檸檬苦素體外吸收機制的研究

檸檬苦素體外吸收機制的研究

序言（lm，圖1）主要出現(xiàn)在各種花卉植物中。這是一種含有糊精素和高度氧化的三氟化合物。具有抗菌、抗癌、厭食癥、抗炎、抗癌等活性。研究表明,LM是二甲基苯并蒽致癌的有效抑制劑。長期研究發(fā)現(xiàn)給予LM后能顯著降低結(jié)腸癌的發(fā)病率。此外,還有研究證明LM可以抑制嚙齒類動物的口腔、胃腸道、肺部以及皮膚部位的癌細(xì)胞。但LM的口服生物利用度很低,溶解度也較低,約為0.3μg·mL-1。LM在腸道內(nèi)的滲透性和吸收機制至今鮮有研究報道。本文通過原位腸灌流法和體外人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)法,研究LM的腸滲透性與吸收機制,初步闡明其口服生物利用度低的原因。其中,大鼠原位腸吸收實驗保持了動物完整的血液循環(huán)、神經(jīng)系統(tǒng)和代謝功能,且能精確控制實驗的濃度、流速、pH值、滲透壓和吸收范圍等因素,成為研究藥物吸收的最常用的在體方法之一。而完全分化的Caco-2與正常腸細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征極為相似,藥物透過Caco-2單層細(xì)胞的滲透特征與人小腸黏膜滲透特征密切相關(guān),因此Caco-2細(xì)胞已成為預(yù)測藥物口服吸收的一種良好的體外方法。外排轉(zhuǎn)運與藥物進(jìn)入上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運相反,是影響藥物吸收和生物利用度的重要因素。細(xì)胞膜表面的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)以及多藥耐藥蛋白(multidrug-resistanceprotein,MRP)均屬于糖基化膜蛋白即ABC(ATP-bindingcassette)轉(zhuǎn)運器家族成員,在多種上皮細(xì)胞高度表達(dá),故認(rèn)為P-gp和MRP在藥物吸收中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞色素P4503A4(CYP3A4)是腸細(xì)胞富含的代謝酶,由其產(chǎn)生的腸屏障是口服藥物生物利用度的主要決定因素。本實驗通過使用P-gp、MRP和CYP3A4各自的抑制劑對LM的吸收機制進(jìn)行研究。準(zhǔn)確度、精密度、回收率、細(xì)胞培養(yǎng)及材料在腸灌流中的添加量的確定試劑與藥品檸檬苦素(純度>95%,由浙江臺州波美樂科技有限公司饋贈);DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);新生小牛血清(Sigma公司);胰蛋白酶、維拉帕米、丙磺舒、酮康唑和考馬斯亮藍(lán)G2250(Amresco公司)。動物雄性Wistar大鼠,體重160~180g,購于南京醫(yī)科大學(xué)。細(xì)胞Caco-2cells(HTB37)購于AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MD。溶液的配制灌流液的配制方法:先將一定量的LM超聲溶解在10mL的二甲基亞砜(DMSO)中,用Krebs-Ringer(K-R)緩沖液緩慢稀釋至100mL;再取1mL,使溶液中的DMSO終濃度為1%,加入0.05%的維生素C作為抗氧劑,以穩(wěn)定灌流液。檸檬苦素的含量測定采用HPLC方法,具體條件:LC-10ATvp高效液相色譜儀(Shimadzu,日本):泵(ModelLC-10A),色譜柱(漢邦C18柱,150mm×6.0mm,i.d.),紫外檢測器(ModelSPD-10A),檢測波長為220nm,流動相為乙腈和雙蒸水(50∶50),流速為1mL·min-1,進(jìn)樣體積20μL,相對保留時間在10.3min左右。該方法精密度RSD低于3.77%,回收率在96.57%~102.5%,線性關(guān)系良好(r2=0.9999),線性范圍為0.4~20μg·mL-1。大鼠原位腸灌流實驗大鼠禁食(不禁水)20h后麻醉,放在加熱板上,打開加熱燈,維持其正常體溫。手術(shù)打開大鼠腹部,小心分離出待考察的腸段,即十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸,每段取約10cm,于兩端切口插管,結(jié)扎,用預(yù)熱至37℃生理鹽水沖洗干凈。開始時,用pH7.4K-R緩沖液以2mL·min-1的速度在待考察的小腸段灌流30min,使水分吸收達(dá)到平衡。之后用初始濃度為C0、保持37℃恒溫的藥液,以1mL·min-1的速度進(jìn)行灌流。當(dāng)LM到達(dá)所選腸段末端部位流出第1滴藥液時,記錄相應(yīng)的時間(t0),每隔20min取樣本1mL檢測,并及時補充K-R緩沖液1mL。每次實驗持續(xù)120min,收集的流出樣品在5000×g下離心10min,取上清液進(jìn)樣,HPLC測定含量。實驗結(jié)束后,排空腸段,測量循環(huán)液的體積,將體積減少量平均分配至每個時間段,得各個時間段的平均吸水量。根據(jù)平均吸水量,計算出各時間點循環(huán)液的體積(Vt),進(jìn)而計算出各個時間點LM的剩余量,以剩余藥量的對數(shù)(lnX)和取樣時間(t)作圖,求出表觀吸收常數(shù)(Ka)和半衰期(t1/2)等參數(shù)。藥物在腸內(nèi)的每小時吸收百分?jǐn)?shù)(P):P%=(C0×V0-Ct×Vt)/(C0×V0×t)×100%。細(xì)胞培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)在T275組織培養(yǎng)瓶中,含15%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在含5%CO2的37℃的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長狀態(tài),將生長至80%~90%細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液棄去,用0.25%胰酶溶液浸潤2~3min,加入含有小牛血清的DMEM培養(yǎng)基停止消化,吹打細(xì)胞成懸液。然后接種在24孔板上,接種細(xì)胞數(shù)為105/cm2,待細(xì)胞單層膜鋪滿后開始實驗。Caco-2細(xì)胞吸收實驗實驗開始前2h棄去培養(yǎng)液,用1mL37℃PBS沖洗3次,除去細(xì)胞表面的雜質(zhì),37℃下孵化10min,輕輕吸干PBS,然后每孔加入300μmol·L-1LM0.5mL,37℃下培養(yǎng)細(xì)胞,分別在10、30、60、90、120和150min后傾出藥物,細(xì)胞用4℃PBS清洗3次,然后每孔加入雙蒸水1mL。在-30℃下持續(xù)冷凍15min,之后在50℃下加熱2min,如此循環(huán)重復(fù)3次,吹打細(xì)胞,取細(xì)胞懸液0.25mL,加入0.25mL乙腈以沉淀蛋白,離心后HPLC檢測LM濃度。另取細(xì)胞懸液0.4mL,用考馬斯亮藍(lán)法定量蛋白。LM的吸收以每毫克蛋白所吸收的藥量確定。其中HPLC的測定條件同前所述,空白細(xì)胞懸液對含量測定無干擾,LM保留時間基本不變。在空白細(xì)胞中加入不同濃度的藥物,如上法操作,所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好(r2=0.9985),回收率大于96%,精密度RSD低于4.0%,方法可靠。通過攝取含量-時間曲線,確定藥物的最大吸收時間,同樣方法測定LM的給藥濃度在50~500μmol·L-1內(nèi)變化的濃度-攝取曲線。之后,分別預(yù)先加入3種抑制劑,維拉帕米(P-gp抑制劑)、丙磺舒(MRP抑制劑)、酮康唑(CYP3A4抑制劑)作用60min,再加入LM,考察影響LM吸收的機制。數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)都以x±s表示,用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果1吸收速率及吸收百分率測定LM的質(zhì)量濃度分別為4.0、8.0、12.0μg·mL-1,大鼠吸收速率常數(shù)(Ka)及每小時吸收百分率(P)的測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明,濃度對LM的吸收沒有顯著性影響,說明LM的吸收途徑不是單純擴散。2收情況分析8.0μg·mL-1LM在不同腸段的吸收情況見表2。結(jié)果表明,LM在4個腸段(十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸)的Ka和P值均沒有顯著性差異,LM在整個腸段都有吸收。3lm的時間-攝食時間及峰濃度用300μmol·L-1LM與Caco-2細(xì)胞進(jìn)行孵育,在不同時間細(xì)胞內(nèi)LM的含量測定結(jié)果見圖2。由圖2可見,LM的時間-攝取曲線隨時間延長,細(xì)胞內(nèi)攝取量先增大、后減少。曲線在90min時達(dá)到峰頂,其峰濃度為(13.8±3.17)μmol·g-1(protein)。90min前攝取量和時間基本呈正比,近似一級吸收,90min后攝取量下降,可能是由于細(xì)胞的外排。4細(xì)胞內(nèi)藥物濃度不同濃度的LM(50~500μmol·L-1)在37℃下與Caco-2細(xì)胞孵育90min,細(xì)胞內(nèi)藥物含量如圖3所示。隨著LM濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度也增加,當(dāng)給藥濃度大于300μmol·L-1后,LM的吸收達(dá)到穩(wěn)態(tài)最大吸收濃度,存在飽和現(xiàn)象。這進(jìn)一步驗證了LM的吸收不是單純擴散,可能為促進(jìn)擴散。5細(xì)胞內(nèi)累積藥物Caco-2細(xì)胞分別在37℃下不同濃度的維拉帕米、丙磺舒和酮康唑溶液內(nèi)預(yù)孵化60min,然后加入300μmol·L-1LM溶液,孵育90min,細(xì)胞內(nèi)的累積藥物濃度如表3所示?？梢钥闯?維拉帕米和酮康唑能夠顯著提高LM在Caco-2細(xì)胞的吸收,呈劑量依賴性,而丙磺舒的效果不明顯。結(jié)果表明,LM的吸收主要受到P-gp和CYP3A4的調(diào)節(jié),而與MRP調(diào)節(jié)的藥物轉(zhuǎn)運無關(guān)。檸檬苦素的吸收本實驗采用平均吸水量法測定各時間段腸段的吸水量,避免了酚紅在循環(huán)液中褪色導(dǎo)致的測量不準(zhǔn)確。通過原位腸灌流實驗,發(fā)現(xiàn)檸檬苦素的腸吸收極低,可能不是簡單的被動擴散方式。檸檬苦素在十二指腸、結(jié)腸、回腸和盲腸的吸收速率常數(shù)Ka和P值沒有顯著性差異,說明檸檬苦素在腸段的吸收沒有明顯的部位靶向性。Caco-2細(xì)胞的實驗結(jié)果證實了檸檬苦素的吸收有飽和現(xiàn)象,因此其吸收機制可能為促進(jìn)擴散。進(jìn)一步的實驗證明維拉帕米和酮康唑能夠以劑量依賴的方式顯著提高檸檬苦素的吸收,而丙磺舒對檸檬苦素吸收的改善效果不明顯,說明檸檬苦素的吸收主要受P-gp和CYP3A4的調(diào)節(jié),而與MRP調(diào)節(jié)的藥物轉(zhuǎn)運無關(guān)