥效學(xué)機(jī)理之一。3.4肝郁質(zhì)的量化評(píng)價(jià)復(fù)合多因素方法建立在慢性心理、生物和物理等綜合因素中強(qiáng)度應(yīng)激刺激模型的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái),復(fù)合多因素模型方法是使用隨機(jī)安排的各種刺激模擬了人類抑郁癥真實(shí)生活中面臨各種“刺激”、“困難”、“壓力”、“打擊”等,而且無(wú)法應(yīng)對(duì)或解決,