微生物對發(fā)酵型乳粉質(zhì)構(gòu)形成的影響

微生物對發(fā)酵型乳粉質(zhì)構(gòu)形成的影響

生物技術(shù)在食品行業(yè)中的應(yīng)用代表了各種酶劑的應(yīng)用。在所有的工業(yè)用酶中,蛋白酶是用量最大,應(yīng)用最廣的一種,約占整個酶制劑產(chǎn)量的60%以上。蛋白酶種類多,來源廣,一般依據(jù)其來源將它分為:動物蛋白酶,植物蛋白酶和微生物蛋白酶3種類型。由于微生物具有資源廣泛,生長繁殖快,培養(yǎng)方法簡單,可利用廉價原料通過發(fā)酵進行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn),并且便于自動化控制等諸多優(yōu)點,已使得微生物蛋白酶逐漸取代其他來源的蛋白酶,成為酶制劑工業(yè)的支柱產(chǎn)品之一。腐乳是我國獨具民族特色的大豆發(fā)酵食品,具有獨特的風味,蛋白質(zhì)含量極其豐富,且不含膽固醇,是一種質(zhì)構(gòu)頗似軟干酪的植物蛋白食品。腐乳生產(chǎn)過程中色、香、味、體的形成都與微生物的作用密切相關(guān)。本文概述了腐乳生產(chǎn)用主要出發(fā)菌株產(chǎn)蛋白酶的酶學性質(zhì),并綜述了微生物蛋白酶在腐乳生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進展。1毛霉紅乳酸發(fā)酵過程腐乳根據(jù)其菌種類型可以分為毛霉腐乳、根霉腐乳、細菌腐乳以及無菌腐乳等,常用于腐乳生產(chǎn)的微生物有毛霉、根霉、米曲霉、酵母菌、紅曲霉及細菌等[3～6]。腐乳的品質(zhì)評價主要根據(jù)色、香、味、體及其他一些主要的營養(yǎng)指標。腐乳的釀造過程是幾種微生物及其所產(chǎn)生的酶的不斷作用的過程,整個過程分為前期培菌和后期發(fā)酵,前酵是培菌的過程,是菌種在白坯上生長代謝、分泌酶類,同時生成的菌絲體使坯體包裹成型、蛋白質(zhì)部分降解成水溶性蛋白質(zhì)的過程;后酵則是坯體中蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)在前酵中分泌的酶系與后酵時加入的湯料中的微生物和化學物質(zhì)的協(xié)同參與下降解與酯化成香的過程。經(jīng)過發(fā)酵后熟,腐乳形成了特有的色、香、味、體,細嫩柔糯、富有營養(yǎng)。腐乳白坯經(jīng)過前期培菌成為毛坯,毛坯加鹽腌制成為鹽坯,鹽坯裝瓶、加入湯料后,即進入了后酵。后酵是大分子物質(zhì)降解與酯化成香的主要過程,在此期間,蛋白質(zhì)的水解程度被認為是影響腐乳風味、質(zhì)地的主要因素。毛霉紅腐乳蛋白質(zhì)的SDS分析表明:由于受微生物分泌的蛋白酶的作用,無論在腐乳湯汁中,還是在腐乳表層和腐乳塊中,都不存在完整的大豆蛋白質(zhì),大豆蛋白已經(jīng)水解為分子量較小的肽類等。這說明,在微生物蛋白酶的作用下,腐乳坯中大豆蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞,豆腐坯變的柔嫩、充滿鮮味,組分易于消化吸收,營養(yǎng)效價大大增長。腐乳發(fā)酵成熟后,小分子短肽約占腐乳水溶液部分總氮量的86.4%～88.9%,并與腐乳的鮮味有密切關(guān)系。2交易中的蛋白質(zhì)應(yīng)如何處理從腐乳的生產(chǎn)工藝中可以知道,發(fā)酵是腐乳生產(chǎn)的重要部分,酶在發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用,可以說,沒有酶的作用就沒有腐乳的生成。當白坯被接種后,孢子開始了生長繁殖,生成菌絲,并產(chǎn)酶、分泌以蛋白酶為主的酶系。隨著酶系的分泌,豆腐坯中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)開始被水解。蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物是水溶性蛋白,到培菌結(jié)束時,豆腐坯中的水溶性蛋白質(zhì)由原來的3.61%上升到55.54%。由于所分泌的蛋白酶有酸性、中性和堿性之分,作用范圍較寬(堿性蛋白酶為pH5～10,中性蛋白酶為pH4～10,酸性蛋白酶為pH1～6.3),而腐乳的pH通常維持在5～6,因此腐乳蛋白質(zhì)的降解是各種蛋白酶共同作用的結(jié)果。值得注意的是,酶解產(chǎn)物的保存和濃縮方法對分子量的測定會產(chǎn)生影響,冷凍干燥后的酶解產(chǎn)物應(yīng)溶解在10mM的亞硫酸鈉溶液中并于室溫中放置一段時間后在經(jīng)質(zhì)譜儀測定其分子量。大豆蛋白中含有較多的-SH,在冷凍干燥時極易氧化形成二硫鍵而聚合,從而使酶解產(chǎn)物的分子量增大,當加入還原劑亞硫酸鈉后,二硫鍵被破壞重新生成-SH,酶解產(chǎn)物之間的交聯(lián)作用解體,此時測定的分子量才是真實的。毛霉蛋白酶酶系中含有酸性、中性及堿性蛋白酶,其中以中性及堿性蛋白酶為主。各種蛋白酶作用的pH范圍較寬,酸性蛋白酶pH1.0～6.3,中性蛋白酶pH4～10,堿性蛋白酶pH5以上。在腐乳成熟的整個過程中,其pH通常在5.0～6.0之間,因此腐乳中的多肽是多種蛋白酶協(xié)同作用的結(jié)果。中性蛋白酶是金屬蛋白酶,堿性蛋白酶則是絲氨酸蛋白酶,如果加入一定量的乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA鈉鹽),檢測出來的即是堿性蛋白酶的活力。經(jīng)測定,在pH7.3時,其酶活力(濃酶液)為280U/ml,加入一定量的EDTA二鈉后測定其酶活力(濃酶液)為105U/ml,可見在中性條件下堿性蛋白酶能夠表現(xiàn)出很強的酶活力。毛霉分泌的蛋白酶的酶活力比其它發(fā)酵微生物弱,通常只有其它常用霉菌酶活力的1/10,其中性蛋白酶活力最高僅為65.52單位/g(絕干基計),采用毛霉蛋白酶催化大豆分離蛋白水解,實際上是中性、堿性蛋白酶共同作用的結(jié)果,由于有一種以上的酶的作用,使得酶解產(chǎn)物種類非常豐富。酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量在1～3kD之間,平均相對分子質(zhì)量為2kD(1D=1.66×10-27kg)。以毛霉蛋白酶水解大豆分離蛋白得到的大豆多肽產(chǎn)品沒有苦澀味,微咸,后味略鮮,只要將水解條件控制好,完全可以得到風味優(yōu)良的大豆肽產(chǎn)品?？梢?毛霉作為腐乳發(fā)酵的生產(chǎn)菌株,所產(chǎn)蛋白酶有其優(yōu)良特性,值得進一步研究它在腐乳后酵過程中的作用。3菌種的多樣性目前,在腐乳的釀造過程中,大多采用毛霉或米根霉、華根霉等?，F(xiàn)行生產(chǎn)中常用的菌種絕大多數(shù)為毛霉菌,主要有五通橋毛霉(AS—3.25M.wutungkiao)、腐乳毛霉(Mucorsufu)和雅致放射毛霉(AS—3.27Acinomucorelegans)。與其它霉菌相比,毛霉不易產(chǎn)生孢子,且孢子量少,在制備菌種時工藝較復雜,要得到優(yōu)良菌種相對困難;同時,毛霉的耐溫性較差,最適生長溫度為15～25℃,30℃以上生長困難,35℃以上不生長甚至死亡,使許多腐乳廠不得不在夏季停產(chǎn),從而帶來管理上的不便和經(jīng)濟上的損失,因此,選育耐高溫、生長快、酶活力高的菌種一直是生產(chǎn)用菌種篩選的主要目標。但由于其它酶的種類有限,不利于腐乳鮮美風味的形成。為此,多年來酶系的多樣化與酶活的高低一直是腐乳生產(chǎn)用菌種的主要篩選目標之一;人們也在不停的探索多菌種釀制腐乳的生產(chǎn)工藝,期望由多菌種分泌的酶的共同催化作用,可以加快坯體中蛋白質(zhì)、淀粉質(zhì)和纖維素的分解與風味物質(zhì)的合成,從而大大縮短腐乳生產(chǎn)周期。韓北忠等將印尼傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品丹貝中應(yīng)用的少孢根霉(Rhizopus.oligoporus)(LU573)試驗用于發(fā)酵腐乳,結(jié)果發(fā)現(xiàn),將此耐高溫、活力高且生長快的少孢根霉用于夏季高溫時的腐乳生產(chǎn),不僅可以不受季節(jié)限制、改善產(chǎn)品風味、而且可縮短生產(chǎn)周期,便于現(xiàn)代化生產(chǎn)。此外,該菌可大量不斷的分泌脂肪分解酶、植酸酶和β-葡萄糖苷酶,可使最終產(chǎn)品中的游離氨基酸、水溶性固形物、不飽和脂肪酸含量顯著提高,更值得一提的是該菌分泌的β-葡萄糖苷酶能分解大豆原料中的異黃酮苷成為異黃酮甙元,而異黃酮甙元又具有多種生物活性包括抗菌活性、抗氧化、抗癌活性等,因此又可賦予產(chǎn)品新的保健內(nèi)涵。少孢根霉(R.oligodporus)具有較穩(wěn)定的生產(chǎn)性能,在固體培養(yǎng)基上的最適生長條件是40℃,培養(yǎng)基Aw=0.99及氣體為空氣組成。該少孢根霉在30～40℃均能很好的生長,受溫度變化的影響較小。對雅致放射毛霉,臺灣放射毛霉和少孢根霉在35℃條件下產(chǎn)蛋白酶活力的高低進行比較,通過毛坯的生長情況可看出:少孢根霉生長良好,尤其在90%～95%的濕度下;而臺灣放射毛霉則生長緩慢,而且到36h細菌的生長占優(yōu)勢,毛坯手感發(fā)粘;用雅致放射毛霉接種的白坯生長也很緩慢,菌絲1～2mm,稀落,24h后基本沒有明顯的生長,且雜菌生長占優(yōu)勢。與之對應(yīng),少孢根霉的蛋白酶活力很高,而臺灣放射毛霉和雅致放射毛霉的蛋白酶活力基本沒有太大的變化。因此在夏季高溫生產(chǎn)中可應(yīng)用少孢根霉,利用它所產(chǎn)的蛋白酶水解大豆蛋白。研究表明,該菌種發(fā)酵生產(chǎn)的腐乳樣品質(zhì)地更加疏松,入口細膩,咸淡適口,香氣濃郁,符合消費者對新口味的要求。4關(guān)于腐敗現(xiàn)象主要生產(chǎn)植物的生產(chǎn)條件的研究由微生物發(fā)酵所產(chǎn)的蛋白酶的活性決定了豆腐乳的品質(zhì)與風味,不同的菌種其產(chǎn)酶條件及酶的性質(zhì)均存在著較大的差異。4.1最佳產(chǎn)酶條件的確定毛霉M—9105是釀造豆腐乳的優(yōu)良菌株,王磊等人對其產(chǎn)蛋白酶條件的研究表明:培養(yǎng)溫度對毛霉M—9105產(chǎn)蛋白酶的影響為隨著溫度的升高,所分泌的蛋白酶也較高,但溫度到達35℃酶活力反而下降,其原因是因為在毛霉生長的溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高,菌體生長較快,但溫度超過35℃毛霉菌生長則受影響,菌體生長的優(yōu)劣直接影響產(chǎn)酶量,毛霉M—9105最適產(chǎn)酶溫度為25～35℃。在15℃～20℃隨著培養(yǎng)時間的延長,同樣也可以達到最高酶活。培養(yǎng)時間與產(chǎn)酶活力的關(guān)系為:毛霉M—9105培養(yǎng)24h以后酶活力直線上升,當培養(yǎng)至48h其相對酶活力達96.6%,可見豆腐坯在30℃左右接種后,發(fā)酵48h較為適宜,以后繼續(xù)培養(yǎng)雖然酶活仍有上升,但上升不多,而且還要占用器具,消耗能源。同時,60h毛霉M—9105已產(chǎn)生較多孢子,酶活雖高,但以后會影響豆腐乳的口感,產(chǎn)生苦澀味。培養(yǎng)基pH對產(chǎn)酶活力的影響用0.1NHCl和0.1NNaOH溶液分別調(diào)節(jié)固體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值,接種毛霉M—9105后置30℃培養(yǎng)48h后測定酶活力,結(jié)果為適宜的pH范圍為5～6.5之間,過高或過低均影響酶活力。由此得到毛霉M—9105的最佳產(chǎn)酶條件為溫度30℃左右,時間48h,pH為6左右,培養(yǎng)基含水量66.7%,其產(chǎn)酶量可達954單位/g,并在此條件下利用毛霉M-9105進行多次發(fā)酵豆腐坯的試驗,將生好霉的豆腐坯腌制裝瓶后于30℃放置半月后測氨基酸態(tài)氮,含量達(0.8g/100g)以上。生產(chǎn)的腐乳味道鮮美、質(zhì)地細膩,后味綿長。4.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對纖維素原料產(chǎn)酶的影響鄧芳席等的研究表明:以毛霉M-263為出發(fā)菌株,經(jīng)紫外線、γ-射線及高溫處理復合誘變,并采用高溫培養(yǎng)條件定向馴化,獲得了耐高溫毛霉菌株M263-3。該菌株在32℃條件下,生長正常,釀制的腐乳質(zhì)量優(yōu)良,進行了培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件試驗得到了最佳培養(yǎng)基及適宜的培養(yǎng)條件。試驗驗證了該菌株在生產(chǎn)中的適應(yīng)性,結(jié)果表明,耐熱毛霉M263-3的中性蛋白酶活力較馴化前毛霉M263有所下降,但酸性及堿性蛋白酶的變化不大,這說明經(jīng)過耐熱馴化的毛霉菌株,基本上保持了馴化前的產(chǎn)酶能力。產(chǎn)酶條件試驗結(jié)果表明,豆餅粉添加量是影響酶活力的主要因素,其次是培養(yǎng)時間及葡萄糖添加量,麩皮用量無明顯影響。產(chǎn)酶最適條件為:250ml三角瓶裝入麩皮15g,加入1%的豆餅粉,1%的葡萄糖,水17ml,培養(yǎng)4d,中性蛋白酶活力為830μg/min。4.3發(fā)酵液體毛霉種的制備雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)AS3.2278是我國腐乳生產(chǎn)所用的優(yōu)良菌株,它對腐乳獨特風味的形成具有重要的作用。但是國內(nèi)外對它的研究除菌種選育及固體培養(yǎng)條件下生理特征等內(nèi)容外,其他方面報道很少,將液體毛霉菌種應(yīng)用于腐乳生產(chǎn)上的研究還是空白。為了改進腐乳生產(chǎn)中菌種制作的傳統(tǒng)工藝,將現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)應(yīng)用于腐乳生產(chǎn),以進一步實現(xiàn)腐乳生產(chǎn)工藝的自動化、規(guī)?；?提高腐乳產(chǎn)品的質(zhì)量,對毛霉AS3.2778的進行了液體深層培養(yǎng)和工業(yè)規(guī)模發(fā)酵液體毛霉菌種及其在腐乳生產(chǎn)上應(yīng)用的研究。結(jié)果表明,其適宜碳源為飴糖和可溶性淀粉,適宜的氮源為黃豆粉和酵母膏,最適培養(yǎng)基含黃豆粉3%,飴糖0.5%,磷酸二氫鉀0.2%,硫酸鎂0.2%,酵母膏0.1%,在28℃,接種量5%,發(fā)酵前期通風量1:0.8,之后將風量調(diào)至1:1.5～2.0,全程不攪拌培養(yǎng)18～20h,雅致放射毛霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)可良好實現(xiàn)。生物量為每100ml發(fā)酵液中菌絲鮮重達30g以上,菌絲體氨基酸含量為46.1mg/100ml。檢驗合格的發(fā)酵液作為液體菌種完全可以取代傳統(tǒng)工藝,并在生產(chǎn)上得到很好的應(yīng)用。用通用式罐發(fā)酵時,選擇不開攪拌,而采用大通風量的方法,以避免攪拌器的剪切對菌絲體生長的破壞作用。曾在100L的發(fā)酵罐試驗時,前12h未開攪拌,菌體生長極好,但當12h開攪拌后,菌體濃度反而下降。這一方面可能由于攪拌器對菌體強烈的剪切作用,另一方面也由于開攪拌后,溶解氧的急劇上升,過早促進了菌體產(chǎn)生代謝物質(zhì),制約了菌體的生長。在絲狀真菌的培養(yǎng)中,氣升式發(fā)酵罐越來越受到重視,氣升式發(fā)酵罐是利用氣體的噴射動能和液體的重度差造成氣液循環(huán)流動,從而實現(xiàn)發(fā)酵液的攪拌、混合和溶氧。與機械攪拌發(fā)酵罐相比,氣升式發(fā)酵罐具有結(jié)構(gòu)簡單、加工安裝方便、密封性能好、雜菌污染機會小、氧傳質(zhì)效率高、功率消耗低等特點,且對微生物沒有剪切破壞作用。由于毛霉的菌體濃度是很高的,而且普遍呈絲狀或較為疏松的菌球,當菌體濃度積累到一定程度時,溶解氧嚴重不足,使得毛霉的繼續(xù)培養(yǎng)較為困難,生物量增長減慢,而氣升式罐正有利于這種極高濃度的絲狀真菌的發(fā)酵,很值得進一步深入研究。5菌種的選擇、發(fā)酵腐乳作為我國傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品,以前一般采用自然接種發(fā)酵,作用菌種豐富,風味也比較美好,但是生產(chǎn)周期太長,并且由于空氣中有各種其他的菌,其中的一些菌(如青霉)在豆腐坯上生長時甚至會產(chǎn)生有毒物質(zhì),包括一些致癌物,其安全性也越來越受到關(guān)注。從實踐經(jīng)驗和目前國內(nèi)外的研究結(jié)果來看,菌種對產(chǎn)品的品質(zhì)有很大的影響,其中以混合菌種生產(chǎn)的產(chǎn)品效果最佳。從營養(yǎng)成分來看,由于所使用的毛霉菌種的蛋白質(zhì)酶活性比較高,而所用根霉的淀粉酶活性較強,所以單一菌種生產(chǎn)的產(chǎn)品中氨基酸含量與還原糖含量存在較大的差別,而混合菌種生產(chǎn)的產(chǎn)品中的氨基酸和還原糖都比較高。因此實際生產(chǎn)過程中,以選用優(yōu)化酶活組合的混合菌種來進行發(fā)酵比較適當。單一菌種生產(chǎn)出來的產(chǎn)品,其風味也比不上多菌種的發(fā)酵產(chǎn)品。而且,采用多菌